抗菌肽對脂多糖導致的仔豬肝臟氧化應激的影響

■ 張海文 施平偉 洪 楓 王學梅 吳科榜 管慶豐*

（1.海南大學農(nóng)學院，海南海口570228；2.海南大學熱帶動物繁育與營養(yǎng)學實驗室，海南?？?70228）

先天免疫反應起始于宿主識別病原菌高度保守的分子結構，又被稱為病原模式分子，細菌的脂多糖（LPS）是最具有活性的病原模式分子，其可以促進誘導先天免疫系統(tǒng)激活，進而引發(fā)機體炎癥的發(fā)生[1]。仔豬在由母乳過渡到飼料的過程中，由于飼料組成，環(huán)境及自身免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟等因素，在LPS刺激下，極易導致機體發(fā)生免疫及氧化應激反應。肝臟是極其重要的代謝器官之一，由于其耗氧量大，因此會產(chǎn)生較多的氧自由基[2]。LPS作為革蘭氏陰性菌細胞壁的結構物質(zhì)，不僅可促進炎性細胞因子的產(chǎn)生，而且可誘導機體產(chǎn)生大量的自由基，直接導致細胞的氧化損傷[3]。

抗菌肽廣泛存在于各種生物體中，具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、組織修復等功能而得到普遍關注[4]，CJH抗菌肽是從爬行動物金環(huán)蛇中發(fā)現(xiàn)并提取出來的一種Cathelicidin家族抗菌肽，前期研究表面其在抗革蘭氏陰性菌方面具有極高的活性，且具有較好的穩(wěn)定性和安全性[5]，因此本試驗通過建立LPS致仔豬肝臟氧化應激模型，擬探討抗菌肽CJH在緩解仔豬肝臟氧化損傷方面的作用，進一步分析其可能的作用途徑，為將其應用至保護由細菌感染導致的仔豬肝臟氧化損傷方面奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗菌肽CJH合成于吉爾生化（上海）有限公司，RP-HPLC檢測純度達到95%以上，細菌脂多糖（Escherichia coliO55∶B5）購于Sigma公司（美國）。

1.2 試驗動物

試驗所用仔豬購于海南屯昌黑豬養(yǎng)殖合作社，選擇個體大小及體重接近[平均體重(6.43±0.79)kg]的21 d斷奶的屯昌黑豬18頭（28日齡，♂），飼養(yǎng)于海南大學農(nóng)學基地，預飼7 d，試驗期14 d。期間自由飲水和采食。

1.3 試驗日糧

試驗采用常規(guī)的玉米-豆粕型基礎日糧，依據(jù)NRC(1998)配制成顆粒料，基礎日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 試驗分組及設計

于預飼期（7 d）結束后，按照每組平均體重盡量一致的原則，將18頭仔豬隨機分配為3組，分別為空白對照組，LPS組和CJH+LPS組，其中CJH+LPS組在試驗的第2、6、10、14 d腹腔注射0.5 mg/kg單位體重的CJH，注射體積為2ml，對照組和LPS組在同一天注射相同體積的0.9%生理鹽水，LPS組和CJH+LPS組在試驗第1 d和第14 d腹腔注射100 μg/kg單位體重的LPS，注射體積為1 ml，對照組注射等體積的0.9%生理鹽水，所有仔豬于第14 d注射后12 h屠宰，期間正常飲水，禁止采食。

1.5 檢測指標

1.5.1 免疫器官指數(shù)測定

試驗結束后，對每頭仔豬進行稱重，屠宰，取對應仔豬完整的肝臟、胸腺與脾臟，將其周圍脂肪分離干凈，稱重，計算各自免疫器官指數(shù)[免疫器官指數(shù)=免疫器官重（g）/仔豬活重（kg）]。

表1 試驗日糧配方及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎）

1.5.2 肝臟抗氧化指標測定

取出之前凍存的肝臟組織，按照體積比加入9倍體積的生理鹽水，進行組織勻漿后低溫離心（4℃，8 000 r/min）15 min，取上清。利用BCA蛋白定量試劑盒（凱基，南京）測定上清蛋白濃度，利用GSH-Px、T-SOD、CAT和MDA（建成生物，南京）試劑盒測定上述指標，具體步驟按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.3 肝臟炎性細胞因子測定

