酶解血粉的單因素和響應(yīng)面條件的優(yōu)化

■王 燕 易春霞 文奇男 劉 驥 郭建華 任 健 郭宏文 劉曉蘭

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機(jī)械研究所有限公司，遼寧沈陽110036）

隨著酶技術(shù)的迅速發(fā)展和酶產(chǎn)品的增多，利用蛋白酶水解豬血以提高其利用率得到了關(guān)注[1]，酶解處理后得到酶解液中含有多肽和小肽，這些肽成分容易被動(dòng)物吸收，且肽本身具有很好的抗氧化、免疫促進(jìn)及抗菌特性等作用?？晒┻x擇水解豬血的蛋白酶種類也多，有中性蛋白酶[2-4]、木瓜蛋白酶[3，5]、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶[2，6-7]、胃蛋白酶、胰酶[8]、復(fù)合酶[3，9]。李艷偉[9]用胰蛋白酶水解豬血得到提純小肽，通過體內(nèi)和體外的免疫活性實(shí)驗(yàn)證明小肽對(duì)免疫活性有顯著的增強(qiáng)作用。郭奇亮[10]利用胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶作為水解用酶來酶解豬血紅蛋白得到的多肽具有很好的降血壓效果。張鳳英[11]利用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶來酶解血球粉得到的酶解產(chǎn)物具有很好的抗氧化作用。酶解處理后蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致功能特性的變化，動(dòng)物利用效果提高。施用暉等[12]利用制備得到的消化酶酶解血粉替代魚粉，也發(fā)現(xiàn)酶解血粉和魚粉對(duì)肉仔鴨有相同的飼喂效果。周學(xué)文等[13]報(bào)道，木瓜蛋白酶酶解血粉替代肉雞和小白鼠日糧中的秘魯魚粉，結(jié)果顯示，肉雞和小白鼠增重情況相似，說明酶解豬血粉的飼養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于秘魯魚粉。但是酶解血粉的水解度較低，小肽含量低，血粉的利用率仍較低，如何通過提高血粉的水解度，從而提高血粉的利用率成為亟待解決的問題。本試驗(yàn)的目的是篩選水解血粉的最有效的酶制劑，利用篩選得到的酶制劑產(chǎn)品，通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)探討酶解工藝的最佳參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用干燥血粉作為實(shí)驗(yàn)原料，首先進(jìn)行除毛處理，再進(jìn)行粉碎過40目篩備用。

1.2 方法

首先篩選最佳酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶），再選擇最佳的酶，研究用最佳工藝條件酶解后的血粉的水解度，優(yōu)化的工藝條件包括底物濃度、酶添加量(E/S，酶與底物比)、pH值、溫度和水解時(shí)間，再選用影響較大的4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，選出最佳的工藝條件。

1.3 水解度的測(cè)定

取滅酶后水解液，經(jīng)過一定程度的稀釋，取2 ml稀釋液于試管中，加入1 ml茚三酮顯色劑，混勻后置沸水浴加熱15 min，冷水冷卻，加入5.0 ml體積分?jǐn)?shù)為40%乙醇溶液充分混勻，放置15 min后，于570 nm處測(cè)定光密度值（去離子水做參比）。另取相同濃度未水解蛋白溶液1.0 ml，按照上述方法測(cè)定光密度，以二者光密度之差從工作曲線上查蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，其水解度根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：h——水解打開的肽鍵個(gè)數(shù)；

htot——蛋白總肽鍵個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選最適宜的蛋白酶（見圖1）

通過圖1可以看出，堿性蛋白酶水解血粉的水解度最佳，達(dá)到8.95%，其次是中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，最低的是風(fēng)味蛋白酶和酸性蛋白酶。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 底物濃度對(duì)水解度的影響（見圖2）

由圖2可知，水解度隨著底物濃度的增加呈現(xiàn)開始穩(wěn)定后逐漸增加，達(dá)到最高點(diǎn)后又下降的趨勢(shì)。由圖2可知，底物濃度達(dá)到40 mg/ml時(shí)，水解度達(dá)到最高。

