草莓品種紅顏組培快繁體系的優(yōu)化

陳英，張西英

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆五家渠 831300)

草莓品種紅顏組培快繁體系的優(yōu)化

陳英，張西英

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆五家渠 831300)

【目的】建立穩(wěn)定的草莓組織培養(yǎng)快繁體系提供技術(shù)參數(shù)。【方法】以草莓品種紅顏為材料，研究外植體消毒、誘導(dǎo)分化、增殖培養(yǎng)等各環(huán)節(jié)的影響因子和外源激素濃度配比?！窘Y(jié)果】⑴外植體消毒的最佳方法為：匍匐莖用75%酒精浸泡30s，0.1%升汞消毒5 min，再用無(wú)菌水漂洗5遍迅速用濾紙吸干。⑵誘導(dǎo)方式：瓶?jī)?nèi)匍匐莖莖尖剝?nèi)?.3～0.5 mm最優(yōu)最好。⑶誘導(dǎo)分化最佳培養(yǎng)基MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA 1 mg/L。⑷采用培養(yǎng)基MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.05 mg/L+中苗期+每塊3個(gè)芽的切割方式達(dá)到最理想的增殖系數(shù)?！窘Y(jié)論】外源激素中細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素之間的適宜的配比濃度是，紅顏草莓建立穩(wěn)定的再生體系的關(guān)鍵因素。匍匐莖尖誘導(dǎo)分化適宜的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配比濃度為1∶10；快繁適宜的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配比濃度為4∶1。

草莓；組織培養(yǎng)；快繁；優(yōu)化

0 引 言

【研究意義】草莓營(yíng)養(yǎng)豐富，果肉中含有大量的糖類、有機(jī)酸、果膠、鞣花酸和花色苷等物質(zhì)[1-3]。它既可鮮食也可加工成果漿、果汁、果酒、罐頭[4]。隨著新疆設(shè)施農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，近年陸續(xù)引入紅顏、章姬、甜查理等草莓新優(yōu)品種,設(shè)施草莓進(jìn)入了快速發(fā)展期。生產(chǎn)上草莓主要繁殖方法[5]：匍匐莖繁殖、母株分株繁殖，連續(xù)種植存在著嚴(yán)重病毒累積。草莓植株本身沒(méi)有對(duì)病毒的免疫能力，目前又沒(méi)有特效的藥劑或方法治愈，一旦感染病毒，植株長(zhǎng)勢(shì)減弱、個(gè)體矮化、含糖量變低、畸形果多、產(chǎn)量降低[6-8]。我國(guó)研究者對(duì)草莓皺縮病毒、草莓斑駁病毒、草莓輕型黃邊病毒、草莓鑲脈病毒進(jìn)行了鑒定[9]，運(yùn)用生物技術(shù)對(duì)草毒進(jìn)行脫毒[10-11]和組培快繁是解決問(wèn)題的有效途徑。【前人研究進(jìn)展】用莖尖培養(yǎng)法進(jìn)行無(wú)病毒苗的培育，是目前世界上獲得草莓無(wú)毒苗最普通且最有效的方法[12]。同一植物不同品種的外植體誘導(dǎo)所需最適生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度不同[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)草莓品種紅顏快繁過(guò)程中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的適宜配比濃度研究較少，缺乏對(duì)組培快繁生產(chǎn)提供技術(shù)參數(shù)和指導(dǎo)。針對(duì)新疆主要推廣品種之一的草莓紅顏，研究其離體再生體系建立、組培種苗規(guī)?；旆薄！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究草莓紅顏誘導(dǎo)分化、增殖快繁的影響因子，建立穩(wěn)定的快繁體系,為其它草莓品種推廣使用快繁苗并進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 草莓品種

供試材料為新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師國(guó)家科技園區(qū)設(shè)施基地引進(jìn)栽培的草莓品種紅顏。

