糞便乳桿菌FZB1菌株的益生特性研究*

蘇森森,鄭 悅,高小潔,潘 渠

成都醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室(成都 610500)

·論 著·

糞便乳桿菌FZB1菌株的益生特性研究*

蘇森森,鄭 悅,高小潔,潘 渠△

成都醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室(成都 610500)

目的 研究糞便乳桿菌FZB1菌株的益生特性。方法 采用API 50 CH乳酸菌鑒定試劑條測定碳源利用能力。通過生長實驗測定糞便乳桿菌FZB1菌株的耐酸性和對不同膽鹽的耐受性。用熒光標(biāo)記法，以人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29作為體外模型，研究糞便乳桿菌FZB1菌株的黏附性能及對病原菌大腸桿菌E57黏附抑制性能。結(jié)果 試驗結(jié)果顯示，糞便乳桿菌FZB1菌株可利用多種碳源和乳糖，耐受pH 3.0的酸度，可在0.4%?；鞘懰徕c、0.08%膽酸鈉、0.15%禽膽鹽、0.15%脫氧膽酸鈉、0.15%?；蛆Z脫氧膽酸鈉和0.06%牛膽鹽環(huán)境中生長。糞便乳桿菌FZB1菌株對HT-29細(xì)胞的黏附率可達(dá)88.7%，能通過競爭、排斥、置換作用阻止大腸桿菌E57的黏附，黏附率分別為86.4%、79.5%和47.8%。結(jié)論 糞便乳桿菌FZB1菌株具有降解乳糖、耐酸、耐膽鹽和在腸道定植黏附的能力，適合在雞、鴨、鵝等家禽腸道中發(fā)揮益生作用。

益生菌；乳桿菌；黏附；益生特性

乳桿菌(Lactobacillus) 是一類安全無害的微生物，可黏附在腸道中，在腸道內(nèi)繁殖，具有維持動物腸道內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等特性，能對機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)、免疫反應(yīng)、生理功能等產(chǎn)生積極作用[1-2]，是重要的胃腸道益生菌。近年研究[3-6]發(fā)現(xiàn)腸道中的乳桿菌不僅對胃腸道環(huán)境發(fā)揮著益生作用，而且相關(guān)研究報道受試者服用長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriainfantis)等乳桿菌后， 宿主焦慮、抑郁、自閉、強(qiáng)迫癥等異常的心理精神癥狀得到改善，心理平衡得到維持，大腦學(xué)習(xí)和記憶能力增強(qiáng)，證實了補(bǔ)充乳桿菌可能成為預(yù)防和治療精神類疾病、改善宿主心理健康和促進(jìn)腦功能的安全有效措施。益生菌適應(yīng)腸道環(huán)境，具有耐膽鹽的能力。膽鹽種類有：膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；鞘懰徕c和牛磺鵝脫氧膽酸鈉等。不同動物腸道的膽鹽種類和濃度是不同的[7-9]，雞、鴨、鵝等家禽腸道中富含?；蛆Z脫氧膽酸鈉而沒有脫氧膽酸鈉，牛、羊等草食性動物的腸道中卻富含脫氧膽酸鈉且?；蛆Z脫氧膽酸鈉含量低下。益生菌對不同膽鹽的耐受性可能決定了它的宿主特異性。

糞便乳桿菌(Lactobacillusfaecis)是2013年發(fā)現(xiàn)的乳桿菌新種，分離自南非開普敦動物園中的豺和浣熊的糞便， 模式種為AFL13-2T(=JCM 17300T=DSM23956T)[10]。筆者從四川省富順縣的白鷺糞便樣品中分離鑒定到了1株糞便乳桿菌菌株FZB1[11],現(xiàn)已保存至中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為CGMCC 10515。目前對糞便乳桿菌的益生特性尚未有研究，本研究對糞便乳桿菌FZB1菌株的碳源利用能力、耐酸性、對不同種類膽鹽的耐受性、腸道黏附和拮抗病原菌能力進(jìn)行了實驗研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