2.2.2 酶添加量（E/S）對(duì)水解度的影響（見圖3）

圖1 不同蛋白酶水解血粉的水解度

圖2 不同底物濃度對(duì)血粉的水解度的影響

圖3 不同酶添加量（E/S）對(duì)血粉的水解度的影響

由圖3可知，隨著酶添加量的增大，水解度呈現(xiàn)先穩(wěn)定再逐漸增大的趨勢(shì)。在反應(yīng)初期，隨著酶添加量的增加，水解度基本穩(wěn)定。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶添加量逐漸增加，水解體系中的反應(yīng)速率增加，提高了血粉蛋白的水解效果。但是酶的價(jià)格昂貴，因此，基于經(jīng)濟(jì)方面考慮，未添加更多酶以增加水解度。

2.2.3 pH值對(duì)水解度的影響（見圖4）

圖4 不同pH值對(duì)血粉的水解度的影響

從圖4可知，堿性蛋白酶在pH值為11時(shí)的水解度達(dá)到最大，本試驗(yàn)中，蛋白酶酶解血粉蛋白的最適pH值符合堿性蛋白酶產(chǎn)生作用的pH值范圍。

2.2.4 溫度對(duì)水解度的影響（見圖5）

圖5 不同溫度對(duì)血粉的水解度的影響

圖5可見，隨著溫度的升高，蛋白酶的水解反應(yīng)變慢，說明45℃為該堿性蛋白酶的最適溫度。當(dāng)達(dá)到最高值之后，隨著溫度的升高，水解度下降。由圖5可知，堿性蛋白酶在45℃左右達(dá)到最大的水解度。

2.2.5 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響（見圖6）

從圖6可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶酶解血粉蛋白的水解度增大，但是從經(jīng)濟(jì)和能耗的角度考慮，堿性蛋白酶的酶解時(shí)間確定為14 h。

2.3 響應(yīng)面多因素工藝條件優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面分析因素的選取及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響水解度較大的4個(gè)因素（底物濃度、溫度、酶添加量及時(shí)間），以水解度為響應(yīng)值，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了4因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。各因子及水平編碼如表1所示。

圖6 不同時(shí)間對(duì)血粉的水解度的影響

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，可得底物濃度、溫度、酶添加量及酶解時(shí)間與水解度間的二次多項(xiàng)回歸方程：

式中：Y——水解度(%)；

A——底物濃度(mg/ml)；

B——溫度(℃)；

C——酶添加量；

D——時(shí)間(h)。

響應(yīng)面結(jié)果的方差分析和二次回歸方程的方差分析分別如表3和表4所示。由表3、表4可知，本實(shí)驗(yàn)所選用模型極顯著(P=0.004 8＜0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.187 7＞0.05)，說明模型的擬合檢驗(yàn)顯著；水解度的變異系數(shù)CV為6.78%，信噪比為9.181，說明模型可信度較高，模型校正相關(guān)系數(shù)為0.624 8，存在顯著性差異，表明該模型擬合度良好；回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.812 4，表明81%的水解度的變化可由此模型解釋，與實(shí)際情況擬合很好，所以此模型可應(yīng)用于血粉水解度的分析和預(yù)測(cè)。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及水解度的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值

表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析

表4 二次回歸方程的方差分析

由表3響應(yīng)面結(jié)果方差分析可知，因素D在ɑ=0.01水平上對(duì)水解度的線性效應(yīng)高度顯著，因素D對(duì)曲面效應(yīng)高度顯著，說明水解時(shí)間對(duì)水解度的影響高度顯著。因素BC在ɑ=0.05水平上的交互作用顯著，因素C2對(duì)其曲面效應(yīng)顯著，說明酶添加量對(duì)血粉水解度有顯著性影響，酶添加量與溫度之間的交互作用也能對(duì)水解度造成顯著性影響。由響應(yīng)面方差分析的結(jié)果可知，在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，對(duì)血粉水解度影響最大的是酶解時(shí)間，其次是溫度和酶添加量，最后是底物濃度。

2.3.3 酶解條件的分析及優(yōu)化

采用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，酶解時(shí)間、溫度、底物濃度和酶添加量對(duì)血粉水解度的影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖7～圖12。通過響應(yīng)面圖，可以直觀地反映酶解條件對(duì)水解度的影響。等高線的形狀可以反映出因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素不顯著，而橢圓則表示較為顯著。