1.1.2 試劑及器皿

0.1%升汞，蒸餾水，75%酒精，1%洗潔精，量筒100 mL、容量瓶1 000 mL、滅菌燒杯1 000 mL、玻璃棒、剪刀、鑷子、接種針、濾紙。

1.1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、40倍變倍體顯微鏡、滅菌器

1.2 方 法

1.2.1 外植體的滅菌時(shí)間

從田間選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、具典型性狀的優(yōu)良植株為母株，剪取剛抽出的匍匐莖頂端約3 cm和幼嫩的葉片，分別用1%洗潔精水溶液浸泡5 min并用玻璃棒輕微攪動(dòng)后，再用自來(lái)水沖洗30～40 min，無(wú)菌水沖洗1～2遍移入超凈工作臺(tái)，倒入75%酒精分別浸泡20、30、40 s三個(gè)處理，無(wú)菌水沖洗2～3次，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液輕微攪動(dòng)4、5、8 min三個(gè)處理，最后用無(wú)菌水沖洗4～5遍。每個(gè)處理接種50個(gè)外植體，重復(fù)三次。7 d后統(tǒng)計(jì)外植體損傷程度、污染率、褐化率。

1.2.2 不同來(lái)源匍匐莖尖

按照1.2.1消毒過(guò)的外植體匍匐莖與組培瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的匍匐莖分別置于解剖鏡下，剝?nèi)?.2～0.3 mm、0.3～0.5 mm、0.5～0.8 mm的生長(zhǎng)點(diǎn)(三個(gè)處理)，接種到培養(yǎng)基(每個(gè)培養(yǎng)瓶盛培養(yǎng)基25 mL左右)上，每瓶接入1個(gè)莖尖，每個(gè)處理接種50瓶。

1.2.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)匍匐莖莖尖誘導(dǎo)分化的影響

莖尖剝離后接入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，在MS培養(yǎng)基中添加激素6-BA和IBA：設(shè)定6-BA的濃度為0.1和0.2 mg/L，IBA的濃度為0.05、0.1和1 mg/L，得到6組不同的培養(yǎng)基組合，編號(hào)為B1-B6。每種培養(yǎng)基接種50個(gè)外植體，25 d后對(duì)其增殖系數(shù)及其生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察，通過(guò)方差分析統(tǒng)計(jì)，篩選最佳培養(yǎng)基。

1.2.4 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比繼代培養(yǎng)基對(duì)增殖系數(shù)的影響

對(duì)紅顏草莓繼代培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)在MS中添加激素6-BA和IBA：設(shè)定6-BA的濃度為0.1、0.2和0.3 mg/L，IBA的濃度為0.05、0.1和1 mg/L，得到9組不同的培養(yǎng)基組合，編號(hào)為C1-C9。每種培養(yǎng)基接種50個(gè)外植體，25 d后對(duì)其增殖系數(shù)及其生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察，通過(guò)方差分析統(tǒng)計(jì)，篩選最佳培養(yǎng)基。

1.2.5 不同生長(zhǎng)時(shí)期切割方式對(duì)增殖系數(shù)及狀態(tài)的影響

按照人為劃分的草莓組培苗生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)叢生芽的增殖進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化，所用的組培苗時(shí)期分別為：叢生芽生成期、幼苗期、中苗期三個(gè)時(shí)期。操作時(shí)的切割方式分別為：每個(gè)外植體1個(gè)芽或3個(gè)芽。對(duì)以上三個(gè)時(shí)期及兩種切割方式進(jìn)行組合，得到6種處理組合方式， 將三個(gè)不同時(shí)期共六種處理組合接種至繼代培養(yǎng)基，即MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.05 mg/L+蔗糖3%+卡拉膠 6.0 g/L，pH 值為5.8的培養(yǎng)基中。每種處理組合接種50個(gè)，重復(fù)三次，25 d后對(duì)每種組合的增殖系數(shù)及狀態(tài)進(jìn)行觀察，通過(guò)方差分析統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體消毒時(shí)間對(duì)外植體污染率的影響

研究表明，隨著酒精與升汞消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，幼嫩葉片與匍匐莖尖褐化率明顯上升，控制消毒時(shí)間可以有效降低褐化率。草莓的幼嫩葉片和匍匐莖都能誘導(dǎo)分化，葉片采用A2處理時(shí)滅菌效果好損傷程度低，即葉片采用75%酒精浸泡20s，用無(wú)菌水漂洗三遍，0.1%升汞消毒5 min后用無(wú)菌水漂洗5遍。匍匐莖采用A5滅菌效果好，損傷程度低，即采用75%酒精浸泡30s，用無(wú)菌水漂洗三遍，0.1%升汞消毒5 min后用無(wú)菌水漂洗5遍。在外植體消毒過(guò)程中控制污染率是組培成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采用75%酒精+0.1%升汞處理方式，有效地控制葉片污染率在0.3%以下，匍匐莖污染率在3.2%以下。表1

