關(guān)節(jié)腔注射用雷公藤甲素微球的制備與毒性評(píng)價(jià)

王麗娟++++++車坷科++++++張如超

[摘要]目的 評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)腔注射用雷公藤甲素微球的質(zhì)量和毒性。方法 采用乳化溶劑揮發(fā)法制備雷公藤甲素微球，透射電鏡觀察微球表面形態(tài)和大小，紅外光譜儀考察微球形成情況，馬爾文粒度儀測(cè)定微球粒度分布，HPLC測(cè)定包封率、載藥量，數(shù)學(xué)模型擬合微球體外釋放規(guī)律，血液學(xué)參數(shù)和生化指標(biāo)評(píng)價(jià)微球毒性。結(jié)果 微球形態(tài)圓整，大小均一，平均粒徑、包封率和載藥量分別為4.75 μm、（74.37±2.30）%、（1.53±0.27）%，微球釋放更符合Ritger-Peppas方程，與空白對(duì)照組相比，各項(xiàng)血液學(xué)參數(shù)和生化指標(biāo)未發(fā)生明顯改變。結(jié)論 雷公藤甲素微球可以作為關(guān)節(jié)腔注射用緩釋制劑的新型制劑。

[關(guān)鍵詞]雷公藤甲素；微球；毒性；關(guān)節(jié)腔注射

[中圖分類號(hào)] R943 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）10（c）-0004-05

[Abstract]Objective To evaluate the quality and toxicity of triptolide microspheres for intra-articular injection.Methods Triptolide microspheres was prepared by emulsion solvent evaporation method.Surface morphology and size of microspheres were observed by transmission electron microscope.The formation of microspheres was investigated with infrared spectrometer.Entrapment efficiency and drug loading was determined by HPLC.The release of microspheres in vitro was fitted by mathematical model.The toxicity of microspheres was evaluated using hematological parameters and biochemical indexes.Results The microspheres were spherical in shape with uniform size.The mean diameter，encapsulation efficiency and drug loading was 4.75 μm，（74.37±2.30）% and （1.53±0.27）% respectively.The release of microspheres was fit for Ritger-Peppas equation.There were no significant differences of blood test between microspheres and control group.Conclusion Triptolide microspheres might be used as a new preparation for intra-articular injection.

[Key words] Triptolide；Microspheres；Toxicity；Intra-articular injection

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種發(fā)病率高、致殘率高、嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的慢性全身性自身免疫性疾病，常出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)關(guān)節(jié)尤其是負(fù)重大關(guān)節(jié)反復(fù)腫脹、積液，因此，針對(duì)RA的局部關(guān)節(jié)靶向治療[1-3]具有重要的臨床意義。目前，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射是局部靶向治療RA最有效的給藥途徑，它將藥物直接輸送至受累關(guān)節(jié)，避免或減輕全身副作用，延長(zhǎng)藥物在關(guān)節(jié)內(nèi)的維持時(shí)間，以較小劑量發(fā)揮最大藥效。雷公藤甲素（triptolide，TPL），又叫雷公藤內(nèi)酯醇，是衛(wèi)矛科植物雷公藤的主要活性成分之一。基于TPL療效好但毒副作用大的特點(diǎn)，本文設(shè)計(jì)了TPL微球，即以TPL為模型藥物，以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）為載體材料，制成關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射用緩釋微球，以達(dá)到局部靶向于病變關(guān)節(jié)，延緩藥物釋放、減少給藥次數(shù)、減少全身副作用、增加治療效果和患者順應(yīng)性的目的。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

雷公藤甲素（純度99.8%，中國食品藥品檢定研究院，201404）；聚乳酸-羥基乙酸共聚物（50∶50，MW=15 000，山東醫(yī)療器械研究所，14092703），聚乙烯醇（PVA1788，山西三維集團(tuán)股份有限公司），吐溫-80（四川金山制藥有限公司），0.9%氯化鈉注射液（天圣制藥集團(tuán)股份公司），甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2儀器

