serp1對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

馮麗帥++王倩倩++馬旭++魏麗++王建波

[摘要] 目的 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白1（serp1）對(duì)體外過(guò)氧化氫誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。 方法 體外培養(yǎng)的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞均勻種于6孔板內(nèi)，分為空質(zhì)粒組、空質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組、serp1質(zhì)粒組、serp1質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康母鹘M加入不同濃度的過(guò)氧化氫。用PI/hochest熒光染色法對(duì)400 μmol/L過(guò)氧化氫組進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)；采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)100 μmol/L過(guò)氧化氫組進(jìn)行傷口修復(fù)情況；采用Western blot法觀察serp1過(guò)表達(dá)對(duì)GLP-1R表達(dá)的影響。 結(jié)果 serp1質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率明顯低于空質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組，而修復(fù)率卻明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒過(guò)氧化氫組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；serp1質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組GLP-1R表達(dá)明顯高于空質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 serp1過(guò)表達(dá)可抑制過(guò)氧化氫引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的增值修復(fù)，其作用機(jī)制可能與serp1促進(jìn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的GLP-1受體表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白1；GLP-1受體；血管內(nèi)皮細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）10（a）-0013-04

Protective effect of serp1 on endothelial cells induced by hydrogen peroxide

FENG Lishuai WANG Qianqian MA Xu WEI Li WANG Jianbo

The Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200023， China

[Abstract] Objective To investigate endoplasmic reticulum stress associated protein 1 （serp1）'s protective effect on the apoptosis of vascular endothelial cells induced by hydrogen peroxide. Methods Rat vascular endothelial cells were planted in 6-well plates and then divided into the empty plasmid transfection group， empty plasmid + hydrogen peroxide group， serp1 plasmid group， serp1 plasmid + hydrogen peroxide group， different concentrations of H2O2 were added according to different experimental objective. Fluorescence PI/hochest stain were used to detect the cell apoptosis among group treated with 400 μmol/L hydrogen peroxide； and cell scratch test were used to observe wound repairing among group treated with 100 μmol/L hydrogen peroxide； the GLP-1 receptor expression were measured by Western blot. Results Compared with empty plasmid + hydrogen peroxide group， endothelial cells apoptosis rate was significantly lower among the serp1 plasmid + hydrogen peroxide group， the repairing rate was significantly higher， the difference was statistically significant （P < 0.05）； the expression of GLP-1 receptor in serp 1 plasmid + hydrogen peroxide group was obviously higher than that of empty plasmid + hydrogen peroxide group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Serp1 can inhibit the apoptosis and improve the repair capacity of vascular endothelial cells under oxidative stress state， the mechanism may attribute to the promotion of GLP-1 receptor expression due to the over-expression of serp1.

[Key words] SERP1； GLP-1 receptor； Vascular endothelial cell

隨著現(xiàn)代人生活方式、工作壓力與環(huán)境因素的改變，肥胖、糖尿病等慢性疾病的發(fā)病率逐年上升。而體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)則是解釋這些慢性疾病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[1-4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為體內(nèi)氧化應(yīng)激最重要的形式，被證明參與了各種疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生[5]。而心血管疾病作為許多慢性疾病常見(jiàn)的并發(fā)癥，若不積極治療干預(yù)，將嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，對(duì)患者的生命安全造成極大威脅[6-8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞因其具有血管防護(hù)屏障及通過(guò)釋放血管活性因子——一氧化氮（NO）改善微循環(huán)的功能，氧化應(yīng)激對(duì)其凋亡的的誘導(dǎo)作用被認(rèn)為在各種類型的心血管事件中發(fā)揮了重要作用。故對(duì)可能發(fā)生心血管事件高危人群進(jìn)行有效且有針對(duì)性的防治，對(duì)改善患者預(yù)后及生活質(zhì)量的提高意義重大。Serp1作為可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損害的未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答（unfolded protein response，UPR）反應(yīng)的重要伴侶蛋白之一，被證實(shí)在緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的組織凋亡中發(fā)揮了重要作用[9]。過(guò)氧化氫作為體外實(shí)驗(yàn)中誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)的常用試劑，將應(yīng)用于本次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)serp1對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的緩解作用。Real-time PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)分別從基因及蛋白水平證實(shí)serp1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，本研究進(jìn)一步對(duì)serp1過(guò)表達(dá)在氧化應(yīng)激作用下對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用加以驗(yàn)證及這一過(guò)程中所涉及機(jī)制的探討。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞（RAOEC，ATCC）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；PCMV6-SERP1-tGFP質(zhì)粒、PCMV6-empty質(zhì)粒（美國(guó)oriGENE公司）；熒光倒置顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）、一抗GLP-1R（美國(guó)Novus公司）、一抗serp1（美國(guó)Abcam公司）、一抗β-actin（美國(guó)Cell Signaling公司）；Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司）；Opti-MEM（美國(guó)GIBCO公司）；BCA蛋白測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染及藥物處理

