紅花山楂莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的研究

魏巖　金麗麗

摘要：紅花山楂是觀賞價(jià)值很高的觀花喬木，本文對(duì)紅花山楂在取材時(shí)間、基本培養(yǎng)基、激素濃度等方面進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明：誘導(dǎo)培養(yǎng)外植體取材時(shí)間為3月份，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPS基本培養(yǎng)基，激素水平為BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，平均萌發(fā)率達(dá)到50%。

關(guān)鍵詞：紅花山楂；莖段；誘導(dǎo)培養(yǎng)

紅花山楂為薔薇科山楂屬植物，初夏開(kāi)深粉紅色重瓣花，有很高的觀賞價(jià)值。紅花山楂是園林觀花樹(shù)種沒(méi)有果實(shí)，無(wú)法進(jìn)行播種繁殖。早春硬枝扦插和夏季軟枝扦插，枝條愈傷組織不斷增大，但最終一直未出現(xiàn)根系，確認(rèn)為扦插難生根或不生根植物。紅花山楂的擴(kuò)繁可以采用嫁接技術(shù)，但很多優(yōu)良的山楂資源存圃不多，如遼寧山楂、彰武山楂等，圃內(nèi)各存1株，并且嫁接繁殖速度慢且費(fèi)用較高。為了節(jié)約成本，大面積推廣應(yīng)用，需要加速它的離體培養(yǎng)研究。本試驗(yàn)以紅花山楂莖段為材料進(jìn)行了組織培養(yǎng)特性研究，試圖找出適合該品種組培快繁的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1材料與方法

1.1供試材料

所用的紅花山楂。

1.2外植體的選取

取當(dāng)年生、生長(zhǎng)健壯的枝條，剪去葉和刺，切成1.0～1.5cm小段，每段至少含1個(gè)腋芽，洗衣粉水浸泡30min，放在流水下沖洗。然后在超凈工作臺(tái)上用0.1%升汞（HgCl₂）消毒8min，用無(wú)菌水沖洗4～5次，用無(wú)菌濾紙吸干后備用。

1.3外植體的清洗

先將切割好的植物材料在自來(lái)水龍頭下流水沖洗30min，然后再在洗滌劑溶液中浸泡5min后，用紗布扎住燒杯口（防止植物材料被沖出），倒掉洗滌劑溶液，自來(lái)水龍頭下流水沖洗35min。

1.4外植體的表面滅菌

清洗后在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行表面滅菌，用0.1%的升汞溶液小燒杯中浸泡8～10min，無(wú)菌水沖洗8次。

1.5接種

將滅菌后的莖段放到滅菌濾紙上，并將其頂端和底部切掉約0.5cm（滅菌劑殺死的部分）后，再將剩余莖段切成1cm左右的小莖段，保證每個(gè)小莖段至少帶有1個(gè)腋芽，插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種1個(gè)培養(yǎng)物。

1.6培養(yǎng)條件

白糖3%，瓊脂0.7%，光照14～16h，光照強(qiáng)度2000～2500Lux，溫度22±2℃。

2結(jié)果與分析

2.1基本培養(yǎng)基的篩選

本試驗(yàn)選用MS、WPS2種基本培養(yǎng)基，比較紅花山楂外植體的生長(zhǎng)狀況，每處理接種30種，重復(fù)2次，2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)。從表1可以看出，不同基本培養(yǎng)基對(duì)外植體的誘導(dǎo)率影響不同，WPS培養(yǎng)的誘導(dǎo)率顯著高于MS基本培養(yǎng)基，說(shuō)明WPS能夠有效誘導(dǎo)外植體萌發(fā)，外植體在WPS培養(yǎng)基中的平均誘導(dǎo)率50%，比MS培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率高35%。外植體在WPS培養(yǎng)基中10天萌動(dòng)，萌芽后未出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象，生長(zhǎng)良好。MS培養(yǎng)基中的外植體萌動(dòng)20天，一直保持愈傷組織狀態(tài)，無(wú)葉片展開(kāi)，無(wú)葉抽出，直到2個(gè)月仍維持此狀態(tài)。因此，誘導(dǎo)培養(yǎng)基宜選用WPS培養(yǎng)基。

2.2不同取材時(shí)期對(duì)外植體誘導(dǎo)的影響

植物組織培養(yǎng)的成功，除了人為提供的培養(yǎng)基比較適宜之外，所選用的外植體情況如何也是很重要的。為了能順利快速繁殖，必須選擇適宜的外植體，外植體誘導(dǎo)效果主要受外源激素、本身生理狀態(tài)、遺傳特性、生理學(xué)年齡、取材季節(jié)有關(guān)。