電子分析天平（AR2140萬分之一，瑞士梅特勒-托利多），恒溫水浴磁力攪拌器（ZNCL-GS，河南愛博特科技發(fā)展有限公司），高速冷凍離心機(jī)（Avanti J-26XP，美國Beckman公司），冷凍干燥機(jī)（Coolsafe110-4pro型，丹麥labogene-Scanvac），shimadzu高效液相色譜儀（LC-10AT，日本島津公司），透射電子顯微鏡（JEM 2010，日本日立公司），馬爾文動(dòng)態(tài)粒度分析儀（Malvern ZEN 3600，英國馬爾文公司），傅里葉紅外光譜儀（Nicolet iS50，Thermo Fisher公司），壓片機(jī)（YP-2，上海山岳科技儀器有限公司），超純水機(jī)（Milli-Q Biocel A-10，美國Millipore公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭兔，雌雄不限，體重（2.1±0.2）kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)XCXK（渝）20120001。

1.4方法

1.4.1微球制備

采用溶劑揮發(fā)法制備TPL微球，將適量PLGA和TPL溶于二氯甲烷/甲醇的油相中，攪拌條件下緩慢滴加到含有一定量PVA的水相中，滴畢，繼續(xù)攪拌5～10 min，形成油/水（O/W）乳劑，加入同體積超純水，降低轉(zhuǎn)速，繼續(xù)攪拌4～6 h，待有機(jī)溶劑揮發(fā)完全后，微球固化。超速冷凍離心（12 000 r/min，4℃），洗滌，收集微球，冷凍干燥后即得微球干燥粉末?？瞻孜⑶蛑苽浞椒ㄍ?，不加TPL。

1.4.2微球形態(tài)觀察

取1滴微球混懸液，超純水分散，置銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸溶液染色，室溫晾干，用透射電子顯微鏡（TEM）觀察微球形態(tài)。

1.4.3微球粒徑大小及其分布

取適量微球混懸于生理鹽水中，用馬爾文動(dòng)態(tài)粒度分析儀測(cè)定粒徑分布及平均粒徑。

1.4.4傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析

對(duì)TPL、PLGA、TPL及PLGA物理混合物、TPL-PLGA微球，進(jìn)行FT-IR分析，采用溴化鉀壓片法，掃描范圍400～4000 cm-1，掃描次數(shù)64次，分辨率為4 cm-1。

1.4.5包封率及載藥量的測(cè)定

1.4.5.1色譜條件 SHIMADZU SPD-10AP 紫外檢測(cè)器，Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇-水（46∶54）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm；柱溫 30℃；流速 1.0 ml/min；進(jìn)樣量20 μl，外標(biāo)法定量。

1.4.5.2方法學(xué)考察 配制濃度分別為10、20、40、50、80 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以TPL濃度（C）對(duì)峰面積（A）進(jìn)行線性回歸。取10、40、80 μg/ml的TPL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定日內(nèi)（1 d內(nèi)測(cè)5次）和日間精密度（連續(xù)測(cè)定5 d）。精密量取濃度約為200 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、2、4 ml至10 ml容量瓶中，加入10 mg空白微球，流動(dòng)相稀釋，以測(cè)定量與實(shí)際加入量之比計(jì)算回收率。

1.4.5.3測(cè)定方法 精密稱取適量微球，加入少量二氯甲烷∶甲醇（9∶1），使微球完全溶解，超聲破壞、反復(fù)渦旋，待微球內(nèi)的藥物完全溶解，定容，離心，取上清液過濾后進(jìn)樣，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算TPL量，按公式計(jì)算包封率和載藥量：包封率=WTPL/W投×100%；載藥量= WTPL/W總×100%[WTPL：微球中包裹藥物量（mg）；W投：投藥量（mg）；W總：微球的總重量（mg）]。

