不同方法對(duì)苦瓜核糖體失活蛋白的PEG化學(xué)修飾后蛋白濃度測(cè)定的差異*

李 丹，肖 雪，鐘春燕，王 穎，何夏燕，王復(fù)林，金家貴，孟 堯

成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)

·論 著·

不同方法對(duì)苦瓜核糖體失活蛋白的PEG化學(xué)修飾后蛋白濃度測(cè)定的差異*

李 丹，肖 雪，鐘春燕，王 穎，何夏燕，王復(fù)林，金家貴△，孟 堯△

成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)

目的 探究PEG化學(xué)修飾對(duì)4種常用蛋白濃度測(cè)定方法的影響。方法 采用福林-酚試劑法(Lowry法)、二喹啉甲酸法(BCA法)、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)和紫外分光光度法(UV法)分別測(cè)定樣品中α-苦瓜素和抗人類免疫缺陷病毒植物蛋白MAP30經(jīng)PEG修飾前、后的蛋白含量；并用Lowry法和BCA法對(duì)低濃度游離PEG修飾前、后的樣品蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)考馬斯亮藍(lán)不與樣品發(fā)生顏色反應(yīng)，PEG修飾后會(huì)使UV法測(cè)定值變大，Lowry法測(cè)定值略有變大，BCA法基本不受影響；低濃度的游離PEG對(duì)測(cè)定方法無(wú)影響，但高濃度的PEG會(huì)吸附Folin-酚，形成黃色絮狀物。結(jié)論 PEG化學(xué)修飾對(duì)蛋白濃度測(cè)定方法影響最小的為BCA法，Lowry法最靈敏，Bradford法不適用；而PEG化學(xué)修飾會(huì)使UV法測(cè)定值增大20%～30%，可作為快速測(cè)定時(shí)的校準(zhǔn)參考。

PEG化學(xué)修飾；苦瓜籽；核糖體失活蛋白；蛋白濃度測(cè)定

α-苦瓜素(Alpha-momorcharin, α-MMC)和抗人類免疫缺陷病毒植物蛋白MAP30(momordica anti-HIV protein, MAP30)都是從苦瓜中提取分離得到的核糖體失活蛋白(ribosome inactive protein, RIP)，目前已有多篇研究[1-3]報(bào)道，上述兩種蛋白均有較強(qiáng)的抗病毒和抗腫瘤效果，特別是抗HIV作用顯著。目前這兩種蛋白已成為抗腫瘤和抗病毒藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。然而，在應(yīng)用于臨床時(shí)卻發(fā)現(xiàn)其具有明顯抗原性，且在體內(nèi)半衰期很短。本課題組研究[4-7]發(fā)現(xiàn)，利用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)化學(xué)修飾技術(shù)可較好解決上述問(wèn)題。我們?cè)诤罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，利用PEG修飾蛋白質(zhì)后，采取紫外分光光度法(UV法)快速測(cè)定蛋白含量，其值有顯著增加，用福林-酚試劑法(Lowry法)測(cè)定時(shí)結(jié)果相當(dāng)，且有時(shí)有黃色沉淀物析出，這對(duì)之后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀有較大影響。本研究利用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)和二喹啉甲酸法(BCA法)測(cè)定α-MMC和MAP30的濃度，并與UV法和Lowry法進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料 Folin-酚試劑、考馬斯亮藍(lán)G250、2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)購(gòu)自Sigma公司，總蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海生物制品研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。UNICOUV-2102PC型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)含石英材質(zhì)微量比色皿。α-MMC和MAP30蛋白樣品均由本實(shí)驗(yàn)室純化，(mPEG)2-Lys-NHS(20 kDa)購(gòu)于美國(guó)Shearwater Polymers公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 UV法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：在1組干的樣品管中，用0.9% NaCl將1 mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)分別稀釋至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。體積均為4 mL。用紫外可見分光光度計(jì)于280 nm處分別測(cè)定每一濃度的白蛋白溶液的吸光度值，以0.9% NaCl作為空白調(diào)基線，記錄所得讀數(shù)，作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。Bradford法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：先配制1 mg/mL的牛血清蛋白(BSA)母液，再往母液中加入磷酸緩沖液(PBS)配制1組濃度分別為1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL的BSA溶液，再將這組溶液稀釋10倍，待用。另量取1 mL的PBS溶液(BSA溶液濃度為0 mg/mL)作對(duì)照試驗(yàn)。靜置10 min后，測(cè)得這組BSA溶液的吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Lowry法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：參考文獻(xiàn)[8]，在1組干的樣品管中，分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(濃度為250 mg/ml)。用水補(bǔ)足到1.0 mL，然后每支試管加入5 mL試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫(20～25 ℃)放置10 min。再逐管加入0.5 mL試劑乙(folin-酚試劑)，同樣立即混勻，然后在室溫下放置30 min，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于595 nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。BCA法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：同上配制1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL共8個(gè)濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，后按照參考文獻(xiàn)[8]所述加入BCA工作液，根據(jù)測(cè)定值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 PEG修飾前、后蛋白含量測(cè)定 Lowry法，UV法，Bradford法以及BCA法操作參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，分別以各自標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白濃度。為保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程順利進(jìn)行并平行比較，本實(shí)驗(yàn)將Bradford法進(jìn)行了稍許改變，即取0～500 μg/mL的樣品100 μL加Bradford試劑2.5 mL，室溫放置2 min，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。同樣，BCA法和Lowry法也加入工作液2.5 mL。分別用4種方法測(cè)定α-MMC和MAP30修飾前和修飾后樣品含量；然后把單個(gè)樣品α-MMC等分為兩份，一份用PEG修飾，另一份添加不含PEG的硼酸硼砂緩沖液(pH=8.4)作為對(duì)照，檢測(cè)各自的蛋白含量；最后使用未活化的40 kDa PEG分子與α-MMC等濃度混合，探討PEG修飾劑濃度對(duì)測(cè)定方法的影響。