肝臟炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6指標采用試劑盒（R&D，美國）測定，具體步驟參見試劑盒說明書進行。

1.5.4 肝組織病理學檢測

每組選取肝組織中葉三處部位（2 cm×2 cm×2 cm），用提前配制的4%多聚甲醛保存過夜，進行常規(guī)石蠟包埋后，切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，封片后制備組織切片，用Olympus BX41(奧林巴斯，日本)光學顯微鏡在200×下進行肝組織病理學觀察并拍照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS18.0軟件ANOVA法對原始試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，組間差異顯著性檢驗用Duncan's法多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同處理對仔豬免疫器官指數(shù)的影響（見表2）

由表2可知，與對照組相比，LPS組顯著降低了肝臟、脾臟及胸腺指數(shù)（P＜0.05），說明LPS刺激抑制了重要免疫器官的發(fā)育，尤其中樞免疫器官胸腺的發(fā)育與T細胞的分化密切相關，而在LPS刺激的同時定期的通過腹腔注射抗菌肽CJH的組別，其免疫器官指數(shù)與對照組相比表現(xiàn)為差異不顯著，表明抗菌肽CJH具有保護LPS導致的免疫器官發(fā)育受損的功能。

表2 免疫器官指數(shù)測定（g/kg）

2.2 不同處理對仔豬肝臟抗氧化功能的影響(見表3)

表3 肝臟抗氧化指標測定

由表3可知，與對照組相比，LPS組顯著降低了肝組織主要抗氧化酶GSH-Px、T-SOD、CAT的活性（P＜0.05），極顯著提高了肝組織脂質(zhì)過氧化主要產(chǎn)物MDA的含量（P＜0.01），表明LPS刺激破壞了肝臟的抗氧化酶系統(tǒng)，導致組織氧化損傷的發(fā)生，而通過給藥抗菌肽CJH后，肝組織抗氧化酶GSH-Px、T-SOD、CAT的活性恢復至接近對照組水平，同時肝組織MDA濃度也明顯下調(diào)至與對照組水平接近。

2.3 不同處理對仔豬肝組織炎性細胞因子分泌的影響（見表4）

表4 肝臟炎性細胞因子測定（μg/g）

由表4可知，通過測定主要促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6在肝臟組織的分泌水平發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS組極顯著提高了促炎因子TNF-α的分泌水平（P＜0.01），顯著提高了促炎因子IL-1β和IL-6的濃度（P＜0.05），而CJH+LPS組明顯緩解了由LPS導致的上述細胞因子的異常升高，與對照組均呈現(xiàn)差異水平不顯著。LPS刺激可導致機體免疫反應過度激活，從而引發(fā)炎癥，而在炎癥發(fā)生后，抗菌肽CJH的介入可顯著下調(diào)促炎因子的分泌，表明其具有緩解機體炎癥的功能，這可能與其維護肝組織的抗氧化功能有關聯(lián)。

2.4 不同處理對仔豬肝組織形態(tài)的觀察（見圖1）

圖1 不同處理仔豬肝臟組織病理學切片（A∶對照組，B∶LPS組，C∶CJH+LPS組 200×）

由圖1可知，通過肝組織的HE染色切片觀察，發(fā)現(xiàn)對照組肝小葉分支清楚，肝細胞索排列比較規(guī)則，呈放射狀分布，肝細胞間連接緊密，而LPS處理組肝臟表現(xiàn)為局部細胞出現(xiàn)明顯空泡化變性，部分胞核位于細胞的一側或消失，部分肝細胞呈點狀壞死，肝細胞索排列不規(guī)則，界線不清，CJH+LPS組與LPS組相比，肝細胞空泡化變性癥狀得到顯著改善，且肝小葉不同帶分支比較清楚，肝臟基本結構清晰完整。表明抗菌肽CJH可能通過緩解肝臟炎癥水平，由此降低肝組織氧化損傷。