1.5微球體外釋放

取微球適量，加2 ml生理鹽水，超聲分散，置透析袋內(nèi)，緊密封口，懸于10 ml釋放介質(zhì)中（PBS，pH=7.40，含1%吐溫-80）。釋放介質(zhì)安放于37℃恒溫水浴中，攪拌下分別于1、4、8 h，1、2、3、4、5、10 d取釋放介質(zhì)0.5 ml（取后補(bǔ)充等量新鮮釋放介質(zhì)），離心，上清液過濾后測(cè)定，以累積釋放率（Q）為縱坐標(biāo)，釋放時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)繪制體外釋放曲線并進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合。

1.6 微球毒性評(píng)價(jià)

12只新西蘭兔隨機(jī)分為3組（對(duì)照組、空白微球組、TPL微球組），TPL微球組按1 mg/kg的劑量關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射TPL微球，空白微球組注射同重量的空白微球，對(duì)照組注射0.9%氯化鈉溶液。注射后每日觀察兔的精神、活動(dòng)、食欲、體溫、皮毛和糞便情況。1周后，耳緣靜脈取血檢查，血液學(xué)檢查項(xiàng)目包括白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）、淋巴細(xì)胞百分比（L%）、中性粒細(xì)胞百分比（N%）；血液生化方面的指標(biāo)包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0，計(jì)量資料用x±s表示，組間差異采用F檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1微球制備條件的優(yōu)化

乳化-溶劑揮發(fā)法[4，5-7]是目前制備微球最常用的方法，本文考察了3個(gè)因素[8]（水相和油相體積比、油相PLGA的濃度[9]、水相PVA的濃度[10]）對(duì)微球性質(zhì)的影響。最終確定TPL微球的制備條件是水相與油相的體積比為4∶1，TPL與PLGA在油相中的比例為1∶9（w/w），PLGA濃度為100 mg/ml，PVA濃度為3%。

2.2微球粒徑測(cè)定和形態(tài)觀察

透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，微球呈圓形，形態(tài)規(guī)整，大小均勻，微球與微球之間無粘連，粒徑約為5 μm（圖1），馬爾文粒度測(cè)定儀測(cè)得微球平均粒徑為4.75 μm。

2.3傅立葉紅外光譜分析

圖2A中，TPL在1750 cm-1、3500 cm-1附近有較強(qiáng)的兩個(gè)特征吸收峰，分別是TPL的內(nèi)酯羰基峰和羥基峰[11]；圖2B中，PLGA在1600～1700 cm-1、2950～3000 cm-1、3500～3600 cm-1出現(xiàn)三個(gè)較強(qiáng)吸收，分別是羰基峰、C-H伸縮振動(dòng)和羥基峰；圖2C中，表現(xiàn)出TPL和PLGA的雙重特征吸收，1700 cm-1和3500 cm-1處的吸收變強(qiáng)、變寬；圖2D中，1750 cm-1處的特征吸收已經(jīng)消失，表現(xiàn)為PLGA的特征，3500 cm-1附近的吸收明顯變寬，這說明TPL已經(jīng)被包裹在PLGA中，且可能產(chǎn)生了相互作用。

2.4包封率和載藥量的測(cè)定

TPL的保留時(shí)間約為6.9 min，峰形較好，雜質(zhì)在該處無干擾。TPL在10.4～83.2 μg/ml范圍內(nèi)，濃度（C）與其峰面積（A）之間有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=80.89C-95.6（r=0.9987，n=5）。高、中、低三個(gè)濃度日內(nèi)和日間精密度RSD（%）分別為1.61%、1.37%、0.93%和2.31%、1.10%、0.99%（n =5），高、中、低三個(gè)濃度回收率分別為96.22%、98.58%、99.21%（n=3），RSD（%）分別為1.64%、0.63%、0.98%。以優(yōu)化條件制備了三批TPL-PLGA微球，平均包封率和載藥量分別為（74.37±2.30）%、（1.53±0.27）%。