1.2.3 不同濃度PEG修飾后蛋白含量測(cè)定 低濃度組蛋白濃度為5 mg/mL，PEG∶α-MMC=1∶1(質(zhì)量比)和PEG∶MAP30=2∶1(質(zhì)量比)；高濃度組為α-MMC或MAP30蛋白濃度為5 mg/mL，PEG∶α-MMC=2∶1(質(zhì)量比)和PEG∶MAP30=4∶1(質(zhì)量比)，50 mM的硼酸-硼砂緩沖液(pH 8.5)，在室溫下不斷震搖反應(yīng)1 h。分離結(jié)合物的方法采用SP-Sepharose離子交換層析柱結(jié)合Sepharcyl S-100分子篩凝膠層析柱的方法，獲得的結(jié)合產(chǎn)物應(yīng)用1.2.2所述方法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 4種方法BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線比較

4種方法所測(cè)數(shù)據(jù)均線性良好，差異主要體現(xiàn)在有效范圍和靈敏度上，其中Lowry法標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率最大，靈敏度最高，但測(cè)定范圍窄，BCA法測(cè)定范圍大，UV法靈敏度較低(表1和圖1)。

2.2 PEG修飾前、后蛋白測(cè)定結(jié)果比較

Bradford法測(cè)定蛋白含量時(shí)，在PEG修飾前、后均未出現(xiàn)顏色變化，因此在595 nm波長(zhǎng)處沒有吸收峰；其他3種方法測(cè)定結(jié)果差異較小。PEG修飾后，其他3種方法的測(cè)定值均有所增加，其中UV法增加了32.7%，Lowry法增加了20.9%，BCA法增加了7.2%(表2和圖2)。

表1 4種方法BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線比較

圖1 4種方法BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 α-MMC樣品經(jīng)PEG修飾前后蛋白測(cè)定結(jié)果比較

2.3 PEG修飾劑濃度對(duì)測(cè)定方法的影響

低濃度的游離PEG對(duì)測(cè)定方法沒有影響(圖3)，但高濃度的游離PEG會(huì)吸附Folin-酚，形成黃色絮狀沉淀，且此時(shí)BCA法的測(cè)定結(jié)果低于Lowry法。

