袁瑞軍 唐楊烽 劉曉紅 袁 揚 王國坤 韓 林
·基礎(chǔ)研究·
轉(zhuǎn)錄因子SP1調(diào)控血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化在主動脈夾層發(fā)病中的作用
袁瑞軍 唐楊烽 劉曉紅 袁 揚 王國坤 韓 林
目的:探討轉(zhuǎn)錄因子SP1在主動脈夾層組織中的表達情況及與主動脈夾層血管平滑肌細胞(VSMC)表型轉(zhuǎn)化的關(guān)系。 方法:收集人主動脈夾層血管壁組織(n=10)及正常主動脈壁組織(n=4),分別采用RT-PCR和Western blot檢測主動脈壁組織中SP1和收縮型VSMC表型標(biāo)志物SM22α的mRNA和蛋白表達水平;體外培養(yǎng)正常人主動脈平滑肌細胞(HA-VSMC),以轉(zhuǎn)染SP1過表達腺病毒(Ad-SP1)的HA-VSMC為Ad-SP1組,以轉(zhuǎn)染僅表達熒光蛋白腺病毒(Ad-GFP)的HA-VSMC為對照組,分別采用RT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后HA-VSMC中SM22α mRNA和蛋白表達水平。 結(jié)果:與正常主動脈壁組織相比,人主動脈夾層血管壁組織中SP1 mRNA(3.81±2.84對0.91±0.67,P<0.05)和蛋白(2.09±0.32對0.90±0.09,P<0.05)表達水平均明顯升高,SM22α mRNA(0.39±0.20對1.01±0.51,P<0.05)和蛋白(0.75±0.10對1.01±0.09,P<0.05)表達水平均明顯下降;腺病毒轉(zhuǎn)染HA-VSMC后,與對照組相比,Ad-SP1組中SM22α mRNA(0.36±0.03對0.95±0.11,P<0.05)和蛋白(0.84±0.11對1.06±0.06,P<0.05)表達水平均明顯下降。 結(jié)論:轉(zhuǎn)錄因子SP1在主動脈夾層組織中表達水平升高,與VSMC表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān),參與主動脈夾層的發(fā)病過程。
主動脈夾層;SP1;血管平滑肌細胞;表型轉(zhuǎn)化
主動脈夾層是血液經(jīng)主動脈壁內(nèi)膜撕裂口進入血管壁中層,形成夾層血腫并沿主動脈壁延伸剝離的致死性血管疾病[1]。目前主動脈夾層的治療方法主要是外科手術(shù),但病情的復(fù)雜性及手術(shù)的高風(fēng)險性嚴重影響了治療效果。研究顯示主動脈夾層術(shù)后早期住院死亡率高達9%~30%[2]。深入研究主動脈夾層的發(fā)病機制有助于探尋疾病早期非手術(shù)干預(yù)方法。
主動脈壁中層的血管平滑肌細胞發(fā)生由收縮型到合成型的表型轉(zhuǎn)化是主動脈夾層發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)[3];而我們前期研究發(fā)現(xiàn),在人主動脈夾層血管壁組織中,轉(zhuǎn)錄因子SP1(specificity protein 1)呈現(xiàn)高表達。本研究通過對SP1與VSMC表型轉(zhuǎn)化之間關(guān)系的研究,探討SP1在主動脈夾層發(fā)病中的作用機制。
1.1 主要試劑、細胞株和儀器
BCA蛋白濃度測定試劑盒,中國碧云天;mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒,日本Takara公司;SP1抗體、平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)抗體,英國Abcam公司,羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗,美國Earthox公司;腺病毒表達載體試劑盒,美國Stategene公司;pHBAd-MCMV-GFP過表達載體,漢恒生物科技;DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶,美國BioLabs公司;大腸桿菌菌株DH5α、人胚腎細胞系HEK293,保存于本實驗室;原代正常人主動脈血管平滑肌細胞(HA-VSMC),美國模式菌種收集中心(ATCC);LighterCycler?480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR擴增系統(tǒng),瑞士Roche公司。
1.2 人主動脈壁組織留取
主動脈夾層血管壁組織和正常主動脈壁組織分別取自長海醫(yī)院心血管外科主動脈夾層患者、主動脈瓣置換術(shù)患者和心臟移植術(shù)捐贈者。其中主動脈夾層血管壁組織標(biāo)本10份,正常主動脈壁組織標(biāo)本4份。標(biāo)本的收集使用均經(jīng)患方知情同意并簽字。標(biāo)本取下后即刻用預(yù)冷的生理鹽水沖洗,剝離內(nèi)膜及外膜,留取中層血管壁組織,液氮內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 HA-VSMC的培養(yǎng)
HA-VSMC快速復(fù)溫后用含20%胎牛血清(FBS)的SMEM培養(yǎng)基于37℃、5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng),待細胞貼壁生長良好時,更換為含2%FBS的SMDM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細胞長勢良好,覆蓋培養(yǎng)皿總面積80%以上時進行傳代培養(yǎng)。
1.4 SP1過表達腺病毒的構(gòu)建
采用pHBAd-MCMV-GFP過表達載體,MCMV啟動子后為多克隆位點(MCS)區(qū),目的基因片段插入EcoRⅠ、NotⅠ位點。于GenBank中查找SP1基因CDS區(qū)序列,設(shè)計包含有EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點的引物,正向序列為5′-atagaattcgccacc ATGAGCGACCAAGATCACT-3′;反向序列為5′-atagcggccgcTCAGAAGCCATTGCCACTGAT-3′。提取HA-VSMC總mRNA,逆轉(zhuǎn)錄并擴增SP1的cDNA。對pHBAd-MCMV-GFP載體及SP1的cDNA采用EcoRⅠ、NotⅠ進行酶切,連接酶進行連接;連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞(大腸桿菌菌株DH5α)懸液,于氨芐青霉素抗性LB固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng),選取生長良好的菌落,進行PCR擴增并鑒定,提取純化重組質(zhì)粒。采用人胚腎細胞系HEK293進行重組腺病毒載體的包裝及擴增,TCID50法測定感染滴度。
