柱前衍生高效液相色譜法測定酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖的含量

■張相飛 劉 明 李文輝

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島266109；2.北京中農(nóng)弘科生物技術(shù)有限公司，北京102206；3.廊坊市農(nóng)業(yè)局，河北廊坊065000）

酵母培養(yǎng)物是利用酵母菌在特定工藝條件控制下采用特殊的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)出來的一種成分復(fù)雜的微生態(tài)制品,它含有酵母細(xì)胞外代謝產(chǎn)物、變性的培養(yǎng)基和少量的酵母細(xì)胞。目前的研究表明，酵母培養(yǎng)物作為一種飼料添加劑能夠有效降低有害菌的增殖，改善仔豬腸道微生物菌群，減少肉仔雞大腸桿菌數(shù)量和增加乳酸桿菌數(shù)量。酵母培養(yǎng)物可顯著提高瘤胃中羧甲基纖維素酶、水楊苷酶和木聚糖酶的酶活性，加快飼料纖維易降解成分的消化速度，提高纖維的消化率，改善初產(chǎn)奶牛圍產(chǎn)期的體況，提高奶牛日均產(chǎn)奶量，改善奶牛生產(chǎn)性能。酵母培養(yǎng)物中的酵母甘露聚糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、抗輻射、抗細(xì)菌病毒等功效，是酵母培養(yǎng)物中的重要的功效成分之一。因此，酵母甘露聚糖的含量被認(rèn)為是評(píng)價(jià)酵母培養(yǎng)物品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

對(duì)單糖含量的測定一般采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，但采用上述方法用于測定酵母培養(yǎng)物中的甘露聚糖含量時(shí)，得到的結(jié)果是總的還原糖，不能排除其他糖類的干擾，專一性差，測定結(jié)果不能準(zhǔn)確反映樣品中甘露聚糖的實(shí)際含量。

還原性糖在堿性條件下能與糖類常用的衍生試劑PMP發(fā)生定量反應(yīng)，所生成的衍生物穩(wěn)定、紫外吸收強(qiáng)。酵母培養(yǎng)物經(jīng)均質(zhì)處理使其中的酵母細(xì)胞充分破壁后，其中的酵母多糖在硫酸作用下，水解得到單糖。單糖用PMP衍生化后，再以0.1 mol/l pH值5.5的乙酸銨緩沖液-乙腈（V/V，70∶30）為流動(dòng)相洗脫，反相C18柱分離，用紫外檢測器（波長250 nm）檢測，測得單糖的含量通過換算后得到酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀、高速均質(zhì)機(jī)（昂尼AD200L-P）、PB-10型pH計(jì)（賽多利斯）、臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)試劑

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、氯仿（分析純）、鹽酸（分析純）、乙酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、乙酸銨（分析純）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（分析純）、超純水、甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品（含量98%，上海源葉生物）、甘露聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（含量98%，上海源葉生物）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g（精確到0.000 1 g）于100 ml容量瓶中，加水溶解后定容到100 ml容量瓶中，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用前取10 ml儲(chǔ)備溶液定容到100 ml容量瓶中作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取樣品4.5 g于燒杯中，加水至30 g（準(zhǔn)確至0.000 1 g），用高速均質(zhì)機(jī)10 000 r/min條件下處理10 min。準(zhǔn)確稱取其中0.5 g作為試樣，放入25 ml耐壓反應(yīng)管中，加入72%硫酸2.5 ml，搖勻靜置1～3 h，加超純水12.5 ml后，密封耐壓反應(yīng)管在100℃下攪拌水解4 h，水解完成后將高壓反應(yīng)管用冰水冷卻，水解液移入容量瓶中，定容到100 ml，此為試樣溶液。取其中10 ml用6 M的NaOH溶液調(diào)為中性，再定容到100 ml，為待測樣品溶液。

衍生化反應(yīng)參考林欽恒等方法并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。取甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液、0.5 mol/l PMP甲醇溶液（須現(xiàn)配現(xiàn)用）、0.3 mol/l NaOH溶液各400 μl，置于10 ml具塞離心管中，充分混勻后于70℃水浴衍生化反應(yīng)30 min，放冷后加入0.3 mol/l鹽酸溶液500 μl，混勻，用三氯甲烷萃取出過量的PMP，洗滌4次每次用2.5 ml三氯甲烷，最后將水層液離心后，取上清液待測。

1.5 色譜條件

色譜柱Waters?C18Bondapak 300 mm×4.9 mm；流動(dòng)相：0.1 mol/lpH值5.5的乙酸銨緩沖液-乙腈（V/V，70∶30）；流速1.0 ml/min；柱溫35 ℃；檢測波長250 nm；進(jìn)樣量20 μl。