2.5體外釋放考察

根據(jù)累積釋放率繪制微球體外釋放曲線（圖3）。數(shù)學(xué)模型擬合結(jié)果見表1。

2.6毒性研究

2.6.1兔全身情況

所有實(shí)驗(yàn)兔均存活，進(jìn)食情況正常，未見脫毛或腹瀉等現(xiàn)象，除注射第1天有5只兔體溫略高之外，其余時(shí)間體溫均正常。3組兔體重?zé)o明顯降低。

2.6.2 TPL微球?qū)ρＲ?guī)指標(biāo)的影響

表2是對(duì)照組、空白微球組和TPL微球組注射1周后測(cè)得的血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果顯示，除TPL微球組有2只動(dòng)物WBC水平略高于正常范圍之外，其余各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。3組血常規(guī)指標(biāo)之間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.6.3 TPL微球?qū)Ω?、腎功能的影響

表3是對(duì)照組、空白微球組和TPL微球組注射1周后測(cè)得的肝功能、腎功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果：除TPL微球組有1只動(dòng)物肝功能、腎功能異常（ALT、BUN水平略高于正常范圍，Cr水平略低于正常范圍）之外，其余各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。3組肝功能、腎功能指標(biāo)之間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物的溶解性、有機(jī)溶劑的組成與性質(zhì)、有機(jī)相與水相的比例、溫度、成球材料的濃度與組成、乳化劑的種類與濃度等均可影響微球質(zhì)量。水相體積增大（油/水比例降低），微球粒徑、包封率和載藥量呈現(xiàn)減小趨勢(shì)；PLGA濃度增加，微球粒徑、包封率和載藥量均有所增加；PVA濃度增大，粒徑、包封率和載藥量均趨向減小。

藥物體外釋放存在兩個(gè)階段，前24小時(shí)處于突釋階段[12-13]，TPL在此階段累積釋放量達(dá)32.61%，此后進(jìn)入緩慢釋放階段，到第10天時(shí)，總累積釋放率達(dá)62.14%。突釋原因可能是少量TPL結(jié)合在微球表面或包封在微球淺表層。后期緩釋階段，可能是由于微球內(nèi)部骨架結(jié)構(gòu)阻止了TPL擴(kuò)散，釋放速度主要依賴于PLGA骨架的降解，推測(cè)如果采用分子量更高的PLGA可能進(jìn)一步延緩TPL釋放[14]。微球體外釋藥更符合Ritger-Peppas模型[15]，即藥物釋放是藥物擴(kuò)散和骨架溶蝕協(xié)同作用的結(jié)果。

目前臨床上使用的雷公藤總皂苷片，其副作用主要表現(xiàn)在血液、肝腎功能和生殖系統(tǒng)方面的毒性[16-18]，因此，有必要對(duì)TPL微球是否可以改善這些方面的副作用進(jìn)行考察。表2顯示，除TPL微球組有2只動(dòng)物WBC水平略高于正常范圍之外，其余各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，3組血常規(guī)指標(biāo)之間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明TPL微球?qū)ρＲ?guī)指標(biāo)無明顯影響。表3顯示，除TPL微球組有1只動(dòng)物肝功能、腎功能異常（ALT、BUN水平略高于正常范圍，Cr水平略低于正常范圍）之外，其余各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3組肝功能、腎功能指標(biāo)之間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明TPL-PLGA微球?qū)ν玫母喂δ?、腎功能無明顯影響。

綜上所述，本文采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備了形態(tài)圓整的TPL微球，平均粒徑、包封率和載藥量分別為4.75 μm、（74.37±2.30）%和（1.53±0.27）%，體外釋放研究顯示微球第10天的總累積釋放率達(dá)62.14%，釋放行為符合Ritger-Peppas方程，毒性試驗(yàn)顯示微球?qū)ρＲ?guī)、血生化等各項(xiàng)指標(biāo)無明顯影響。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Horisawa E，Hirota T，Kawazoe S，et al.Prolonged anti-inflammatory action of DL-lactide/glycolide copolymer nanospheres containing betamethasone sodium phosphate for an intra-articular delivery system in antigen-induced arthritic rabbit[J].Pharm Res，2002，19（4）： 403-410.