1.5 SP1過表達腺病毒轉(zhuǎn)染HA-VSMC
將長勢良好的HA-VSMC接種到12孔或6孔培養(yǎng)板內(nèi),貼壁生長至覆蓋培養(yǎng)板底部面積約70%時,更換新的培養(yǎng)基,SP1過表達腺病毒(Ad-SP1)組培養(yǎng)孔內(nèi)加入Ad-SP1,對照組加入僅表達熒光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)。轉(zhuǎn)染24 h后,觀察細胞內(nèi)熒光含量,確認病毒轉(zhuǎn)染效率;棄去含病毒的培養(yǎng)基,換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集細胞。
1.6 RT-PCR檢測SP1和SM22α mRNA表達水平
TRIzol法提取主動脈夾層血管壁組織、正常主動脈壁組織和HA-VSMC的總RNA,紫外吸收法測定總RNA濃度。根據(jù)GenBank中SP1和SM22α基因序列設(shè)計PCR引物,SP1基因正向序列為5′-CTATAGCAAATGCCCCAGGT-3′,反向序列為5′-TCCACCTGCTGTGTCATCAT-3′;SM22α基因正向序列為5′-TCCAGACTGTTG ACCTCTTTG-3′,反向序列為5′-TCTTATGC TCCTGCGCTTTC-3′。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用20 μl反應(yīng)體系進行PCR擴增,擴增條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火20 s,72℃延伸20 s,40個循環(huán)后,獲得樣本Ct值。采用2-ΔCt法計算目的基因的mRNA相對表達量。
1.7 Western blot檢測SP1和SM22α蛋白表達水平
蛋白裂解液從主動脈夾層血管壁組織、正常主動脈壁組織和HA-VSMC中提取總蛋白,BAC法測定蛋白濃度,根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量。凝膠電泳分離蛋白后,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,SP1抗體(1∶5 000)、SM22α抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶5 000)4℃孵育過夜,二抗室溫下孵育1 h,顯色。通過Image J軟件測定蛋白條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。
1.8 統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
2.1 人主動脈壁組織中SP1和SM22α 的mRNA、蛋白表達水平
與正常主動脈壁組織相比,主動脈夾層血管壁
組織中SP1 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高(P均<0.05),SM22α mRNA和蛋白表達水平均明顯下降(P均<0.05),見圖1、表1。
注:A為正常主動脈壁組織;B、C為主動脈夾層血管壁組織圖1 人主動脈壁組織中SP1和SM22α蛋白表達水平
2.2 SP1過表達腺病毒對HA-VSMC的轉(zhuǎn)染效率
在對HA-VSMC轉(zhuǎn)染24 h后,光鏡下觀察可見細胞生長良好,形態(tài)正常;相同視野下觀察細胞內(nèi)熒光含量,>90%的細胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光信號,提示病毒的轉(zhuǎn)染效率滿意,見圖2。
2.3 轉(zhuǎn)染后的HA-VSMC中SP1和SM22α的 mRNA、蛋白表達變化
Ad-SP1組的HA-VSMC中,SP1 mRNA和蛋白表達水平均明顯高于對照組(P均<0.05),SM22α mRNA和蛋白表達水平較對照組均明顯降低(P均<0.05),見表2、圖3。
注:A為Ad-SP1組HA-VSMC的形態(tài);B為Ad-SP1組熒光蛋白GFP的表達情況;C為對照組HA-VSMC的形態(tài);D為對照組熒光蛋白GFP的表達情況圖2 腺病毒對HA-VSMC的轉(zhuǎn)染效率(×40)
mRNA相對表達水平SP1SM22α蛋白相對表達水平SP1SM22α正常主動脈壁組織0.91±0.671.01±0.510.90±0.091.01±0.09主動脈夾層血管壁組織3.81±2.84(1)0.39±0.20(1)2.09±0.32(1)0.75±0.10(1)
注:與正常主動脈壁組織比較,(1)P<0.05
表2 轉(zhuǎn)染后的HA-VSMC中 SP1和SM22α mRNA、蛋白表達水平的比較
注:與對照組比較,(1)P<0.01
SP1是SP1/Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族中最有效的轉(zhuǎn)錄激活因子之一[4],其含有高度保守的DNA結(jié)合區(qū),能與下游靶基因中富含GC的序列結(jié)合,調(diào)控多種基因表達。研究表明,SP1能夠促進腫瘤細胞中骨橋蛋白(osteopontin, OPN)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2等的表達,同時促進其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[5-7]。Murthy等[8]發(fā)現(xiàn)SP1能促進循環(huán)中巨噬細胞MMP9的表達。此外,SP1可通過促進VSMC增殖、遷移,參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[9-11]。但SP1對VSMC表型轉(zhuǎn)化的影響,以及SP1高表達與主動脈夾層發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未見報道。
