熱療對(duì)小鼠骨肉瘤的療效及腫瘤組織HSP 70基因表達(dá)

潘 佳,李艷華,程傳耀,王亞秋，周 芳,王建

河南大學(xué)淮河醫(yī)院 腫瘤科，河南 開封 475000

熱療對(duì)小鼠骨肉瘤的療效及腫瘤組織HSP 70基因表達(dá)

河南大學(xué)淮河醫(yī)院 腫瘤科，河南 開封 475000

〔目的〕 探索熱療對(duì)原代細(xì)胞系及耐藥骨肉瘤細(xì)胞系成瘤體積的影響，并用免疫組化方法檢測(cè)不同細(xì)胞系熱療后HSP 70基因表達(dá)。〔方法〕 原代細(xì)胞系和耐藥細(xì)胞系接種小鼠16只，按體積相似分成4組。實(shí)驗(yàn)組用熱療43 ℃ 30 min對(duì)照組未進(jìn)行熱療處理，根據(jù)腫瘤體積大小及生存時(shí)間繪制曲線。用免疫組化方法測(cè)定熱療后不同細(xì)胞系成瘤的組織在HSP 70的基因表達(dá)情況?！步Y(jié)果〕 熱療處理后腫瘤生長(zhǎng)與對(duì)照組相比有明顯的差異(P<0. 05)。耐藥組與原代組比較未見(jiàn)明顯差異(P>0. 05)；熱療后實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織HSP 70蛋白表達(dá)明顯高于未熱療處理組實(shí)驗(yàn)小鼠組織(P<0.05),Saos-2細(xì)胞系成瘤鼠組和Saos-2/MTX4.4細(xì)胞系成瘤鼠組熱處理和無(wú)熱處理組間未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)?！步Y(jié)論〕 熱療對(duì)耐藥細(xì)胞系和原代細(xì)胞系成瘤均有殺傷作用。熱療后兩種細(xì)胞系都表現(xiàn)出HSP 70表達(dá)升高。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；骨肉瘤；熱療；HSP 70

骨肉瘤是發(fā)生在青少年骨的常見(jiàn)腫瘤，疾病引起患者肢體功能障礙，嚴(yán)重的危及患者的生命。由于手術(shù)治療和化療的綜合方法應(yīng)用，治療效果明顯改善，但是由于耐藥問(wèn)題的存在，療效不能進(jìn)一步提高，需要尋找新的治療方法和途徑是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。熱療在骨肉瘤治療中進(jìn)行了臨床應(yīng)用，并提高了治療效果。我們?cè)噲D通過(guò)局部熱療的方法，觀察對(duì)成瘤原代細(xì)胞系和成瘤耐藥細(xì)胞系的熱療效果，并用免疫組化方法檢測(cè)HSP基因在成瘤原代細(xì)胞系及成瘤耐藥細(xì)胞系不同表達(dá)，探索可能影響熱療效果的因素。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系

Saos-2原代細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。Saos-2/MTX4.4細(xì)胞系，我們實(shí)驗(yàn)室在原代細(xì)胞系逐漸升高藥物濃度，沖擊法培養(yǎng)成功，液氮環(huán)境下保存后，實(shí)驗(yàn)前復(fù)蘇細(xì)胞系，并檢測(cè)具備耐藥細(xì)胞系特點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL6小鼠16只，雄性，周齡8周，體重(20±2) g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，清潔級(jí)飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均參照我國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》中有關(guān)動(dòng)物福利的條規(guī)進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

HSP 70一抗(Sino,Bidogical Inc )辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)公司，免疫化學(xué)試劑盒(ACE-0037)購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Therm公司；OLYMPUS IX-70倒置相差顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；TGHM型電熱光聚焦加熱燈(日本Olympus公司;溫度測(cè)量及記錄系統(tǒng)(美國(guó)Physitemp公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

骨肉瘤Saos-2細(xì)胞系及Saos-2/MTX4.4細(xì)胞系。常規(guī)37 ℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用1 640培養(yǎng)溶液與體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清，細(xì)胞株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期實(shí)驗(yàn)備用。

