不同菌株對(duì)鎘的吸附效果

吳 優(yōu)，徐鳳花，張?zhí)N琦，張書(shū)敏

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

不同菌株對(duì)鎘的吸附效果

吳 優(yōu)，徐鳳花*，張?zhí)N琦，張書(shū)敏

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

[目的]篩選對(duì)鎘有高耐性的菌株，為探究重金屬污染微生物修復(fù)技術(shù)提供理論依據(jù)。[方法]以DN-1和DN-2為供試菌株，在不同培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH、鎘離子初始濃度的條件下，研究不同菌株對(duì)鎘離子的吸附效果。[結(jié)果]培養(yǎng)3 d時(shí)菌株DN-1和DN-2對(duì)鎘離子的吸附率最大，分別為61.92%和89.57%；2種菌株對(duì)鎘離子的最佳吸附溫度為30 ℃。菌株DN-1和DN-2分別在pH為8和6時(shí)吸附率最高；鎘離子初始濃度為80～200 mg/L時(shí)，DN-2吸附率明顯高于DN-1。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)處理的菌株相比，經(jīng)鎘離子處理后的菌株細(xì)胞表面及胞內(nèi)有沉淀物聚集，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。[結(jié)論]菌株DN-1和DN-2對(duì)鎘離子具有一定耐受性，吸附效果明顯。胞外吸附和胞內(nèi)沉淀可能是菌株吸附重金屬的重要途徑。

鎘離子；菌株；吸附率

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，對(duì)食品安全的關(guān)注日益增強(qiáng)，在影響食品安全的諸多因素中，土壤重金屬污染尤為突出。我國(guó)土壤重金屬污染形勢(shì)嚴(yán)峻，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)受到鎘、砷、鉛、鉻、汞等重金屬污染的耕地近2 000萬(wàn)hm2，約占總耕地面積的20%。每年因重金屬污染的糧食達(dá)1 200萬(wàn)t，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)200億元，在各種重金屬污染中以鎘的污染最為突出。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境研究所教授潘根興和他的研究團(tuán)隊(duì)，在全國(guó)6個(gè)地區(qū)(華東、東北、華中、西南、華南和華北)縣級(jí)以上市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)大米樣品91個(gè)，結(jié)果表明，10%左右的市售大米鎘超標(biāo)[1]。植物吸收富集于土壤中的鎘可使農(nóng)作物中鎘含量升高，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體。鎘在人體中積蓄的毒性，潛伏期可長(zhǎng)達(dá)10～30年。因此，治理鎘污染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

與物理、化學(xué)和植物修復(fù)方法相比，微生物修復(fù)技術(shù)高效低耗，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染，能夠改善土壤微生物環(huán)境，且微生物在物種資源豐富、繁殖速度快、遺傳特性易于改變、易于工業(yè)化生產(chǎn)且生產(chǎn)成本低等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因此具有良好的生態(tài)效益和廣闊的應(yīng)用前景[2-7]。研究表明，微生物對(duì)鎘等重金屬具有較好的吸附性。微生物的吸附性能主要由生物量的特性、目標(biāo)重金屬的物理化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)發(fā)生的小環(huán)境(如溶液的初始pH、溫度和其他離子的相互作用)等因素決定，深入研究微生物對(duì)重金屬的吸附特性，對(duì)于凈化重金屬污染環(huán)境具有重要意義[8]。因此，筆者在不同培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH及鎘離子初始濃度的條件下，篩選對(duì)鎘具有高耐性的菌株，以期為重金屬污染修復(fù)提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院應(yīng)用微生物研究室篩選菌株，分別標(biāo)注為DN-1和DN-2。原子吸收分光光度計(jì)(島津A-800)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)不同培養(yǎng)時(shí)間(1、2、3、4、5 d)，溫度(10、20、30、40 ℃)，pH(4、5、6、7和8)及鎘離子初始濃度(0、80、120、160、200、240 mg/L)，研究其對(duì)菌種吸附效果的影響。

空白處理：2個(gè)不同菌株分別做1組空白對(duì)照，標(biāo)記為K1、K2?？瞻讓?duì)照培養(yǎng)基中不加鎘離子，只加入對(duì)應(yīng)菌株的菌懸液。

1.3 吸附試驗(yàn)

1.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鎘離子吸附的影響。將10 mL菌懸液分別接入含鎘離子160 mg/L(1.42 mmol/L)的溶液中，于30 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)1、2、3、4、5 d，然后于5 000 r/min離心5 min，取上清液，用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鎘離子殘留量。

1.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)鎘離子吸附的影響。將10 mL菌懸液分別接入含鎘離子160 mg/L(1.42 mmol/L)的溶液中，在200 r/min搖床分別于10、20、30、40 ℃培養(yǎng)3 d，然后于5 000 r/min離心5 min，取上清液，測(cè)定鎘離子殘留量。