試驗菌株糞便乳桿菌FZB1、臺灣福菜乳桿菌YM0097、白色葡萄球菌CICC10897和大腸桿菌E57由成都醫(yī)學(xué)院實驗室保存；人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29購自成都尚博生物試劑有限公司；膽鹽購自上海生工公司；異硫氰酸熒光素(FITC) 購自索萊寶公司；MoCoy′s Medium(1X) modified 培養(yǎng)液、0.25% 胰酶(EDTA)、胎牛血清(草原綠野生物)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板均購自成都豪乙生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、高速冷凍離心機(jī)購自美國Thermo公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株碳水化合物代謝分析 采用API 50 CH 乳酸菌鑒定試劑條對糞便乳桿菌FZB1菌株進(jìn)行碳源底物的利用能力測定。發(fā)酵后48 h觀察顏色的變化，由紫色變?yōu)辄S色判為陽性。對照為福菜乳桿菌YM0097菌株。

1.2.2 耐酸實驗 將連續(xù)2次活化后的菌株按4.0%(v/v)接種量，分別接種于pH 6.6、 2.0、3.0 的MRS、LB 液體培養(yǎng)基中，混勻后放置于37.0 ℃厭氧培養(yǎng)箱、搖床中培養(yǎng)，于0、1、2、3 h取樣，并作10倍濃度稀釋，耐酸實驗組和對照組均稀釋至10-5進(jìn)行平行平板涂布,培養(yǎng)48 h后,觀察進(jìn)行菌株生長情況[12]。

1.2.3 耐膽鹽實驗 將連續(xù)活化2次后的糞便乳桿菌FZB1菌株、白色葡萄球菌CICC10897 按4.0%(v/v)接種量，分別接種于濃度含0.03%、0.06%、0.08%、0.15%、0.20%、0.30%、0.40% 的牛膽鹽、?；鞘懰徕c、膽酸鈉、禽膽鹽、脫氧膽酸鈉、牛磺鵝脫氧膽酸鈉6種膽汁酸鹽的MRS、LB 液體培養(yǎng)基中，混勻后放置于37.0 ℃厭氧培養(yǎng)箱、搖床中培養(yǎng)，于0、1、2、3 h取樣，并作10倍濃度稀釋，耐酸實驗組和對照組均將濃度稀釋至10-5進(jìn)行平行平板涂布。經(jīng)48 h 培養(yǎng)后，觀察進(jìn)行菌株生長情況[12]。

1.2.4 細(xì)胞黏附能力 1)菌液準(zhǔn)備和細(xì)胞培養(yǎng):將糞便乳桿菌FZB1菌株、臺灣福菜乳桿菌YM0097 和大腸桿菌E57分別接種于MRS、LB 液體培養(yǎng)基中，于37.0 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再將生長至對數(shù)生長期的上述3株菌液，8 000 r/min 離心10 min(4 ℃)， 收集菌體，用無菌PBS 洗滌，將菌體重懸于PBS 緩沖液中。按照文獻(xiàn)[13-14] 方法進(jìn)行細(xì)菌熒光標(biāo)記。向上述準(zhǔn)備好的菌液中加入濃度為5.0 mg/mL異硫氰酸熒光素(FITC)中，用PBS 洗滌以去除未結(jié)合的FITC，將細(xì)菌懸浮于PBS 中，并調(diào)整細(xì)菌的終濃度為1.0×108CFU/mL[12]。HT-29細(xì)胞使用一次性培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，向培養(yǎng)瓶中加入2 mL含10%熱滅活的胎牛血清的MoCoy′s Medium細(xì)胞培養(yǎng)液，于37.0 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。黏附實驗時，將細(xì)胞接種于內(nèi)含滅菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中, 細(xì)胞接種密度約為5.0×104CFU /mL，長至單層細(xì)胞后進(jìn)行黏附試驗。試驗前用0.4%的臺盼藍(lán)染色液染色，用血細(xì)胞計數(shù)器在顯微鏡下檢測細(xì)胞的數(shù)量和活性，保證細(xì)胞活性在95.0%以上[12]。2) 黏附試驗:不加菌的細(xì)胞為空白對照，試驗組加入1 mL培養(yǎng)液及l(fā) mL熒光標(biāo)記的上述3株菌液，將培養(yǎng)板置于37.0 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，用無菌PBS 洗滌，洗脫未黏附的菌，再向每個培養(yǎng)孔中加入0.3 mL胰酶作用5 min，待細(xì)胞完全脫落，加入0.4 mL完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)。收集液體，用酶標(biāo)儀測定其熒光強(qiáng)度。吸收光波長為485 nm，發(fā)射光波長為530 nm。計算公式：細(xì)菌黏附率(%)=100×A/A0。式中：A為3株菌黏附HT-29 細(xì)胞并洗脫后細(xì)胞懸液的相對熒光強(qiáng)度；A0為3株菌黏附 HT-29 細(xì)胞前細(xì)胞懸液的相對熒光強(qiáng)度[12]。3)黏附抑制試驗:向12孔板每孔中加入以上調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液100 μL。通過熒光標(biāo)記法，采用競爭、排斥和置換試驗來研究糞便乳桿菌FZB1菌株和臺灣福菜乳桿菌YM0097 對大腸桿菌E57的黏附抑制作用[12]。

