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    結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)(酶聯(lián)免疫法)臨床應(yīng)用探討

    2017-01-07 13:15:09楊成云涂志永丁超
    中國當(dāng)代醫(yī)藥 2016年30期
    關(guān)鍵詞:結(jié)核病

    楊成云++++++涂志永++++++丁超++++++李夢(mèng)君

    [摘要]目的 比較結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)(A.TB檢測(cè))和結(jié)核菌特異性抗體檢測(cè)在結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 選取2014年7月~2015年12月來我院感染科就診的結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者113例;選取同期我院體檢中心的健康志愿者20名作為對(duì)照。將其分為結(jié)核病組(65例)、非結(jié)核病組(48例)、健康志愿者組(20名),所有受試者均進(jìn)行平行檢測(cè),采用A.TB檢測(cè)和結(jié)核菌特異性抗體檢測(cè),非結(jié)核病組和健康對(duì)照組還要進(jìn)行PPD試驗(yàn)。結(jié)果 A.TB檢測(cè)對(duì)結(jié)核病輔助診斷的敏感度為86.27%,特異度為75.15%,結(jié)核菌特異性抗體檢測(cè)分別為73.91%和59.46%;兩種方法陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.941,P=0.047;χ2=5.268,P=0.022)。A.TB檢測(cè)及結(jié)核菌特異性抗體檢測(cè)均與PPD皮試結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.280,0.253,均P<0.05)。結(jié)論 A.TB檢測(cè)的敏感度和特異度均顯著優(yōu)于結(jié)核菌特異性抗體檢測(cè),綜合考慮A.TB檢測(cè)技術(shù)的開展要求,適合在各基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。

    [關(guān)鍵詞]結(jié)核病;γ干擾素釋放試驗(yàn)分析技術(shù);A.TB檢測(cè)

    [中圖分類號(hào)] R52 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721(2016)10(c)-0146-03

    [Abstract]Objective To compare the application value of specific cellular immune response to tuberculosis bacilli (A.TB detection) and Mycobacterium tuberculosis antibody in diagnosis of tuberculosis.Methods From July 2014 to December 2015,113 tuberculosis (TB) suspects who visited the infectious disease section of our hospital were recruited.During the same term,20 healthy volunteers were included as control.Of the 133 subjects,65 cases were in TB group,48 cases were in non-TB group and 20 cases were in control group.All subjects were tested by both A.TB and TB-Ab,while tuberculin skin test (TST) was performed among subjects in non-TB group and control group.Results The sensitivity and specificity of A.TB were 86.27% and 75.15%, respectively.While the sensitivity and specificity of TB-Ab were 73.91% and 59.46%,respectively.There were significant differences between those of A.TB and TB-Ab (χ2=3.941,P=0.047 and χ2=5.268,P=0.022,respectively).Both A.TB and TB-Ab had positive correlation with TST results (r=0.280,P<0.05 and r=0.253,P<0.05,respectively).Conclusion The performance sensitivity and specificity of A.TB are significantly superior to TB-Ab.According to A.TBs′test specification,A.TB is suitable for clinical application in primary hospitals at all levels.

    [Key words]Tuberculosis;Interferon gamma release assay;A.TB detection

    我國是結(jié)核病高發(fā)國家之一,每年新增結(jié)核病患者約150萬。因此結(jié)核病是我國重點(diǎn)控制的重大疾病之一,結(jié)核病的暴發(fā)將會(huì)給中國的公共衛(wèi)生安全帶來極大的威脅[1-3]。在結(jié)核病防治中,如何快速準(zhǔn)確地診斷結(jié)核是筆者面臨的最大難題之一。

    目前常用于臨床診斷的方法無法及時(shí)、有效地對(duì)結(jié)核病進(jìn)行診斷。近年來,γ干擾素釋放試驗(yàn)分析技術(shù)(IGRA)被用于結(jié)核病的診斷,已有研究顯示出了良好的應(yīng)用前景[4-5]。其中有兩種比較成熟的γ干擾素釋放試驗(yàn)方法,即酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)[6]。本研究選用結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)(A.TB)(酶聯(lián)免疫法)試劑,通過與傳統(tǒng)方法對(duì)比,探討其在臨床特別是在基層醫(yī)院中的應(yīng)用價(jià)值。

    1資料與方法

    1.1一般資料

    選取2014年7月~2015年12月來我院感染科就診的結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者113例;同期招募在我院體檢中心的健康志愿者20名進(jìn)行分組觀察及對(duì)照。