1.3.3 pH對(duì)鎘離子吸附的影響。用1 mol/L NaOH和HNO3將含鎘離子160 mg/L(1.42 mmol/L)溶液的pH分別調(diào)至4、5、6、7、8，以自然pH為對(duì)照。將10 mL菌懸液分別接入含鎘離子160 mg/L(1.42 mmol/L)的溶液后置于30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)3 d，然后5 000 r/min離心5 min，取上清液，測(cè)定鎘離子殘留量。

1.3.4 鎘離子初始濃度對(duì)菌種吸附的影響。將10 mL不同菌懸液分別接入鎘離子濃度40、80、120、160、200、240 mg/L(0.36～2.14 mmol/L)的溶液中，于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)3 d，然后于5 000 r/min離心5 min，取上清液，測(cè)定鎘離子殘留量，以不加菌體的鎘離子溶液作為對(duì)照。所有試驗(yàn)均做3次重復(fù)。

1.4 鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成濃度為1、2、3、4、5 mg/L的鎘離子溶液，用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鎘離子濃度，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線校正儀器誤差(其中檢出限≤0.005 μg/mL，精密度≤1%)。測(cè)定前，鎘離子溶液要用去離子水適當(dāng)稀釋?zhuān)源_保樣品中鎘離子濃度與吸光度呈線性關(guān)系。計(jì)算公式：

Q=(C0-C)/C0×100%

式中，C0為溶液中鎘離子的初始濃度；C為經(jīng)菌體吸附后溶液中鎘離子的濃度；Q為菌種對(duì)鎘離子的吸附率。

圖1 鎘離子原子吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of atomic absorption of Cd2+

1.5 透射電鏡觀測(cè)方法 將樣品菌懸液稀釋至適宜的濃度后用帶支持膜的銅網(wǎng)滴片，然后進(jìn)行吸附，磷鎢酸染色數(shù)分鐘后，用濾紙吸干染液，在37 ℃下干燥0.5 h后置于透射電子顯微鏡下觀察菌體超微形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鎘離子吸附的影響 從圖2可見(jiàn)，DN-1、DN-2對(duì)鎘離子的吸附率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后減小的趨勢(shì)。DN-2培養(yǎng)2 d后吸附率迅速增大，培養(yǎng)3 d較培養(yǎng)1 d的吸附率高40.66百分點(diǎn)，說(shuō)明該階段主要是菌株表面的吸附作用，這種作用的特點(diǎn)是快速、可逆、不依賴(lài)能量代謝[9]。第3天DN-1和DN-2對(duì)鎘離子的吸附率最大，分別為61.92%和89.57%，3 d后吸附率降低，4 d后吸附率趨于平穩(wěn)。這是由于吸附初期菌體表面空白吸附位點(diǎn)較多，鎘離子可與菌體表面的吸附位點(diǎn)快速結(jié)合，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附位點(diǎn)逐漸飽和，開(kāi)始進(jìn)行吸附過(guò)程緩慢的胞內(nèi)吸附。這一規(guī)律基本符合“吸附+細(xì)胞膜傳輸”模型，即菌體對(duì)重金屬的吸附分為2個(gè)階段：①不依靠細(xì)胞代謝直接結(jié)合在細(xì)胞表面，這一過(guò)程迅速；②依靠細(xì)胞代謝向細(xì)胞內(nèi)的傳輸，這一過(guò)程緩慢[10]。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鎘離子吸附的影響Fig.2 Effect of culture time on the adsorption of Cd2+

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)鎘離子吸附的影響 從圖3可見(jiàn)，DN-1和DN-2對(duì)鎘離子的吸附率隨培養(yǎng)溫度的升高呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí)，DN-1、DN-2對(duì)鎘離子的吸附率隨著溫度的增加而迅速增大，30 ℃時(shí)吸附率最大，為61.04%和89.57%，較10 ℃時(shí)分別增加24.24%和58.80%。這可能是由于在高溫條件下，菌體的一些吸附位點(diǎn)被活化，吸附位點(diǎn)數(shù)量增加，此外生物吸附是吸熱反應(yīng)過(guò)程，溫度升高也有利于吸附平衡向吸熱方向移動(dòng)[11]。在高溫條件下，菌體的一些吸附位點(diǎn)被活化，吸附位點(diǎn)數(shù)量增加；當(dāng)溫度高于30 ℃，隨著溫度的增加菌株對(duì)鎘離子的吸附率大幅度下降，40 ℃時(shí)較最大吸附率分別降低13.05和22.69百分點(diǎn)，表明高溫條件抑制了菌株對(duì)鎘離子的吸附。贠妮等[12]研究表明，鎘的吸附與菌體的生長(zhǎng)有關(guān)，溫度過(guò)高不利于菌體生長(zhǎng)。筆者研究發(fā)現(xiàn)，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制菌體對(duì)鎘離子的吸附，菌體的最佳吸附溫度為30 ℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)鎘離子吸附的影響Fig.3 Effect of culture temperature on the adsorption of Cd2+