競爭： HT-29細(xì)胞+糞便乳桿菌FZB1菌株/臺灣福菜乳桿菌YM0097 (未標(biāo)記)+大腸桿菌E57(FITC標(biāo)記)，5%CO2、37.0 ℃共孵育1 h，離心去上清后，PBS洗滌3次，PBS重懸，轉(zhuǎn)移至黑色的12孔板，避光靜置。

排斥： HT-29細(xì)胞+糞便乳桿菌FZB1菌株/臺灣福菜乳桿菌YM0097(未標(biāo)記)，5%CO2、37.0 ℃共孵育1 h，離心去上清后，加入大腸桿菌E57(FITC標(biāo)記)，5%CO2、37.0 ℃共孵育1 h，其余操作同上。

置換： HT-29細(xì)胞+大腸桿菌E57(FITC標(biāo)記)，5%CO2、37.0 ℃共孵育1 h，離心去上清后，加入糞便乳桿菌FZB1菌株/臺灣福菜乳桿菌YM0097 (未標(biāo)記)，5%CO2、37.0 ℃共孵育1 h，其余操作同上。以上操作完成后，向每個培養(yǎng)孔中加入0.3 mL胰酶作用5 min，待細(xì)胞完全脫落，加入0.4 mL完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)。收集液體，用酶標(biāo)儀測定其熒光強(qiáng)度。計算公式：黏附率(%)=100×A2/A1。式中：A1為無糞便乳桿菌存在的情況下，黏附在HT-29細(xì)胞上的大腸桿菌E57的相對熒光強(qiáng)度；A2為糞便乳桿菌存在的情況下，黏附在HT-29細(xì)胞上的大腸桿菌E57的相對熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 菌株碳水化合物代謝分析結(jié)果

兩次實驗重復(fù)后，結(jié)果表明，糞便乳桿菌FZB1菌株碳水化合物代謝分析結(jié)果與對照組福菜乳桿菌YM0097菌株相比較，發(fā)酵D-甘露醇、七葉靈、D-蜜二糖、D-海藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-木糖的試驗結(jié)果不同，但實驗結(jié)果在一定程度上證明了糞便乳桿菌FZB1菌株可發(fā)酵乳糖等碳源產(chǎn)酸，使腸道處于酸性環(huán)境，對大腸桿菌、變形菌等致病菌具有拮抗作用；其發(fā)酵乳糖的特性可用于緩解乳糖不耐受(表1)。

表1 糞便乳桿菌FZB1菌株碳源利用特征

注: (+)：陽性；(w)：弱陽性； (-)：陰性

2.2 糞便乳桿菌FZB1菌株耐酸試驗結(jié)果

經(jīng)48 h培養(yǎng)后，糞便乳桿菌FZB1菌株在pH 3.0 強(qiáng)酸環(huán)境中能夠較好的存活；在pH 2.0強(qiáng)酸環(huán)境中，在1 h時仍能生長，其余時間段不生長?？梢?，糞便乳桿菌FZB1菌株可通過胃的酸性環(huán)境，順利到達(dá)腸道(表2)。

表2 不同pH 條件下菌株的存活狀態(tài)