[2]Horisawa E，Kubota K，Tuboi I，et al.Size-dependency of DL-lactide/glycolide copolymer particulates for intra-articular delivery system on phagocytosis in rat synovium[J].Pharm Res，2002，19（2）：132-139.

[3]Fernández-Carballido A，Herrero-Vanrell R，Molina-Martínez IT，et al.Biodergradable ibuprofen-loaded PLGA microspheres for intraarticular administration.Effect of Labrafil addition on release in vitro[J].Int J Pharm，2004，279（1-2）：33-41.

[4]Li Z，Huang L.Sustained delivery and expression of plasmid DNA based on biodegradable polyester，poly（D，L-lactide-co-4-hydroxy-L-proline）[J].J Contr Rel，2004，98（3）：437-446.

[5]Javier RV，Irene BO，Rocío HV，et al.Optimising the controlled release of dexamethasone from a new generation of PLGA-based microspheres intended for intravitreal administration[J].Eur J Pharm Sci，2016，92（9）：287-297.

[6]Guo WJ，Quan P，F(xiàn)ang L.Sustained release donepezil loaded PLGA microspheres for injection：preparation，in vitro and in vivo study[J].Asian J Pharm Sci，2015，10（5）：405-414.

[7]蔣朝軍，楊清敏，胡筱菲，等.新型利培酮PLGA微球的制備及體外釋放研究[J].中國藥學(xué)雜志，2011，46（2）：124-127.

[8]Mao S，Shi Y，Li L，et al.Effects of process and formulation parameters on characteristics and internal morphology of poly（d，l-lactide-co-glycolide） microspheres formed by the solvent evaporation method[J].Eur J Pharm Biopharm，2008，68（2）：214-223.

[9]Dhakar RC，Maurya SD，Aggarawal S.Design and evaluation of SRM microsphere of metformin hydrochloride[J].Pharmacie Globate，2010，1（7）：1-5.

[10]Suhaida MG，Yahya IB，Darmawati MY.Preparation of naltrexone hydrochloride loaded poly（DL-lactide-co-glycolide）microspheres and the effect of polyvinyl alcohol（PVA）as surfactant on the characteristics of the microspheres[J].Med J Malaysia，2004，59（Suppl B）：63-64.

[11]劉明，董靜，楊亞江，等.雷公藤甲素聚乳酸納米粒載藥體系的研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（2）：117-121.

[12]McGinity JW，O′Donnell PB.Preparation of microspheres by the solvent technique[J].Adv Drug Deliv Rev，1997，28（1）：25-42.

[13]O′Hagan DT，Jeffery H，Dams SS.The preparation and characterization of poly （lactide-co-glycolide）microparticles：Ⅲ.Microparticle/polymer degradation rates and the in vitro release of a model protein[J].Int J Pharm，1994，103（1）：37-45.

[14]Eliana L，F(xiàn)lavio F，Maria TB.Surface drug removal from ibuprofen-loaded PLA microspheres[J].Int J Pharm，2000， 196（1）：1-9.

[15]Ritger PL，Peppas NA.A simple equation for description of solute release Ⅱ.Fickian and anomalous release from swellable devices[J].J Contr Rel，1987，5（1）：37-42.

[16]馮群，孫蓉.雷公藤多苷片抗炎作用及伴隨肝毒性研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2014，25（6）：713-716.

[17]邱穎文，吳松武，吳賢仁.雷公藤多苷的不良反應(yīng)[J].西北藥學(xué)雜志，2004，19（5）：220- 222.

[18]賈傳春，王秀娟.雷公藤多苷片的臨床不良反應(yīng)[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2000，20（5）：316-317.