本試驗(yàn)于2014年3月中旬、6月中旬在苗圃中取山楂當(dāng)年生枝條，切成莖段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，比較不同時(shí)期的外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，每處理接種30種，重復(fù)3次，2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)。

從表2可以看出，3月和6月所取的外植體在WPS培養(yǎng)基中平均萌動(dòng)時(shí)間差異不顯著，生長(zhǎng)情況較好，但萌動(dòng)率有差異，3月所取在母株生長(zhǎng)旺盛的季節(jié)取材，不僅成活率高而且增殖也快。6月萌動(dòng)時(shí)間為25天，但萌動(dòng)后所接種的外植體全部污染。

其原因可能是3月中旬取材時(shí)，此時(shí)植株正在解除休眠，開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)期，萌動(dòng)時(shí)間所需時(shí)間較短，帶菌少，細(xì)胞分化程度低，更容易萌動(dòng)，這與大田中的植株表現(xiàn)一致。而在夏天采集，雖然葉片也很幼嫩，但內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)積累較少，帶菌多，不僅難以進(jìn)行消毒處理，而且也難以培養(yǎng)成功。因此，取材的季節(jié)以早春為好，3月份所取的外植體更適合進(jìn)行離體培養(yǎng)。

2.3不同生長(zhǎng)素種類和濃度的篩選

以3月份帶芽莖段為外植體，WPS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的激素組合，篩選出適合外植體生長(zhǎng)的激素種類和濃度。

從表3可以看出，接種60天后，外植體在各種激素配比中的生長(zhǎng)情況有一定差別。培養(yǎng)基中添加NAA時(shí)，外植體的平均萌動(dòng)率隨BA濃度的增大而明顯上升，BA濃度為1mg，L時(shí)，外植體平均萌動(dòng)率最高，為50%，并且生長(zhǎng)良好，萌動(dòng)較快，葉片展開(kāi)較快，色深綠，一直未出現(xiàn)枯葉、死亡現(xiàn)象。BA濃度為0.5mg，L時(shí)，外植體基部產(chǎn)生白色愈傷組織，接種30天一直保持愈傷組織狀態(tài)，直至外植體枯死。培養(yǎng)基中添加IBA時(shí)，外植體的平均萌動(dòng)率隨BA濃度的增大而下降。外植體在附加BA1mg/L、0.5mg/L的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況差別不大，均表現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢。培養(yǎng)基中添加IAA時(shí)，外植體的平均萌動(dòng)率隨BA濃度的增大而上升，外植體生長(zhǎng)緩慢，無(wú)展葉。

綜合考慮以上情況，外植體在BAl.0 mg/L和NAA0.1 mg/L的組合中生長(zhǎng)最好。

3結(jié)論與討論

眾所周知，誘導(dǎo)培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)的第一步，其目的是：將離體的植物材料經(jīng)過(guò)表面滅菌接種在各種培養(yǎng)基中，建立起無(wú)菌體系。紅花山楂外植體最佳的取材時(shí)間是3月中旬，適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPS，附加+BAI.0 mg/L和NAA0.1 mg/L。

山楂屬植物的組織培養(yǎng)以MS、WPS培養(yǎng)基為主，大多數(shù)選用了MS培養(yǎng)基，但本試驗(yàn)在外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中使用WPS基本培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好。WPS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基相比，鈣離子含量高，含有硝態(tài)氮，無(wú)銨態(tài)氮和碘化鉀。鈣離子是植物細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的重要第二信使，直接影響細(xì)胞生理生化活動(dòng)，對(duì)離子通道也有調(diào)控作用，影響各種無(wú)機(jī)鹽的吸收。WPS培養(yǎng)基好于MS培養(yǎng)基，可能一方面是由于鈣離子濃度可能促進(jìn)各種生命活動(dòng)中的信號(hào)傳導(dǎo)，增進(jìn)了植物體整體的協(xié)調(diào)發(fā)展，另一方面山楂對(duì)硝態(tài)氮吸收要好于銨態(tài)氮的緣故。

生長(zhǎng)素的作用主要是促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)受傷的組織表面一至數(shù)層細(xì)胞恢復(fù)分裂能力，形成愈傷組織，促進(jìn)生根等。細(xì)胞分裂素有誘導(dǎo)芽的分化、促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)的作用。細(xì)胞分裂素在誘導(dǎo)芽的分化上起著主導(dǎo)作用。試驗(yàn)只是對(duì)紅花山楂的一個(gè)品種進(jìn)行的研究，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素濃度的比例保持在10：1，誘導(dǎo)效果較好。在某些方面和他人也有一定的差異，這可能與其基因型差異和激素濃度有關(guān)，還須進(jìn)一步研究。