3 討論

3.1 不同處理對仔豬免疫器官指數(shù)的影響

動物的免疫器官指數(shù)是評價機體免疫狀態(tài)的常用指標，與機體免疫力呈現(xiàn)高度正相關。脾臟內(nèi)含有大約40%左右的T淋巴細胞和60%的B淋巴細胞，在體液免疫中發(fā)揮重要作用，胸腺作為中樞免疫器官，與T細胞的發(fā)育及細胞免疫密切相關，肝臟雖然不是典型的免疫器官，但其仍參與到免疫反應環(huán)節(jié)中[6]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激導致斷奶仔豬肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)與對照組比較顯著下降（P＜0.05），表明LPS引發(fā)了機體的免疫應激癥狀，導致免疫器官發(fā)育受阻，而抗菌肽CJH的介入有效解除了這一免疫抑制，說明其通過特定途徑緩解了機體的應激狀態(tài)。

3.2 不同處理對仔豬肝臟抗氧化功能的影響

肝臟內(nèi)若產(chǎn)生過多的自由基積聚，會導致肝臟氧化損傷，引起肝細胞功能紊亂[7]。GSH-Px、T-SOD和CAT是主要分布在細胞器膜上的抗氧化酶，由LPS誘導所產(chǎn)生的過量自由基通過攻擊細胞及細胞器的膜結構，不僅會導致細胞器發(fā)生功能性障礙，而且還會導致細胞膜結構受損，使得抗氧化酶失去發(fā)揮活性的載體，最終導致抗氧化酶活性喪失[8-9]。而MDA濃度升高則表明細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化程度較深。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS導致肝組織GSH-Px、T-SOD和CAT水平顯著降低（P＜0.05），且極顯著提高了肝臟中MDA的濃度（P＜0.01），該結果表明LPS導致肝組織發(fā)生了嚴重的氧化應激，后續(xù)的肝臟病理切片也證實了這一結論：肝組織發(fā)生明顯的病變與損傷。而CJH的介入有效的緩解了氧化應激的程度，肝臟的抗氧酶活性及MDA水平也得到了明顯的恢復，目前尚未有報道抗菌肽CJH具有直接參與抗氧化的功能，然而組織炎癥水平的升高會導致過量自由基的產(chǎn)生，間接引發(fā)氧化損傷，因此，接下來對肝組織炎性細胞因子的分泌水平進行了檢測。

3.3 不同處理對仔豬肝組織炎性細胞因子分泌及肝組織形態(tài)的影響

肝臟中的免疫細胞如巨噬細胞，枯否氏細胞可以識別病原體相關模式分子，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用[10]。當感染發(fā)生時，作為病原模式分子之一的LPS會與免疫細胞表面的受體CD14發(fā)生結合，并通過脂多糖結合蛋白（LBP）形成LPS-LBP-CD14三聯(lián)復合物，激活TLR4啟動跨膜信號轉導及相關促炎細胞因子的轉錄與合成，發(fā)揮促炎效應[11]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激極顯著提高了強致炎因子TNF-α的分泌（P＜0.01），顯著提高了致炎因子IL-1β和 IL-6的水平（P＜0.05），表明肝組織發(fā)生了明顯的炎癥反應。同時通過對肝組織進行HE染色的病理學觀察也證實了這一結論。通過抗菌肽CJH的介入，有效下調(diào)了肝組織炎性因子的分泌水平，同時明顯改善了肝臟的病理形態(tài)，這與此前關于抗菌肽CJH具有緩解炎癥的功能的報道保持一致[12]。至于抗菌肽是否能直接參與肝組織損傷修復，還有待進一步的研究。

4 結論

綜上所述，本試驗發(fā)現(xiàn)抗菌肽CJH可通過改善組織炎癥水平，緩解由LPS導致的仔豬肝臟氧化應激狀態(tài)，從而保護肝臟的抗氧化功能以及維持自身結構正常。