表2 4種樣品含量測(cè)定結(jié)果比較(mg/mL)

注:α-MMC與MAP30為同一批次苦瓜籽提取的蛋白，α-MMCsc和MAP30sc是同一批經(jīng)過(guò)PEG修飾的樣品。

圖3 PEG修飾劑濃度對(duì)測(cè)定方法的影響

3 討論

Lowry法利用蛋白質(zhì)與堿性硫酸銅作用形成銅-肽鍵絡(luò)合物，后者與色氨酸和酪氨酸共同作用，使酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸生成藍(lán)色化合物[9]；BCA法則利用蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，后者在堿性溶液中與BCA結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物；Bradford法屬于染料結(jié)合法，即考馬斯亮藍(lán)G250在酸性溶液中顯紅棕色，與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸以及芳香族氨基酸結(jié)合后轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，顏色深淺與蛋白濃度呈正比。UV法則是利用芳香族氨基酸在280 nm處有最大吸收峰[10]。上述4種檢測(cè)方法中，UV法操作簡(jiǎn)單且重復(fù)性好，Lowry法和BCA法次之。對(duì)于MAP30蛋白及其PEG修飾產(chǎn)物而言，BCA法測(cè)定值大于Lowry法，分析原因可能為MAP30蛋白與α-MMC蛋白在氨基酸組成上的差異所致。

此外，在蛋白質(zhì)PEG修飾反應(yīng)過(guò)程中，PEG分子結(jié)合到氨基酸上并釋放一個(gè)羥基琥珀酰亞胺(hydroxysuccinimide, NHS)基團(tuán)，該基團(tuán)在紫外具有部分吸收峰，所以UV法測(cè)定時(shí)讀數(shù)明顯增加。在Lowry法測(cè)定中，F(xiàn)olin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原產(chǎn)生深藍(lán)色混合物，在一定條件下顏色深度與蛋白質(zhì)的量呈正比，而Folin-酚易被游離的PEG分子結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)中酪氨酸和苯丙氨酸與Folin-酚試劑的結(jié)合，進(jìn)而對(duì)Lowry法測(cè)定值造成一定影響。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前學(xué)者關(guān)于PEG修飾HM-3測(cè)定蛋白含量的結(jié)果相一致[11-12]，這說(shuō)明無(wú)論哪種蛋白含量測(cè)定方法，其與蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)均有密切關(guān)系，隨PEG修飾劑分子量的增加及濃度的增高，所得濃度具有一定程度的變化，這在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需引起重視。由于PEG修飾反應(yīng)并不是完全的，因此在反應(yīng)后會(huì)存在一些游離的PEG分子，在一定程度上會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定造成影響，但本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的游離PEG對(duì)測(cè)定方法無(wú)影響。

綜上所述，BCA法是4種方法中最穩(wěn)定的一種，不受PEG修飾反應(yīng)影響，但靈敏度不高，且BCA試劑較昂貴。Lowry法靈敏度高，試劑獲取容易，但Folin-酚易被游離的PEG分子結(jié)合，在修飾程度不高時(shí)易造成較大誤差。Bradford法不發(fā)生顏色變化，不適用于苦瓜籽蛋白含量的測(cè)定，但其不反應(yīng)的原因還有待進(jìn)一步探究。UV法是一種實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)蛋白含量的方法，但相比其他方法誤差較大，且PEG反應(yīng)產(chǎn)生的NHS基團(tuán)會(huì)干擾測(cè)定，導(dǎo)致測(cè)定值有20%～30%的增加，同時(shí)NHS基團(tuán)的多少取決于PEG修飾的程度。對(duì)于PEG修飾反應(yīng)條件確定的實(shí)驗(yàn)流程，通過(guò)UV法與BCA方法的比較、受PEG修飾反應(yīng)的影響情況可建立換算公式，對(duì)UV法進(jìn)行校準(zhǔn)，從而簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)效率。

[1]Lee-Huang S, Huang P L, Nara P L,etal.MAP 30: a new inhibitor of HIV-1 infection and replication[J]. FEBS Letters, 1990, 272(1-2): 12-18.