    具體分為:①結(jié)核病組65例,年齡18~59歲,平均(37.50±10.20)歲;男42例,女23例;伴有空洞15例,為肺結(jié)核或肺外結(jié)核患者,有典型的結(jié)核臨床癥狀,細(xì)菌學(xué)、病理學(xué)和影像學(xué)明確診斷,抗結(jié)核治療有效,抗結(jié)核治療時(shí)間≤4周。②非結(jié)核病組48例,年齡17~63歲,平均(42.22±13.90)歲;男36例,女12例;伴有空洞7例,為疑似結(jié)核病經(jīng)臨床或細(xì)菌學(xué)、病理學(xué)和影像學(xué)病理檢查排除結(jié)核病,無結(jié)核病史或接觸史,PPD試驗(yàn)陰性。③健康志愿者組20例,年齡17~20歲,平均(18.39±1.14)歲;男12例,女8例;在我院體檢中心體檢,身體健康,無結(jié)核病史或接觸史,PPD試驗(yàn)陰性。

    納入標(biāo)準(zhǔn):①符合“結(jié)核病”西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)或排外診斷標(biāo)準(zhǔn)者;②年齡17~65歲者;③依從性良好并自愿簽署知情同意書者。

    排除標(biāo)準(zhǔn):①合并心腦血管、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病及精神病患者;②對(duì)本試驗(yàn)用藥過敏者;③有人免疫缺陷病毒感染、急性病毒感染者;④有免疫抑制劑用藥史者;⑤妊娠婦女[7]。

    診斷標(biāo)準(zhǔn):依據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008)》《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南(2008年版)》《臨床診療指南·結(jié)核病分冊(cè)》[8]。

    所有受試者均同時(shí)進(jìn)行A.TB和結(jié)核菌特異性抗體檢測(cè),非結(jié)核病組和健康對(duì)照組還要進(jìn)行PPD試驗(yàn),所有受試者遵守赫爾辛基宣言和臨床藥理試驗(yàn)管理(GCP)規(guī)范,獲得南昌縣人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2儀器與試劑

    水浴鍋、酶標(biāo)儀、A.TB試劑盒(??诰S瑅璦生物研究院)、結(jié)合抗體試劑盒、結(jié)核菌素。

    1.3方法

    采用A.TB試劑盒進(jìn)行IGRA檢測(cè)。將肝素鈉抗凝的全血4 ml顛倒混勻,分別吸取1 ml全血加入陰性刺激劑(N)、陽性刺激劑(P)、ESAT-6和CFP-10(T) 3個(gè)反應(yīng)管中,將混勻后的N、P、T管在37℃水浴箱中培養(yǎng)22~24 h,取上清血漿50 μl分別加入已加好50 μl稀釋液的目標(biāo)孔中,37℃孵育1 h后洗板,分別加入100 μl檢測(cè)抗體工作液,37℃孵育30 min后再次洗板,分別加入100 μl親和素-辣根過氧化物酶,37℃孵育30 min后洗板,然后加入混合好的底物A與底物B 100 μl,37℃避光孵育10 min后加入100 μl終止液。15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取450 nm處的OD值,然后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到N、P和T 3個(gè)濃度值,再計(jì)算(T-N)/(P-N)值,當(dāng)N<0.5 IU/ml時(shí),(T-N)/(P-N)≥0.60時(shí)判為陽性;當(dāng)N≥0.5 IU/ml時(shí),(T-N)/(P-N)≥0.85時(shí)判為陽性。所有患者均行結(jié)核抗體和結(jié)核菌素檢測(cè)。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用百分率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn),兩種檢測(cè)方法與PPD試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性采用秩和相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1 A.TB試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

    對(duì)133例樣本進(jìn)行A.TB試驗(yàn)檢測(cè),結(jié)核病組檢出陽性56例,非結(jié)核病組檢測(cè)陽性16例,健康志愿者組檢測(cè)1例陽性。A.TB檢測(cè)對(duì)結(jié)核病輔助診斷的陽性預(yù)測(cè)值為86.27%,陰性預(yù)測(cè)值為75.15%。

    2.2 A.TB檢測(cè)與結(jié)核抗體結(jié)果的比較

    A.TB檢測(cè)對(duì)結(jié)核病輔助診斷的敏感度為86.27%,特異度為75.15%,結(jié)核菌特異性抗體檢測(cè)分別為73.91%和59.46%;兩種方法敏感度和特異度比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.941,P=0.047;χ2=5.268,P=0.022)。A.TB檢測(cè)及結(jié)核菌特異性抗體檢測(cè)均與PPD皮試結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.280,0.253,均P<0.05)(表1)。