圖7 溫度和底物濃度對(duì)水解度的影響的曲面圖和等高線圖

圖8 底物濃度和酶添加量對(duì)水解度的影響的曲面圖和等高線圖

圖9 底物濃度和酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響的曲面圖和等高線圖

圖10 酶解溫度和酶添加量對(duì)水解度的影響的曲面圖和等高線圖

圖11 酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響的曲面圖和等高線圖

圖12 酶解時(shí)間和酶添加量對(duì)水解度的影響的曲面圖和等高線圖

圖7顯示了底物濃度和溫度的交互作用對(duì)硫甙降解率影響的等高線和曲面圖。對(duì)其等高線圖進(jìn)行分析，可以直觀地看出底物濃度和溫度之間的交互作用顯著，由曲面圖可知，在本實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增大，水解度先增大后減小，當(dāng)添加量為40 mg/ml附近時(shí)達(dá)到理論最大值；溫度對(duì)水解度的影響與底物濃度對(duì)水解度的影響相一致，當(dāng)溫度為45℃附近，底物濃度在40 mg/ml時(shí)，水解度達(dá)到最高。

圖8顯示底物濃度和酶添加量的交互作用對(duì)水解度的影響。隨著酶添加量和底物濃度增加，水解度先增加后下降，說明二者交互作用對(duì)水解度有影響，且酶濃度影響比底物濃度對(duì)水解度的影響大。

圖9顯示底物濃度和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)水解度的影響。隨著底物濃度增加和酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度呈先增大后降低的趨勢(shì)，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?8 mg/ml時(shí)，水解度降幅較大，說明底物濃度和酶解時(shí)間對(duì)水解度有顯著影響。

圖10顯示了底物濃度和溫度的交互作用對(duì)硫甙降解率影響的等高線和曲面圖。對(duì)其等高線圖進(jìn)行分析，可以直觀地看出底物濃度和溫度之間的交互作用顯著，由曲面圖可知，在本實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增大，水解度先增大后減小，當(dāng)添加量為40 mg/ml附近時(shí)達(dá)到理論最大值；溫度對(duì)水解度的影響與底物濃度對(duì)水解度的影響相一致，當(dāng)溫度為45℃附近，底物濃度在40 mg/ml時(shí)，水解度達(dá)到最高。

圖11顯示了酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)水解度的等高線和曲面圖。對(duì)其等高線圖進(jìn)行分析，可以直觀地看出酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用顯著，由曲面圖可知，在本實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的增加，水解度先增大后減小，當(dāng)酶解溫度為45℃附近時(shí)達(dá)到理論最大值，酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響與溫度對(duì)水解度的影響相一致，當(dāng)溫度為45℃附近，酶解時(shí)間為12 h，水解度達(dá)到最高。

圖12顯示了酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)水解度影響的等高線和曲面圖。對(duì)其等高線圖進(jìn)行分析，可以直觀地看出酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用顯著。由曲面圖可知，在本實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，隨著酶添加量的增大，水解度先增大后減小，當(dāng)酶添加量為0.780附近時(shí)，達(dá)到理論最大值，隨著溫度增加，水解度先增大后減小，當(dāng)溫度為42℃附近，水解度達(dá)到最高。

為了進(jìn)一步求得各因素的最佳條件組合，由圖7～圖12回歸方程的三維響應(yīng)面圖以及等高線圖可知，回歸模型存在最大值，當(dāng)響應(yīng)值Y有最大值時(shí)，對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，得出酶解的最佳條件為底物濃度為41.44 mg/ml，溫度為45℃，酶添加量為0.803 4，酶解時(shí)間為14 h，此時(shí)水解度達(dá)到了16.39%。

2.3.4 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的有效性，根據(jù)優(yōu)化試驗(yàn)所得的各因素優(yōu)化值，底物濃度為41.44 mg/ml，溫度為45℃，酶添加量為0.803 4，酶解時(shí)間為14 h，重復(fù)3次試驗(yàn)，測(cè)得的水解度平均值為16.58%。與理論預(yù)測(cè)值16.39%非常接近，相對(duì)誤差為1.93%，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)酶解情況。由此說明響應(yīng)面分析法應(yīng)用于酶解條件的優(yōu)化是可行的。該優(yōu)化條件下水解度比優(yōu)化前提高了3.11%。

3 結(jié)論

①酶解血粉的最優(yōu)條件為：酶解的最佳條件為底物濃度為41.44 mg/ml，溫度為45℃，酶添加量為0.803 4，酶解時(shí)間為14 h，此時(shí)水解度達(dá)到了16.39%。

②通過驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得血粉的水解度為16.58%，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差僅為1.93%，說明模型能較好地預(yù)測(cè)酶解血粉的實(shí)際情況，具有較強(qiáng)的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。