[2]Zheng Y T, Ben K L, Jin S W. Alpha-momorcharin inhibits HIV-1 replication in acutely but not chronically infected T-lymphocytes[J]. Acta Pharmacologica Sinica,1999, 20(3): 239-243.

[3]Fang F F, Zhang C Z, Wong J H,etal. The MAP30 Protein from bitter gourd (Momordicacharantia) seeds promotes apoptosis in liver cancer cells in vitro and in vivo[J]. Cancer Letters, 2012, 324(1): 66-74.

[4]Meng Y, Yao X, Wang S,etal. Preparation and identifica-tion of monoclonal antibody against alpha-momorcharins[J]. Journal of Biomedical Engineering, 2011, 28(6): 1181-1184.

[5]Meng Y, Liu S, Li J,etal. Preparation of an antitumor and antivirus agent: chemical modification of α-MMC and MAP30 from Momordica Charantia L. with covalent conjugation of polyethylene glycol[J]. Int J Nanomedicine, 2012, 7: 3133-3142.

[6]Meng Y, Lin S, Liu S,etal. A novel method for simultaneous production of two ribosome-inactivating proteins, α-MMC and MAP30, from Momordica charantia L[J]. PLoS One, 2014, 9(7): e101998.

[7]姜忠義, 高蓉, 許松偉, 等. 藥物蛋白的聚乙二醇修飾[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2002, 37(6): 409-412.

[8]汪家政， 范明. 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M]. 北京，科學(xué)出版社, 2000:38-54.

[9]Redmile-Gordon M A, Armenise E, White R P,etal. A comparison of two colorimetric assays, based upon Lowry and Bradford techniques, to estimate total protein in soil extracts[J]. Soil Biol Biochem, 2013, 67(100): 166-173.

[10] 李力, 鄭意端. 蛋白藥物聚乙二醇化技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2003, 19(3): 226-229.

[11] Zhu B, Xu H M, Zhao L,etal. Site-specific modification of antiangiogenesis peptide HM-3 by polyethylene glycol molec-ular weight of 20kDa[J]. The Journal of Biochemistry, 2010, 148(3): 341-347.

[12] Liu Z, Ren Y, Pan L,etal. In vivo anti-tumor activity of polypeptide HM-3 modified by different polyethylene glycols (PEG)[J]. Int J Mol Sci, 2011, 12(4): 2650-2663.

Different Methods of Determining Protein Concentration of Ribosome-Inactivating Proteins After PEG Chemical Modification

LiDan,XiaoXue,ZhongChunyan,WangYin,HeXiayan,WangFulin,JinJiagui△,MengYao△.

SchoolofMedicalLaboratoryScience,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To study the effect of PEG chemical modification of proteins on the 4 different methods of determining the protein concentration. Methods The determination methods including the Folin-phenol method, bicinchoninic acid method, Coomassie brilliant blue method and ultraviolet spectrophotometry method were adopted to determine the protein content of Alpha-momorcharin (α-MMC) and momordica anti-HIV protein (MAP30) before and after chemical modification, and the Folin-phenol method and bicinchoninic acid method were used to determine the protein content of the samples modified by low concentration of PEG. Results There was no color change in Coomassie brilliant blue method. The PEG modification enhanced the values evidently in the ultraviolet spectrophotometry method, but it had no effect in the bicinchoninic acid method. Low density of free PEG has no effect on the determination method, but high density of PEG absorbed Folin-Phenol reagent and resulted in yellow sediment. Conclusion The PEG chemical modification has the least effect on the Folin-phenol method which is the most sensitive method. The Coomassie brilliant blue method is ineffective in assaying the samples. The PEG chemical modification will make the values increase by 20%～30% in the ultraviolet spectrophotometry method, which can be used as the fastest method though its values need calibration.

PEG chemical modification; Bitter melon seed; Ribosome-inactivating protein; Protein concentration determination

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160728.1836.024.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.011

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No: 201413705 019)；四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No：201613705026)

R446.1

A

△通信作者：孟堯，E-mail：myaoworks@foxmail.com；金家貴，E-mail： jinjiagui2014@126.com