    3討論

    結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人民健康的慢性傳染病,我國是全球22個(gè)結(jié)核病流行嚴(yán)重的國家之一,同時(shí)也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病流行嚴(yán)重的國家之一[9-10]。我國結(jié)核病患病人數(shù)居世界第二位,僅次于印度。結(jié)核病是我國重點(diǎn)控制的重大疾病之一,結(jié)核病的暴發(fā)會(huì)給中國的公共衛(wèi)生安全帶來極大的威脅[11]。

    結(jié)核病防治的最大挑戰(zhàn)之一是缺乏先進(jìn)的診斷工具,目前用于臨床診斷的方法包括痰培養(yǎng)、痰涂片、結(jié)核菌素試驗(yàn)、抗體檢測(cè)、PCR分子診斷、影像學(xué)檢查等,這些方法要么敏感度低,要么特異度低,無法有效地對(duì)結(jié)核桿菌的感染進(jìn)行診斷[12-14]。因此,臨床上結(jié)核病的誤診和漏診非常普遍,基層醫(yī)院更是如此。結(jié)核病的預(yù)防和治療,均迫切需要更敏感和特異的診斷技術(shù)[15]。近年來,IGRA被用于結(jié)核病的診斷成為熱點(diǎn)[16]。IGRA是一種用于結(jié)核桿菌感染的體外免疫檢測(cè)的新方法?,F(xiàn)有研究表明,IGRA不受卡介苗接種和非結(jié)核分枝桿菌感染的影響,在MTB感染(包括活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏感染)中的診斷價(jià)值較高[17]。美國CDC指南建議,在當(dāng)前應(yīng)用結(jié)核菌素試驗(yàn)PPD的所有情況下均可采用IGRA替代,多個(gè)大型公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)已將結(jié)核菌素試驗(yàn)PPD全部替換為IGRA。IGRA技術(shù)目前已獲得歐美國家FDA批準(zhǔn)認(rèn)證。

    IGRA技術(shù)目前有2種,包括基于全血細(xì)胞培養(yǎng)的ELISA和基于外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的ELISPOT。已有研究表明,兩者診斷性能相似,顯示出了良好的應(yīng)用前景。在2011年之前,全球僅有澳大利亞和英國以IGRA技術(shù)開發(fā)出來的產(chǎn)品。國內(nèi)多個(gè)研究集中在ELISPOT檢測(cè)技術(shù)上,對(duì)ELISA檢測(cè)技術(shù)方法的研究報(bào)道極少,且IGRA技術(shù)在基層醫(yī)院幾乎沒有開展。

    A.TB試劑盒是海口VTI生物研究院基于IGRA研發(fā)出的國內(nèi)首款體外細(xì)胞免疫診斷試劑盒,為ELISA檢測(cè)技術(shù),于2011年7月正式獲國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院高孟秋等[3]研究認(rèn)為,A.TB(ELISA)和T-SPOT.TB(ELISPOT)檢測(cè)的整體診斷性能相似,A.TB檢測(cè)在操作和結(jié)果判讀方面明顯優(yōu)于T-SPOT.TB檢測(cè),且對(duì)操作者的技能和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的要求較低。

    本研究結(jié)果顯示,A.TB檢測(cè)對(duì)結(jié)核病輔助診斷的敏感度為86.27%、特異度為75.15%,結(jié)核抗體檢測(cè)分別為73.91%和59.46%;兩種方法的陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.941,P=0.047;χ2=5.268,P=0.022)。A.TB檢測(cè)及結(jié)核抗體檢測(cè)均與PPD皮試結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.280,0.253,均P<0.05),與陳雪林等[17]的研究結(jié)果相符。

    綜上所述,A.TB試劑在結(jié)核病臨床輔助診斷中的應(yīng)用價(jià)值顯著高于結(jié)核菌特異性抗體檢測(cè),對(duì)結(jié)核病具有重要的輔助診斷價(jià)值,尤其適用于我國卡介苗接種的人群。對(duì)菌陰結(jié)核病,肺外結(jié)核和HIV/結(jié)核聯(lián)合感染,糖尿病合并結(jié)核病患者,以及結(jié)核病公共突發(fā)事件具有重要應(yīng)用價(jià)值,且對(duì)操作者的技能和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的要求也較低,適宜在基層醫(yī)院開展。

    [參考文獻(xiàn)]

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