2.3 pH對(duì)鎘離子吸附的影響 從圖4可見(jiàn)，DN-1對(duì)鎘離子的吸附率在一定范圍內(nèi)隨著pH的升高而增大，DN-2在pH小于6時(shí)對(duì)鎘離子的吸附率呈增大趨勢(shì)，當(dāng)pH大于6時(shí)吸附率逐漸下降。菌株DN-1在pH為8時(shí)吸附率最大，為89.64%，較pH為6時(shí)提高了14.88百分點(diǎn)。DN-2在pH為6時(shí)吸附率達(dá)89.57%，較最低吸附率提高29.05百分點(diǎn)，當(dāng)pH增加到8時(shí)吸附率迅速下降至61.90%，較最大吸附率下降27.67百分點(diǎn)。由此可知，DN-1在中性及弱堿性條件下對(duì)鎘離子的吸附率較高，DN-2在弱酸性條件下吸附率較高，吸附效果較好?？梢?jiàn)，pH是影響菌體生長(zhǎng)的重要因素，不同微生物對(duì)環(huán)境的酸堿度適應(yīng)性有差異，pH過(guò)低將抑制菌體生長(zhǎng)，阻礙對(duì)重金屬的吸附。這與樊霆等[13]對(duì)重金屬抗性及富集的研究結(jié)果一致。

圖4 pH對(duì)鎘離子吸附的影響Fig.4 Effect of pH value on the adsorption of Cd2+

2.4 鎘離子初始濃度對(duì)鎘離子吸附的影響 從圖5可見(jiàn)，鎘離子初始濃度為40～160 mg/L時(shí)DN-2的吸附率呈緩慢增大趨勢(shì)，符合Langmuir單分子層吸附行為[14]。當(dāng)鎘離子濃度為160 mg/L時(shí)，DN-2對(duì)鎘離子吸附率最大，達(dá)89.57%，之后隨鎘離子濃度的升高呈下降趨勢(shì)。這是由于

鎘離子濃度的升高增大了其與菌株吸附位點(diǎn)的碰撞幾率，當(dāng)鎘離子初始濃度繼續(xù)升高時(shí)，由于吸附位點(diǎn)數(shù)量一定，達(dá)到最佳吸附狀態(tài)后，吸附能力有所下降。也可能是由于鎘離子初始濃度繼續(xù)增加，毒性增強(qiáng)，抑制了菌株的生長(zhǎng)代謝甚至導(dǎo)致死亡，致使吸附能力減弱。這一規(guī)律與邱云云等[15]嗜麥芽窄食單胞菌對(duì)鎘的吸附試驗(yàn)結(jié)果一致。DN-1的吸附率隨鎘離子濃度的升高呈遞減趨勢(shì)，當(dāng)鎘離子濃度為80～200 mg/L時(shí)，吸附率明顯低于DN-2。這可能是由于不同菌株表面有不同的重金屬吸附受體，不同的受體吸附重金屬的種類(lèi)有差異，從而使DN-1、DN-2對(duì)鎘離子的吸附效果差異明顯。

圖5 鎘離子初始濃度對(duì)鎘離子吸附的影響Fig.5 Effect of initial concentration of heavy metals on the adsorption of Cd2+

2.5 超微形態(tài)觀察 透射電鏡觀察菌株DN-1、DN-2吸附鎘離子前后的細(xì)胞變化特征，結(jié)果如圖6所示。在未經(jīng)鎘

注：a、b分別為K1處理和經(jīng)過(guò)鎘離子處理的DN-1的透射電鏡照片；c、d分別為K2處理和經(jīng)過(guò)鎘離子處理的DN-2的透射電鏡照片。Note：a，b.Transmission electron microscope photograph of strain DN-1 processed by K1 and Cd2+，respectively; c，d.Transmission electron microscope photograph of strain DN-2 processed by K2 and Cd2+，respectively.圖6 菌株DN-1和DN-2的超微形態(tài)觀察Fig.6 Ultrastructural observation of strain DN-1 and DN-2