表1 不同外植體消毒時(shí)間下外植體污染率變化

Table 1 Effects of sterilization time

注：+表示受損外植體增加20%Note: + Expression damaged explants increased by 20%

2.2 不同來(lái)源匍匐莖的莖尖培養(yǎng)成活率

田間匍匐莖和瓶?jī)?nèi)匍匐莖都能誘導(dǎo)分化形成芽，大田采集的匍匐莖消毒，出現(xiàn)明顯褐化現(xiàn)象，剝?nèi)〉那o尖從小到大褐化率分別高出19%、32%、41%；污染率明顯高于瓶?jī)?nèi)匍匐莖4.4%、5.7%、6.8%。瓶?jī)?nèi)的匍匐莖直接剝?nèi)∏o尖，不用消毒滅菌，無(wú)褐化現(xiàn)象。因此，田間采集的匍匐莖莖尖接種后的成活率和誘導(dǎo)率低于瓶?jī)?nèi)匍匐莖尖。表2，圖1

表2 不同來(lái)源匍匐莖成活率

Table 2 Effects of Different sources of stolons impacts

類別Genre莖尖剝離大小Stemtipspallofbigorsmall(mm)接種數(shù)Amountofinoculation(個(gè))發(fā)芽數(shù)Germina-tivenumber(個(gè))污染率Contaminationrate(%)成活率Survivalrate(%)誘導(dǎo)率Inductivity(%)褐化率Browningrate(%)外植體匍匐莖Explantstolon0.2～0.350185.13629190.3～0.550276.85443320.5～0.850368.1725841瓶?jī)?nèi)匍匐莖Bottlestolon0.2～0.350210.7534000.3～0.550391.1786900.5～0.850441.388830

圖1 田間植株的匍匐莖與瓶?jī)?nèi)匍匐莖

Fig.1 Stolons in the field and within bottle of plants

2.3 培養(yǎng)基中添加外源激素對(duì)匍匐莖莖尖誘導(dǎo)分化的影響

研究表明，誘導(dǎo)愈傷組織再生器官時(shí)，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素要同時(shí)用到。莖尖剝離后在添加外源激素的培養(yǎng)基中均可以誘導(dǎo)分化，不同配比濃度，分化的叢生苗的生長(zhǎng)狀態(tài)不同。B3叢生芽狀態(tài)明顯的良好，芽點(diǎn)多。莖尖脫毒誘導(dǎo)分化的激素配比為MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA 1 mg/L +蔗糖3%+卡拉膠0.6%。表3，圖2

表3 不同激素配比下匍匐莖莖尖誘導(dǎo)分化情況

Table 3 Stolons stem tip induced differentiation

注：Note:

圖2 匍匐莖莖尖誘導(dǎo)分化對(duì)比

Fig.2 The photos of contrast among stolons stem tip induced differentiation

2.4 繼代培養(yǎng)基中添加外源激素對(duì)增殖系數(shù)的影響

在繼代增殖培養(yǎng)中, 適當(dāng)?shù)耐庠醇に貪舛仁谦@得高增殖倍數(shù)及良好生長(zhǎng)情況的一個(gè)關(guān)鍵因素。過(guò)高或過(guò)低的激素濃度都會(huì)影響芽的增殖及生長(zhǎng)效果。研究表明，C7叢生芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)均高，但叢生芽有畸形和玻璃化發(fā)生，C5叢生芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)較高，叢生芽多，長(zhǎng)勢(shì)均勻，狀態(tài)良好，繼代培養(yǎng)基選擇C5即MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.05 mg/L+3%糖+0.6%卡拉膠為最佳。表4，圖3

表4 不同激素配比下繼代培養(yǎng)基對(duì)增殖系數(shù)