1.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 動(dòng)物模型制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Saos-2細(xì)胞系及Saos-2/MTX4.4細(xì)胞系，用2.5 g/L胰酶消化，重懸于PBS中。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL，兩種細(xì)胞系分別接種于16只實(shí)驗(yàn)小鼠背部皮下，0.2 mL/只。接種1周，腫瘤直徑達(dá)到5 mm左右；選Saos-2細(xì)胞系與Saos-2/MTX4.4細(xì)胞系腫瘤大小一致的4只小鼠分別做1實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照1組實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照2組實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 荷瘤小鼠熱療 10 g/L戊巴比妥鈉(0.1～0.16 mL/只)麻醉小鼠后，以TGHM型電熱光聚焦加熱燈對(duì)荷瘤小鼠移植瘤進(jìn)行局部加熱。加熱3～5 min后溫度達(dá)預(yù)定值(43 ℃)后開始計(jì)時(shí)，并通過(guò)隨時(shí)調(diào)節(jié)光圈使溫度保持在預(yù)定溫度±1 ℃;同時(shí)用2個(gè)熱電偶分別插入腫瘤中心和直腸，對(duì)腫瘤中心溫度及全身溫度(直腸溫度)進(jìn)行監(jiān)測(cè);分別給予實(shí)驗(yàn)組小鼠43 ℃ 30 min熱療，然后將熱電偶取下，待其蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)。每只小鼠間隔24 h接受1次熱療，共接受3次。對(duì)照組除不加熱外其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。

1.5.3 觀察腫瘤生長(zhǎng)情況 熱療后動(dòng)態(tài)觀察小鼠整體狀態(tài)，以及腫瘤體積的改變。熱療后0,7,14,21 d測(cè)量腫瘤大小。小鼠腫瘤體積=1/2(長(zhǎng)徑×短徑×短徑)。

1.5.4 免疫組化測(cè)定腫瘤組織HSP表達(dá) 第21天不同細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠斷頸處死，切取不同實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織，常規(guī)方法固定處理，制作病理切片，用不加一抗組織片作陰性對(duì)照，用陽(yáng)性組織切片作陽(yáng)性對(duì)照。HSP 70一抗(Sino,Bidogical Inc )，免疫組化用鏈菌素-親生物素過(guò)氧化物酶法(S-P)方法，操作按試劑盒要求進(jìn)行，試劑盒來(lái)購(gòu)自福州邁新公司。

1.6統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以t檢驗(yàn)表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD,P<0.05，視為有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 熱療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制情況

對(duì)腫瘤體積的動(dòng)態(tài)測(cè)量結(jié)果(圖1)顯示，43 ℃持續(xù)30 min的熱療，3次熱療后對(duì)小鼠成瘤的生長(zhǎng)顯示出抑制作用，腫瘤生長(zhǎng)與對(duì)照組相比有明顯的差異(P<0. 05)。耐藥組與原代組比較未見(jiàn)明顯差異(P>0. 05)，熱療與無(wú)熱療小鼠結(jié)果見(jiàn)圖2與圖3。

圖1 成瘤實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤體積與生存時(shí)間曲線圖

2.2 成瘤鼠腫瘤組織HSP 70免疫組化表達(dá)

實(shí)驗(yàn)小鼠于21 d處死，取腫瘤組織做實(shí)驗(yàn)，每組做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，用不加一抗組織片作陰性對(duì)照，用陽(yáng)性組織切片作陽(yáng)性對(duì)照。HSP 70一抗(Sino,Bidogical Inc )，免疫組化用鏈菌素-親生物素過(guò)氧化物酶法(S-P)，操作按試劑盒要求進(jìn)行，按染色程度進(jìn)行評(píng)分:無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，淺褐色為3分，深褐色為4分。以陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分:陽(yáng)性細(xì)胞比例占25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞占26%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞占51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞占所占76%～100%為4分。以上述兩項(xiàng)評(píng)分之和表示最后得分。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5)。熱療后實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織HSP 70蛋白表達(dá)明顯高于未熱療處理實(shí)驗(yàn)小鼠組織(P<0.05),Saos-2細(xì)胞系成瘤鼠組和Saos-2/MTX4.4細(xì)胞系成瘤鼠組熱處理和無(wú)熱處理組間未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。