1.6 樣品的測定

在同樣的色譜條件下，將衍生化反應(yīng)后的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別注入色譜儀中，記錄各色譜峰的峰面積。每份樣品重復(fù)兩次結(jié)果取平均值。

試樣中甘露聚糖的含量計(jì)算公式為：

式中：X——甘露聚糖含量（%）；

A1——標(biāo)樣溶液中甘露糖峰面積的平均值；

A2——試樣溶液中甘露糖峰面積的平均值；

M1——甘露糖標(biāo)樣的質(zhì)量（g）；

M2——試樣溶液中酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量（g）；

P1——甘露糖標(biāo)樣中甘露糖的質(zhì)量百分含量（%）；

0.9——甘露糖和甘露聚糖的換算系數(shù)；

F——樣品酸水解過程中甘露糖被破壞造成結(jié)

果偏低的補(bǔ)償系數(shù)，其計(jì)算公式為：

式中：P——甘露聚糖標(biāo)樣中甘露聚糖的質(zhì)量百分含量；

X1——準(zhǔn)確稱取0.03 g甘露聚糖標(biāo)樣按照前述方法水解衍生測定后，通過甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的甘露聚糖濃度（mg/l）；

M——甘露聚糖標(biāo)樣的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離

以上述方法及色譜條件下所得甘露糖和酵母培養(yǎng)物HPLC色譜圖，如圖1所示。甘露糖PMP衍生物的分離度大于1.5，分離效果良好，基線呈水平狀，峰形對(duì)稱。

2.2 線性相關(guān)度和標(biāo)準(zhǔn)曲線

在上述方法及色譜條件下，測定一系列濃度梯度的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（見圖1）。以甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/l）為橫坐標(biāo)x，以對(duì)應(yīng)的色譜峰面積（v·s）為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

圖1 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品PMP衍生化的HPLC色譜圖

圖2 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果表明甘露糖濃度在1.0～100.0 mg/l范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程y=0.014 9x+0.006 1及相關(guān)系數(shù)（R2=0.998 1）。

2.3 方法精密度、添加回收率和最低檢測限

取酵母培養(yǎng)物樣品，按上述處理方法和色譜條件進(jìn)行5次平行測定，測得結(jié)果統(tǒng)計(jì)求出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明該方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.5%。取已知準(zhǔn)確含量的酵母培養(yǎng)物樣品，加入一定量的甘露聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照上述處理方法和色譜條件進(jìn)行測定，測得結(jié)果以測定值減去本底值比添加值求出回收率，重復(fù)處理5次，計(jì)算得到其添加回收率為96.3%～102.6%。按照3倍信噪比通過換算得到甘露聚糖最低檢測限（S/N=3）為0.11 mg/l。

2.4 討論

酵母培養(yǎng)物中的甘露聚糖存在于酵母細(xì)胞壁的外層，采用一些方法例如均質(zhì)處理可以使酵母細(xì)胞破壁，從而使得甘露聚糖在酸性條件下充分水解。單糖類物質(zhì)也可使用糖分析柱結(jié)合利用示差檢測器檢測，但糖柱不耐用，對(duì)應(yīng)的示差檢測器靈敏度較低，不適合檢測酵母培養(yǎng)物中的甘露聚糖。單糖衍生化后可以利用反相色譜柱進(jìn)行分離，采用紫外檢測器便能更加靈敏的檢測出單糖衍生物。如馬曉麗等利用PMP衍生結(jié)合高效液相色譜分析了大蒜多糖中的單糖組成及摩爾比。

林雪認(rèn)為衍生反應(yīng)時(shí)間在30 min以上時(shí)，單糖和PMP衍生反應(yīng)程度基本趨于穩(wěn)定，馮學(xué)珍等認(rèn)為單糖的PMP衍生化與反應(yīng)溫度和時(shí)間有一定的關(guān)系，在70℃水浴下能生成穩(wěn)定的化合物。因此從時(shí)間效率上考慮將反應(yīng)時(shí)間選擇為30 min，反應(yīng)溫度選擇為70℃。

3 結(jié)論

酵母培養(yǎng)物經(jīng)均質(zhì)處理后，多糖用硫酸水解，以PMP為單糖的衍生化試劑，以0.1 mol/l pH值5.5乙酸銨緩沖液∶乙腈（V/V，70∶30）為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min。用紫外檢測器在波長250 nm下檢測且以外標(biāo)法計(jì)算，能夠準(zhǔn)確地測定酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖的含量。該方法簡便準(zhǔn)確，適用于酵母培養(yǎng)物及類似樣品中甘露聚糖的含量測定。