注: (+)：有菌落生長； (-)：未長

2.3 糞便乳桿菌FZB1菌株耐膽鹽試驗結(jié)果

糞便乳桿菌FZB1菌株在不同動物來源、不同濃度的膽鹽環(huán)境中表現(xiàn)出不同的生長狀況。最高在濃度為0.06 %牛膽鹽、0.4%牛磺石膽酸鈉、0.08% 膽酸鈉、0.15% 禽膽鹽、0.15% 脫氧膽酸鈉、0.15%?；蛆Z脫氧膽酸鈉膽鹽環(huán)境中生長(表3)。試驗菌株糞便乳桿菌FZB1更適合在雞、鴨、鵝等家禽腸道中生存，而不太適合在豬、羊、牛等家禽腸道中生存(表4)。

表3 膽鹽耐受結(jié)果

注: (+)：有菌落生長； (-)：未長

表4 不同動物膽汁中膽汁酸成分

注: (+++)：主要成分；(++)：次要成分；(N)：尚不清楚

2.4 糞便乳桿菌FZB1菌株對HT-29細(xì)胞的黏附及對病原菌黏附的抑制

糞便乳桿菌FZB1菌株對小腸上皮細(xì)胞HT-29具有很強(qiáng)的黏附能力，黏附率可達(dá)88.7%，比對照組臺灣福菜乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株YM0097高11.8%，且能通過置換作用阻止大腸桿菌E57的黏附,相對置換率達(dá)9.9%，競爭或排斥作用總體上能促進(jìn)大腸桿菌E57對腸上皮細(xì)胞的黏附作用。福菜乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株YM0097能通過競爭、排斥、置換3種方式促進(jìn)大腸桿菌E57對腸上皮細(xì)胞的黏附作用。

表5 糞便乳桿菌FZB1菌株對HT-29細(xì)胞黏附以及對大腸桿菌E57黏附的影響

菌株黏附試驗競爭試驗排斥試驗置換試驗E5757.7±2.0257.7±2.0257.7±2.0257.7±2.02FZB188.7±1.01*86.4±1.7379.5±1.9547.8±1.04*YM009776.9±2.6572.1±3.4565.7±2.1264.1±1.83

注:與E57相比，*：P<0.01；無標(biāo)注：P<0.05

3 討論

不同動物的胃腸道環(huán)境本身存在一定差異性。在碳水化合物代謝實驗中，對照組福菜乳桿菌YM0097菌株的試驗結(jié)果符合既往研究[15]的報道，糞便乳桿菌FZB1菌株的結(jié)果也基本符合糞便乳桿菌模式種AFL13-2T(=JCM 17300T=DSM23956T)的生化試驗結(jié)果[10]，僅發(fā)酵D-半乳糖和水楊酸、D-甘露醇、熊果苷和D-海藻糖的試驗結(jié)果不同，推測這一差異可能與菌株來源于不同動物有關(guān)(表1)。腸道中膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%～0.30% 范圍波動。所以本次試驗設(shè)計膽鹽試驗濃度最高為0.4%，結(jié)合表4可知，不同動物來源腸道中膽汁、膽汁酸主要成分各不相同，針對此種情況進(jìn)行了試驗設(shè)計。試驗結(jié)果顯示，最高在濃度為0.06%牛膽鹽、0.4%牛磺石膽酸鈉、0.08% 膽酸鈉、0.15% 禽膽鹽、0.15% 脫氧膽酸鈉、0.15% 牛磺鵝脫氧膽酸鈉膽鹽環(huán)境中生長，結(jié)合表4，脫氧膽酸鈉、?；蛆Z脫氧膽酸鈉主要存在于雞、鴨、鵝等膽汁酸中；牛膽鹽主要存在于豬、牛膽汁酸中；?；鞘懰徕c主要存在于熊和人類膽汁酸中；膽酸鈉主要存在于狗、鴨、鵝、豬、羊、牛膽汁酸中[7-9]。綜合試驗結(jié)果表明，試驗菌株糞便乳桿菌FZB1在雞、鴨、鵝等家禽腸道中表現(xiàn)出良好的膽鹽耐受性，而在豬、羊、牛等家禽腸道中表現(xiàn)出的膽鹽耐受性欠佳，對不同動物來源膽鹽耐受性表現(xiàn)出差異，推測不同動物腸道需要不同的益生菌來適應(yīng)。