將處于最佳生長(zhǎng)期的內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板中，用未添加抗生素的含10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。在6孔板上標(biāo)記空質(zhì)粒組；空質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組；serp1質(zhì)粒組、serp1質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組，以便后續(xù)轉(zhuǎn)染及藥物處理等實(shí)驗(yàn)操作。待細(xì)胞達(dá)到80%左右，開(kāi)始轉(zhuǎn)染。先在Nanodrop 2000分光光度儀上測(cè)定PCMV6-SERP1-tGFP質(zhì)粒和PCMV6-empty質(zhì)粒的濃度，配制每孔所需的轉(zhuǎn)染試劑量；于一個(gè)EP管內(nèi)加入250 μL Opti-MEM 后再加入2 μg PCMV6-empty或PCMV6-SERP1-tGFP質(zhì)粒，混勻，室溫靜置5 min；另一EP管內(nèi)加入250 μL Opti-MEM 后再加入5 μL Lipofectamine 2000；兩EP管1∶1混勻，室溫孵育30 min，在孵育期間，將待轉(zhuǎn)染的6孔板換液后，將混合液按6孔板上的標(biāo)記分別相應(yīng)待轉(zhuǎn)染的孔板內(nèi)。轉(zhuǎn)染4 h后吸掉原培養(yǎng)液，換新鮮的完全培養(yǎng)基，放于5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)間達(dá)24 h后，按6孔板上事先做好的標(biāo)記分別加入400 μmol/L或100 μmol/L的過(guò)氧化氫。24 h后將不同濃度過(guò)氧化氫處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞分別用PI/Hochest雙染色法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其凋亡和增殖情況。每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

PI/Hochest雙染色是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一種方法，PI將晚期凋亡的細(xì)胞染色成紅色，Hochest將正常細(xì)胞核染成均勻藍(lán)色。本研究將熒光顯微鏡下紅光與藍(lán)光個(gè)數(shù)的比值記為內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行觀察。將上述濃度為400 μmol/L的過(guò)氧化氫處理的一組細(xì)胞吸棄上清后用PBS清洗細(xì)胞1次后，在每孔細(xì)胞中加入1 mL PBS；再在每孔中加入1 mg/mL的Hochest 20 μL和50 mg/mL的PI染色液1 μL，置于脫色搖床避光搖勻后，熒光顯微鏡下觀察并拍照，觀察細(xì)胞凋亡情況，記錄紅光、藍(lán)光個(gè)數(shù)并將其比值記作細(xì)胞凋亡率。每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃?rùn)M線，每隔0.5～1 cm一道，橫穿過(guò)孔，每孔穿過(guò)5條線。用上述轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染24 h后，用濃度為100 μmol/L的過(guò)氧化氫處理相應(yīng)孔板中的細(xì)胞后，用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃3條痕，槍頭垂直，不同孔之間使用同一只槍頭。PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，每組中均加入新鮮完全血清培養(yǎng)基。放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)；按0 h及24 h時(shí)間點(diǎn)取樣，拍照；統(tǒng)計(jì)方法：使用Image J軟件打開(kāi)圖片后，隨機(jī)劃取6～8條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值，將0 h與24 h細(xì)胞間距的差值與0 h細(xì)胞間距的比值判定細(xì)胞增殖的修復(fù)率。每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5 GLP-1R表達(dá)

采用Western blot法。對(duì)上述濃度為100 μmol/L過(guò)氧化氫處理的空質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組和serp1質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組兩組蛋白提取后，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量后，各取30 μg蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量的不同切取不同分子量的條帶，一抗4℃孵育過(guò)夜：β-actin、serp1、GLP-1R；次日回收一抗，TBST洗膜10 min×3次；相應(yīng)二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次。加入ECL發(fā)光劑，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)自動(dòng)提取結(jié)果，應(yīng)用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶灰度的比值作為上述各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的比較

按上述方法轉(zhuǎn)染及藥物處理24 h后，空質(zhì)粒組和空質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率分別為（3.54±0.78）%和（35.89±5.26）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示400 μmol/L的過(guò)氧化氫引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用明顯。serp1質(zhì)粒組與serp1質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率分別為（3.13±0.98）%和（12.32±1.26）%，與空質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組比較，serp1質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示serp1過(guò)表達(dá)能緩解過(guò)氧化氫誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