Table 4 Subculture medium impacts on multiplication factor

處理Treatment6-BA(mg/L)IBA(mg/L)叢生芽誘導(dǎo)率Inductivityofclusterbuds(%)增殖系數(shù)Growthcoefficient叢生芽狀態(tài)StatusofclusterbudsC10.10.0572±0.577c3.1±0.67d芽點(diǎn)較少,誘導(dǎo)率低C20.10.151.3±1.76d2.8±0.28d芽少,誘導(dǎo)率低C30.1179.3±4.67bc2.58±0.46d芽少,誘導(dǎo)率低C40.20.181.3±2.91bc5.97±0.53ab芽較多,誘導(dǎo)率高,C50.20.0591.3±2.91a6.25±0.38ab芽點(diǎn)多,狀態(tài)良好長(zhǎng)勢(shì)均一C60.2182±3.06b4.94±0.38c芽點(diǎn)較多,長(zhǎng)勢(shì)均一C70.3196±1.15a6.62±0.23a芽多,有畸形和玻璃化發(fā)生C80.30.0593±0.67a6.55±0.22a芽多,狀態(tài)較好C90.30.11005.22±0.29bc芽較多,輕微玻璃化

圖3 組培苗在繼代培養(yǎng)基上的狀態(tài)對(duì)比照片

Fig.3 The contrast photos of somaclones on successive transfer culture medium

2.5 不同生長(zhǎng)時(shí)期切割方式對(duì)增殖系數(shù)的影響

處理組合D2“不定根生成期+每塊3個(gè)芽”誘導(dǎo)得到的增殖系數(shù)較高為6.62，但是該處理組合誘導(dǎo)得到的叢生芽細(xì)密弱小，長(zhǎng)勢(shì)不均，在一定程度上延長(zhǎng)了組培生產(chǎn)周期。而D4處理組合誘導(dǎo)得到的叢生芽生長(zhǎng)旺盛，狀態(tài)均一，多數(shù)處于中苗期，增殖系數(shù)為6.58，僅次于D2組，所以有利于工業(yè)化生產(chǎn)的快速擴(kuò)繁。表5

表5 不同生長(zhǎng)時(shí)期不同切割方式下增殖系數(shù)變化

Table 5 Influence of different growth periods and cutting methods on growth coefficient of strawberry

處理Treatment處理組合Treatmentcombination增殖系數(shù)Growthcoefficient叢生芽狀態(tài)StatusofclusterbudsD1不定根生成期+每塊1個(gè)芽4.81±0.51b接種芽大,分化芽小密集,長(zhǎng)勢(shì)不均一D2不定根生成期+每塊3個(gè)芽6.62±0.23a接種芽大,分化芽小密集,長(zhǎng)勢(shì)不均一D3中苗期+每塊1個(gè)芽5.03±0.17b植株生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)均一D4中苗期+每塊3個(gè)芽6.58±0.31a植株生長(zhǎng)健壯、均一D5成苗期+每塊1個(gè)芽3.15±0.08c長(zhǎng)勢(shì)均一、較弱,叢生芽一般D6成苗期+每塊3個(gè)芽4.78±0.23b長(zhǎng)勢(shì)均一、較弱,叢生芽一般

3 討 論

生產(chǎn)上培育草莓脫毒苗主要是通過(guò)高溫與莖尖結(jié)合脫毒病毒檢測(cè)快速繁殖，從而獲得大批量的優(yōu)質(zhì)種苗，可進(jìn)行周年生產(chǎn)，不受季節(jié)限制，從而實(shí)現(xiàn)草莓組培苗的規(guī)?；绾筒葺缕贩N的迅速推廣。

植物組織培養(yǎng)過(guò)程的關(guān)鍵是提高繁殖系數(shù)，基本培養(yǎng)基種類、激素種類配比及濃度、碳源和有機(jī)物的種類及濃度等都是影響繁殖系數(shù)的重要因素[16]。在誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化及增殖過(guò)程中，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素要同時(shí)使用，由于不同植物種基因型的差異和分離外植體的器官本身發(fā)育時(shí)期的差異，所需的激素濃度不可能固定不變，必須在一定的激素濃度范圍內(nèi)進(jìn)行研究，在研究中，隨著外源激素配比濃度的增加，6-BA與IBA的配比能明顯提高紅顏草莓的誘導(dǎo)分化和增殖系數(shù)，但到達(dá)一定濃度配比，草莓誘導(dǎo)分化和增殖培養(yǎng)的組培苗細(xì)密柔弱，甚至有些出現(xiàn)玻璃化苗，可能是由于內(nèi)源激素水平直接受外源激素濃度水平的影響[17]。這與鄧馨等[18]的研究相一致。表明培養(yǎng)條件和外源激素等是調(diào)節(jié)內(nèi)源激素水平的重要途徑。同一植物不同品種的外植體所需最適生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度不同[19]。因此，尋找適宜的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)種類及配比對(duì)草莓離體再生非常重要。