益生菌除了能耐受低pH 和高膽鹽的能力外，還必須能在腸道中定植黏附，這是益生菌能在腸道發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵。因此本研究使用體外培養(yǎng) HT-29細(xì)胞的方法來評價這株菌株的黏附能力及其對大腸桿菌 E57黏附抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，糞便乳桿菌FZB1菌株對小腸上皮細(xì)胞HT-29具有很強(qiáng)的黏附能力，黏附率可達(dá)88.7%，比研究[16]報道的格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)對小腸上皮細(xì)胞Caco-2黏附率高約13.4%，但格氏乳桿菌卻能通過排斥作用阻止病原菌大腸桿菌K88的黏附，排斥率達(dá)58.0%；比白潔等[12]報道的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、食果糖乳桿菌(Lactobacillusfructivorans)對Caco-2細(xì)胞黏附率超出31.0%,12.0%左右，比鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)通過置換作用減少鼠傷寒沙門氏菌黏附的相對置換率低17.5%；比食果糖乳桿菌(Lactobacillusfructivorans)通過置換作用減少鼠傷寒沙門氏菌黏附的相對置換率高1.7%；郭彤等[17]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌黏附Caco-2細(xì)胞的數(shù)量在1 h內(nèi)基本達(dá)到飽和，且對病原菌K88和豬霍亂沙門氏菌生長均有很強(qiáng)的抑制作用,抑制率均達(dá)到100%?？梢?，不同的益生菌對小腸上皮細(xì)胞和對病原菌黏附抑制作用表現(xiàn)出差異。實驗結(jié)果在一定程度上證明了糞便乳桿菌FZB1菌株對小腸上皮細(xì)胞HT-29具有很強(qiáng)的黏附能力，對病原菌大腸桿菌E57黏附抑制作用也較好。

綜上所述，筆者初步認(rèn)為，分離得到的糞便乳桿菌FZB1菌株具備降解乳糖、耐酸、耐膽鹽、能在雜食類動物如鵝、鴨、雞的腸道定植黏附的能力。隨著對其益生特性的深入研究，此菌株將有希望作為益生菌，不僅可以維持腸道微生態(tài)環(huán)境平衡，還可以將其以飼料添加劑的形式運(yùn)用到雜食類動物如鵝、鴨、雞的養(yǎng)殖中，促進(jìn)國內(nèi)微生物飼料添加劑的蓬勃發(fā)展。

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A Study on the Probiotic Properties of FZB1 Strains of Lactobacillus Faecis

SuSensen,ZhengYue,GaoXiaojie,PanQu△.

DepartmentofPathogenicBiology,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To analyze the probiotic properties of FZB1 stains ofLactobacillusfaecis. Methods The API 50 CH system was used to determine the utilization of carbon sources. The growth experiment was adopted to detect the FZB1 stains′ acid tolerance and their tolerance to different bile salts. The fluorescence labeling method was used to investigate the adhesive properties and the inhibitory effect on the adherence of pathogen with the HT-29 cell line as an in vitro model. Results The results showed that the FZB1 stains ofLactobacillusfaeciswere capable of using various carbon sources and lactose, being resistant to pH 3.0, and growing in 0.4% taurolithocholic acid sodium, 0.08% sodium cholate, 0.15% poultry bile salt, 0.15% sodium deoxycholate, 0.15% taurocholate chenodeoxycholic acid sodium and 0.06% bile salt respectively. The results of adhesion showed that the rate of the FZB1 strains′ adhesion to the HT-29 cell line was 88.7%, and the FZB1 strains inhibited the adhesion ofEscherichiacoliE57by means of competition, exclusion and replacement with the adhesion rates of 86.4%, 79.5% and 47.8% respectively. Conclusion The FZB1 strains ofLactobacillusfaecisis capable of lactose degradation, acid tolerance, bile salt tolerance and adhesion to intestinal colonization, and their probiotic properties have a beneficial effect on the intestines of the poultry such as chicken, ducks, geese, etc.

Probiotics;Lactobacillus; Adhesion; Probiotic property

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161125.1106.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.001

國家自然科學(xué)基金面上項目資助(No:31170007)；四川省教育廳科技基金重點(diǎn)項目資助(No:14ZA0219)

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△通信作者：潘渠，E-mail: ppqlove@126.com