離子處理的條件下，菌株DN-1細(xì)胞表面光滑，胞內(nèi)充實(shí)，細(xì)胞表面及胞內(nèi)無(wú)沉淀物質(zhì)(圖6a)，經(jīng)鎘離子處理后胞內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒物，微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，部分細(xì)胞的細(xì)胞壁被破壞，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外流(圖6b)。這表明胞內(nèi)沉淀可能是DN-1吸附鎘離子的重要途徑，一定濃度的鎘離子處理會(huì)抑制菌株細(xì)胞正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致破裂或死亡。從圖6c和圖6d可見(jiàn)，DN-2在無(wú)鎘離子處理?xiàng)l件下，細(xì)胞表面光滑，胞內(nèi)物質(zhì)均勻且細(xì)胞表面無(wú)沉淀物質(zhì)覆蓋，經(jīng)鎘離子處理后的菌體細(xì)胞呈不規(guī)則的凸起或彎曲狀，同時(shí)細(xì)胞膜與細(xì)胞壁明顯分離，細(xì)胞內(nèi)可能發(fā)生變性反應(yīng)。推測(cè)鎘離子的一部分被吸附在細(xì)胞壁表面，一部分在胞內(nèi)形成金屬沉淀物，表明DN-2對(duì)鎘離子有表面吸附和胞內(nèi)富集兩種作用，且一定濃度的鎘離子處理會(huì)給菌株的細(xì)胞帶來(lái)?yè)p傷，使菌體出現(xiàn)凋亡特征。林曉燕等[16]研究了銅綠假單胞菌吸附鎘的機(jī)理，結(jié)果表明，鎘處理后的菌體表面粗糙，出現(xiàn)不規(guī)則凸起，有大量沉淀物聚集；孫靜等[17]研究表明，地衣芽孢桿菌抗鎘和富集鎘的機(jī)制是菌體表面的功能基團(tuán)、表面分泌物聚集和富集鎘離子，以及將鎘離子運(yùn)輸?shù)骄w內(nèi)部進(jìn)行富集。

3 結(jié)論

微生物對(duì)重金屬的吸附效果與時(shí)間、溫度、pH及重金屬離子的初始濃度有關(guān)。不同微生物對(duì)鎘離子的吸附存在一定差異，且在不同培養(yǎng)條件下差異明顯。從吸附率隨吸附時(shí)間的變化來(lái)看，菌株對(duì)鎘離子的吸附呈先快后慢的過(guò)程，基本符合“吸附+細(xì)胞膜傳輸”模型，即菌體對(duì)重金屬的吸附分為不依靠細(xì)胞代謝直接結(jié)合在細(xì)胞表面和依靠細(xì)胞代謝向細(xì)胞內(nèi)的傳輸過(guò)程。溫度與菌株吸附率的變化曲線符合微生物生長(zhǎng)條件且與微生物生長(zhǎng)的吸熱反應(yīng)規(guī)律具有一致性。菌株DN-1適宜在弱堿性條件下吸附鎘離子，菌株DN-2在弱酸性條件下對(duì)鎘離子的吸附效果更好。DN-2在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)鎘離子的吸附率明顯高于DN-1，這可能是由于DN-2耐鎘性強(qiáng)且表面具有對(duì)鎘離子吸附性較好的受體，因此DN-2是對(duì)鎘離子吸附極具潛力的微生物。參考文獻(xiàn)

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Effect of Different Strains on the Adsorption of Heavy Metal Cadmium

WU You, XU Feng-hua*, ZHANG Yun-qi et al

(College of Resources and Environment, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030)

[Objective] The aim was to screen out strain with high tolerance to cadium, to provide theoretical basis for remediation technology of heavy metal contaminated microorganism. [Method] With DN-1 and DN-2 as tested strains, under different conditions of culture time, temperature, pH, initial concentration of Cd2+solution, the effect of different strains on the adsorption of Cd2+was studied. [Result] The results showed that under certain experimental conditions, when cultured for three days the adsorption rate of DN-1 and DN-2 to Cd2+was the highest, which were 61.92% and 89.57%, respectively;The optimum adsorption temperature was 30 ℃. The optimum pH of DN-1 and DN-2 was 8 and 6; When the initial concentration of Cd2+was 80-200 mg/L range, DN-2 adsorption rate was significantly higher than that of DN-1. Through the transmission electron microscope observation can found that after Cd2+treatment, the cell surface and intracellular accumulation of sediment compared with untreated strains, the internal structure of cells changed obviously. [Conclusion] DN-1 and DN-2 strains have a certain tolerance to cadmium ions, and the adsorption effect is obvious. Extracellular adsorption and intracellular precipitation may be an important way for the strain to adsorb heavy metals.

Cd2+; Strain; Adsorption rate

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD14B06)；哈爾濱市科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2014DB3BN037)。

吳優(yōu)(1992- )，女，河南南陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：農(nóng)業(yè)廢棄物無(wú)害化處理與肥料化利用。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事農(nóng)業(yè)微生物研究。

2016-11-14

S 182

A

0517-6611(2016)35-0087-03