圖2 熱療后成瘤鼠

圖3 無(wú)熱療成瘤鼠

3 討論

熱療在骨肉瘤的臨床治療方面進(jìn)行了應(yīng)用，用局部消融和微波治療方法，提高了治療效果，提高了保肢率[1-2]，但是臨床實(shí)踐[3-4]發(fā)現(xiàn),在治療時(shí)，局部熱療溫度不好控制，因此，沒(méi)有被廣泛推廣應(yīng)用。我們實(shí)驗(yàn)用原代細(xì)胞系和耐藥細(xì)胞系建立荷瘤小鼠模型，用電熱光聚焦加熱燈對(duì)荷瘤小鼠移植瘤進(jìn)行局部加熱，溫度達(dá)預(yù)定值(43 ℃)后開始計(jì)時(shí)30 min，每24 h熱療1次，共進(jìn)行3次。觀察腫瘤體積變化，發(fā)現(xiàn)熱療對(duì)原代(Saos-2)細(xì)胞系成瘤鼠腫瘤和對(duì)耐藥細(xì)胞系(Saos-2/MTX4.4)均有明顯的抗腫瘤作用，且對(duì)兩種成瘤細(xì)胞系腫瘤殺傷效果未見(jiàn)明顯差別。提示：熱療可能是克服耐藥骨肉瘤的一種治療方法。Takemoto等[5]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)骨肉瘤模型上對(duì)多種藥物也進(jìn)行了熱化療實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)溫度為41.5 ℃、時(shí)間30 min，得出結(jié)論：熱療對(duì)骨肉瘤腫瘤有提高療效的作用，烷化劑在高溫下可能是多種腫瘤的首選藥物。熱休克蛋白是生物受到環(huán)境中物理、化學(xué)、生物、精神等刺激時(shí)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而合成的蛋白質(zhì)。加熱可以提高熱休克蛋白的表達(dá)，熱體克蛋白種類有HSP 100家族 ，HSP 90家族, HSP 70家族, HSP 60家族，小分子量HSP家族,通過(guò)對(duì)原代細(xì)胞系成瘤鼠腫瘤組和耐藥細(xì)胞系成瘤鼠腫瘤組的熱療與未熱療組織，用免疫組化方法對(duì)HSP 70基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，熱療后實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織HSP 70蛋白表達(dá)明顯高于未熱療處理組實(shí)驗(yàn)小鼠組織,Saos-2細(xì)胞系成瘤鼠組和Saos-2/MTX4.4細(xì)胞系成瘤鼠組熱處理組和無(wú)熱處理組間未見(jiàn)明顯差異。說(shuō)明熱療后細(xì)胞產(chǎn)生生理保護(hù)機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生耐熱的生物活性，所以，防止耐熱活性的產(chǎn)生需要在短時(shí)間內(nèi)對(duì)腫瘤組組進(jìn)行殺傷，殺傷方案可以提高熱療溫度，也可以提高每次熱療的時(shí)間，防止耐熱腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Trieb[6]做出的結(jié)果相似。

圖4 陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組組織切片

圖5 陰性實(shí)驗(yàn)組組織切片

[1] Fan Q, Ma B, Guo A. Zhonghua wai ke za zhi .Treatment of malignant or aggressive bone tumors with microwave induced hyperthermia[J]. Chinese journal of surgery, 1997,35 (8):484-487.

[2] Tateishi A, Miki H, Imamura T, Cho S, et al. Hyperthermic isolated regional perfusion for the treatment of osteosarcoma in the lower extremity[J].Nakano H, 1999,178(1):27-32.

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[4] van Ginkel R J, Schraffordt Koops H, de Vries E G, et al. Hyperthermic isolated limb perfusion with cisplatin in four patients with sarcomas of soft tissue and bone[J]. Eur J Surg Oncol，1996,22(5):528-531.

[6] Trieb K1, Lechleitner T, Lang S, et al. Heat shock protein 72 expression in osteosarcomas correlates with good response to neoadjuvant chemotherapy[J]. Hum Pathol, 1998,29(10):1050-1055.

[責(zé)任編輯 李武營(yíng)]

Effect of hyperthermia on osteosarcoma in mice and the expression of HSP 70 gene in tumor tissue

Oncology Department of Huaihe Hospital of Henan University， Kaifeng 475000, China

〔Objective〕The antiosteosarcoma effects of hyperthermia were explored by detecting tumor cell volume and HSP 70 gene expression in different cell lines.〔Methods〕Sixteen mice were inoculated into the primary cell line and drug resistant cell line. These mice were divided into 4 groups according to their volume. The hyperthermia treatment group was treated at 43 ℃ for 30 min. The expression of HSP 70 gene in different tumor cell lines was determined using immunohistochemistry.〔Results〕Compared with the control group, the tumor growth was significantly different after hyperthermia treatment (P<0.05) in the experimental group. The expression of HSP 70 protein in the experimental group was significantly higher than that in the untreated group (P<0.05), but the difference was not significant (P>0.05) (P<0.05), and there was no significant difference between heat treated group and non-heat-treated group (P>0.05). 〔Conclusion〕Hyperthermia has the killing effect on the tumor cell lines and the primary cell lines. The hyperthermia treatment can increase the HSP 70 expression i in the same cell line.

Animal experiment; Osteosarcoma; Hyperthermia; HSP70

1672-7606(2016)04-0232-04

2016-10-17

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(162102310394)

潘佳(1973-)，河南開封人，主治醫(yī)師，從事臨床腫瘤疾病的診治工作。

R783.1

A

王建軍(1968-)，河南開封人，副教授，從事臨床腫瘤學(xué)的的研究及教學(xué)工作。