2.2 內(nèi)皮細(xì)胞增殖修復(fù)率的比較

按上述方法轉(zhuǎn)染及藥物處理24 h后，空質(zhì)粒組和空質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖修復(fù)率分別為（69.08±7.78）%和（30.86±5.26）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示100 μmol/L的過(guò)氧化氫對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖修復(fù)抑制作用明顯。serp1質(zhì)粒組與serp1質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖修復(fù)率分別為（73.58±5.19）%和（55.75±3.13）%，與空質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組比較，serp1質(zhì)粒+過(guò)氧化氫組血管內(nèi)皮細(xì)胞增值修復(fù)率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示serp1過(guò)表達(dá)能提高內(nèi)皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激下的增殖活性。見(jiàn)圖2。

2.3 Serp1轉(zhuǎn)染與GLP-1R表達(dá)量的變化

氧化應(yīng)激條件下，在通過(guò)serp1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行serp1的過(guò)表達(dá)時(shí)，可在蛋白水平上檢測(cè)到GLP-1R的表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示serp1可促進(jìn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下GLP-1R的表達(dá)。

3 討論

隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與心血管系統(tǒng)疾病的關(guān)系日益明確，制訂能夠有效降低心血管事件的方案成為迫切需要共同攻克的難題。通過(guò)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)總結(jié)出，作為UPR的重要伴侶蛋白之一，serp1通過(guò)參與蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾，來(lái)緩解炎性反應(yīng)，最終達(dá)到維持細(xì)胞的活性的目的[10]。而這一過(guò)程中所涉及的機(jī)制，主要與serp1通過(guò)參與胞內(nèi)及胞膜蛋白的糖基化來(lái)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)多未折疊蛋白應(yīng)激壓力而抑制了疾病的進(jìn)一步發(fā)展的功能有關(guān)[11-14]。通過(guò)課題組前期研究，我們已經(jīng)通過(guò)免疫共沉淀及免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在HepG2肝癌細(xì)胞內(nèi)，serp1和GLP-1受體可在細(xì)胞膜上結(jié)合，且serp1可以通過(guò)促進(jìn)GLP-1受體糖基化而影響其功能。受到啟發(fā)，本研究在內(nèi)皮細(xì)胞上通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明亦有這兩種蛋白的表達(dá)，且在體外應(yīng)激環(huán)境下，本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)serp1可增加GLP-1受體的表達(dá)。這種現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制可能與氧化應(yīng)激條件下，對(duì)serp1的過(guò)表達(dá)可使血管內(nèi)皮細(xì)胞活性增加，從而間接改善了GLP-1受體的表達(dá)有關(guān)；肖元元等[15]也發(fā)現(xiàn)與氧化應(yīng)激的發(fā)生關(guān)系密切的肝細(xì)胞脂肪變也可導(dǎo)致GLP-1R表達(dá)量降低；除了通過(guò)間接影響GLP-1R的表達(dá)，serp1還可以通過(guò)參與GLP-1R轉(zhuǎn)錄后的糖基化修飾而介導(dǎo)GLP-1R下游對(duì)微循環(huán)的改善有重大意義的相關(guān)信號(hào)通路的傳導(dǎo)：GLP-1R的激活已被證明可減少凋亡因子的產(chǎn)生而起到維持細(xì)胞活性的作用，其表達(dá)減少與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)；另外，在內(nèi)皮細(xì)胞上與其配體結(jié)合后，GLP-1R介導(dǎo)的信號(hào)通路可通過(guò)激活eNOS，而產(chǎn)生使血管擴(kuò)張的NO，這對(duì)降低心血管事件的發(fā)生意義重大[16-18]。目前，GLP-1受體激動(dòng)劑已廣泛應(yīng)用于臨床，來(lái)治療肥胖及2型糖尿病等慢性疾病，但其受體激動(dòng)劑因胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)等副作用因素在血管并發(fā)癥的防治方面靶向性不夠，具有一定臨床應(yīng)用的局限性。本研究已經(jīng)通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和增殖修復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，增加胞內(nèi)serp1表達(dá)可改善應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞活性及胞膜上GLP-1R表達(dá)；由于serp1與GLP-1R的結(jié)合主要發(fā)生在細(xì)胞膜上，外源藥物性（胞外）serp1的加入能否對(duì)氧化應(yīng)激下內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率、GLP-1R表達(dá)量及其與之配體結(jié)合后下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)產(chǎn)生影響，從國(guó)家倡導(dǎo)的“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)”的新理念出發(fā)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)對(duì)此假設(shè)進(jìn)行探索、驗(yàn)證，這將對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞GLP-1R表達(dá)下調(diào)的心血管疾病高危人群防治靶向藥物開(kāi)發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2016-06-30 本文編輯：任 念）