作為主動脈壁中層的主要細胞成分,VSMC一直都是主動脈夾層發(fā)病機制的研究熱點。VSMC存在收縮型及合成型兩種表型[12]。正常主動脈壁內(nèi)VSMC以收縮型為主,其分化程度高,增殖及遷移能力低,收縮能力強;而主動脈夾層血管壁組織中的VSMC以合成型為主,其分化程度低,增殖及遷移能力增強,收縮能力弱。VSMC在由收縮型向合成型的轉(zhuǎn)化過程中,胞內(nèi)收縮蛋白大量降解,細胞收縮能力下降;另一方面,表型轉(zhuǎn)化導(dǎo)致MMP2、MMP9過度表達,引起彈力蛋白降解,加重基質(zhì)破壞和細胞丟失[13],使血管壁的穩(wěn)定性下降。SM22α蛋白屬于細胞骨架相關(guān)蛋白,在收縮型VSMC中特異性高表達[14]。本研究證實轉(zhuǎn)錄因子SP1在人主動脈夾層血管壁組織中高表達,而收縮型VSMC標(biāo)志物SM22α表達下降,提示主動脈夾層血管壁組織中的VSMC發(fā)生了由收縮型向合成型的轉(zhuǎn)化。我們進一步構(gòu)建SP1過表達腺病毒,高效轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的HA-VSMC并使其過表達SP1,發(fā)現(xiàn)其SM22α表達減少,提示SP1高表達與HA-VMSC表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。
本研究表明,SP1可能通過促進VSMC表型轉(zhuǎn)化參與主動脈夾層的發(fā)病過程。關(guān)于SP1調(diào)控VSMC表型轉(zhuǎn)化的相關(guān)通路,以及SP1在主動脈夾層組織中高表達的原因,尚需進一步研究。
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(收稿:2016-06-17 修回:2016-08-24)
(本文編輯:胡曉靜)
The effects of transcription factor SP1 on phenotypic switching of vascular smooth muscle cells in pathogenesis of aortic dissection
YUANRuijun,TANGYangfeng,LIUXiaohong,YUANYang,WANGGuokun,HANLin.
DepartmentofCardiovascularSurgery,ChanghaiHospitalAffiliatedtotheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China
Objective:To investigate the expression level of specificity protein 1 (SP1) in the tissue from human aortic dissection (AD) and the relationship between SP1 and phenotypic switching of vascular smooth muscle cell (VSMC) in aorta. Methods:Human aortic wall tissues were collected from ten AD patients and four normal donors. The mRNA and protein expressions of SP1 and contractile VSMC marker SM22α were detected by RT-PCR and western blot. Normal human aorta smooth muscle cells (HA-VSMC) were culturedinvitro. Human SP1 overexpression adenovirus (Ad-SP1) was constructed and used to transfect HA-VSMC, using GFP expression adenovirus (Ad-GFP) as control. The expressions of SM22α in HA-VSMC after transfection were detected by RT-PCR and western blot. Results:Compared with normal aortic wall tissues, the expressions of SP1 in AD tissues were significantly upregulated in both mRNA level (3.81±2.84 vs. 0.91±0.67,P<0.05) and protein level (2.09±0.32 vs. 0.90±0.09,P<0.05), while the SM22α expressions were downregulated (mRNA 0.39±0.20 vs. 1.01±0.51,P<0.05; protein 0.75±0.10 vs. 1.01±0.09,P<0.05). Compared with control group, the expressions of SM22α in HA-VSMC culturedinvitrowere significantly downregulated after successful overexpression of SP1 by Ad-SP1 (mRNA 0.36±0.03 vs. 0.95±0.11,P<0.05; protein 0.84±0.11 vs. 1.06±0.06,P<0.05). Conclusion:In AD tissue, SP1 is upregulated and closely correlated with VSMC phenotypic switching, indicating that SP1 may participate in the pathogenesis of AD.
Aortic dissection; SP1; Vascular smooth muscle cell; Phenotypic switching
國家自然科學(xué)基金(81400344)
200433 上海,第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院心血管外科
韓 林,Email:sh_hanlin@163.com
10.3969/j.issn.1673-6583.2016.06.013