大多數(shù)對(duì)草莓脫毒苗獲取是采集大田匍匐莖，進(jìn)行莖尖剝離，再病毒檢測(cè)。而莖尖需采用0.2～0.3 mm，莖尖越小脫毒效果越好，但成活率低，且剝離莖尖難度大，操作易被污染，誘導(dǎo)分化成苗所需時(shí)間較長(zhǎng)，工作效率低。采用在試管內(nèi)先誘導(dǎo)匍匐莖再剝離莖尖的優(yōu)化方法，可大幅度降低污染率和提高莖尖接種后的成活率，采用瓶?jī)?nèi)誘導(dǎo)匍匐莖，剝?nèi)∏o尖再病毒檢測(cè)可以作為目前草莓無(wú)毒苗加快推廣的技術(shù)運(yùn)用到生產(chǎn)中。

4 結(jié) 論

4.1 采集大田草莓匍匐莖優(yōu)化為在試管內(nèi)對(duì)草莓苗進(jìn)行匍匐莖誘導(dǎo)是可行的。該優(yōu)化技術(shù)的研究為大幅度降低污染率40%～61%，提高莖尖成活率30%，提高了莖尖成活率和脫毒率，為降低成本提高效率奠定了基礎(chǔ)。

4.2 外源激素中細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的適宜配比濃度是建立穩(wěn)定的再生體系的關(guān)鍵因素。通過(guò)對(duì)紅顏草莓的研究，匍匐莖尖誘導(dǎo)分化適宜配比濃度為1∶10；快繁適宜配比濃度為4∶1。

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Fund project:Supported by the National "12th Five-Year Plan" Science & Technology Program " Integration and Demonstration of Key Technologies in Characteristic Agricultural Modernization in North Tianshan Mountain"(2012BAD41B00)

Optimization of a Rapid Reproductive System of Strawberry Variety 'Hongysn' by Using Tissue Culture Method

CHEN Ying, ZHANG Xi-ying

(ResearchInstituteofAgriculturalSciences,the6thAgriculturalProductionDivisionofXinjiangProductionandConstructionCorps，WujiaquXinjiang831300,China)

【Objective】 To Provide the key technical parameters for establishing a stable reproduction system of strawberry tissue cultures，and realize the virus free production of strawberry.【Method】Those impact factors and the ratios of exogenous hormones were determined during the process of tissue cultures and rapid reproduction, including explants disinfection, seedling stem tip detoxification, induced differentiation, and reproductive culturewith the "Hongyan" strawberry.【Result】(1) The optimal procedure of explants disinfection includes was as follows: the sterilization of stolons was dipping 30s in 75% alcohol, then disinfecting 5 minutes with 0.1% corrosive sublimate and rinsing 5 times with sterile water, absorbed rapidly with filter paper.(2) The optimal way of virus-freeing of stolons stem tip was stripping 0.3 to 0.5 millimeter in bottle.(3) The best culture medium of shoot tip of creeping stem for induced differentiation was MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA 1 mg/L.(4) By using medium MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.05 mg/L+middle-stageseeding three buds per piece, the most ideal growth coefficient was achieved.【Conclusion】The key factors for establishing stable mass reproduction system included the suitable ratio between cytokinin and exogenous hormones during the strawberry stolons tip virus-removing, induced differentiation, and rapid propagation.

strawberry; tissue culture; rapid reproduction; optimizing

2016-07-17

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“天山北坡特色農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化關(guān)鍵技術(shù)集成與示范”(2012BAD41B00)

陳英(1967-)，女，湖北黃陂人，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向?yàn)樘厣魑锩摱究旆奔夹g(shù)和育苗技術(shù)，(E-mail)1131382130@qq.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.12.007

S668.4；S603.8

：A

：1001-4330(2016)12-2210-07