鳳尾雞冠花耐鹽突變體的RAPD鑒定

王霞　劉曉丹　于曉明

摘要：采用RAPD技術(shù)對(duì)疊氮化鈉（NaN3）誘變的鳳尾雞冠花耐鹽突變體進(jìn)行遺傳特性分析。結(jié)果表明：從98個(gè)隨機(jī)引物中篩選出12條適于鳳尾雞冠花的引物，共擴(kuò)增出104條帶，對(duì)照和突變體擴(kuò)增的總條帶數(shù)分別為49和55，其中9個(gè)引物出現(xiàn)差異條帶，3個(gè)引物未出現(xiàn)差異性條帶，鳳尾雞冠花耐鹽突變體與對(duì)照差異較大，變異率為31.73%，說(shuō)明了NaN3能有效誘導(dǎo)鳳尾雞冠花的基因變異。

關(guān)鍵詞：鳳尾雞冠花；耐鹽突變體；RAPD鑒定

基金項(xiàng)目：吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究（吉教科合字〔2013〕第471號(hào)）

中圖分類號(hào)： S681.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.048

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplifie dpolymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD）是建立在PCR基礎(chǔ)之上的檢測(cè)DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)[1]，其利用PCR隨機(jī)合成多態(tài)性DNA片段，檢測(cè)被擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)遺傳特性變化，該技術(shù)的實(shí)施不依賴于種屬的特異性和基因組的結(jié)構(gòu)，無(wú)需制備探針，DNA用量少，分子識(shí)別率高，對(duì)環(huán)境污染小，成本低，已在分類學(xué)研究、品種鑒定、遺傳作圖等方面得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。目前，運(yùn)用RAPD技術(shù)已經(jīng)成功的發(fā)現(xiàn)了眾多的突變型[4，5]。試驗(yàn)對(duì)NaN3誘變的鳳尾雞冠花耐鹽突變體進(jìn)行RAPD分析，進(jìn)一步鑒定耐鹽突變體的遺傳穩(wěn)定性，為鳳尾雞冠花耐鹽新品系的誘變育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

材料：鳳尾雞冠花組培苗經(jīng)NaN3誘變初篩獲得的耐鹽突變體。

主要試劑：隨機(jī)引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×CTAB提取緩沖液、Tris-HCl、0.5 moloL-1 EDTA（pH 8.0）、氯仿-異戊醇（24︰1）、TE溶液、3 moloL-1 NaAC、異丙醇、乙醇、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)等，所有試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取及檢測(cè) 參照趙曦[6]等的CTAB法，以未經(jīng)處理的鳳尾雞冠花組培苗為對(duì)照，分別提取對(duì)照和初篩耐鹽突變體的基因組DNA，并采用紫外風(fēng)光光度計(jì)法和瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)所提基因組進(jìn)行鑒定。

1.2.2鳳尾雞冠耐鹽突變體的RAPD檢測(cè)

1.2.2.1引物篩選及RAPD反應(yīng) 從上海生工生物工程技術(shù)有限公司購(gòu)進(jìn)98個(gè)隨機(jī)引物（10個(gè)堿基），以對(duì)照和耐鹽突變體基因組DNA為模板，進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，篩選出突變體與對(duì)照間具多態(tài)性的特異引物。

采用20μL的RAPD反應(yīng)體系，分別為：20ngoμL-1模板DNA 2.0 μL，10pm隨機(jī)引物1.0 μL，2.5 mmooL-1MgCl2 2.0 μL，2.5 mmooL-1 dNTP 0.3 μL，Taq酶1μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，其余由ddH2O補(bǔ)充。反應(yīng)程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性5分鐘；94 ℃變性1分鐘，35℃退火45秒，72 ℃延伸1 分鐘，42 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10分鐘；4 ℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離和分析。

1.2.2.2RAPD標(biāo)記分析 通過(guò)篩選引物，檢測(cè)鳳尾雞冠花耐鹽突變體相對(duì)于對(duì)照在DNA分子水平上的變化，獲得突變體與對(duì)照間的多態(tài)性基因位點(diǎn)，以穩(wěn)定而清晰的條帶作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算變異率[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1基因組DNA的純度和濃度檢測(cè)

采用CTAB法提取得到的DNA顏色呈無(wú)色透明狀，較粘稠，易溶于TE溶液。對(duì)照和突變體DNA樣品OD260/OD280都在1.80-1.92之間，OD260/OD230都在1.98～2.10之間，表明所提DNA樣品中蛋白和RNA污染較少，DNA純度較高，凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，基因組條帶清晰、整齊、明亮，無(wú)彌散現(xiàn)象，點(diǎn)樣孔清晰，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 引物的篩選及RAPD分析

用98個(gè)隨機(jī)引物對(duì)鳳尾雞冠花耐鹽突變體及其對(duì)照進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有12條引物可擴(kuò)增出清晰、明亮、多態(tài)性較好的條帶（表1），對(duì)鳳尾雞冠花對(duì)照和初篩獲得的耐鹽突變體進(jìn)行了RAPD分析，發(fā)現(xiàn)12個(gè)隨機(jī)引物中，9個(gè)引物（S87，S88、S89、S97、S113、S424、S432，S435）出現(xiàn)差異條帶，3個(gè)引物（S98、S117、S440）未出現(xiàn)差異性條帶，其余引物均沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，圖2為多態(tài)性最好的3個(gè)隨機(jī)引物（S87、S432、S435）的擴(kuò)增圖。12個(gè)可擴(kuò)增引物共擴(kuò)增出104條帶，其中對(duì)照和突變體分別擴(kuò)增的總條帶數(shù)為49和55，擴(kuò)增片段大小在100-2000bp之間。RAPD擴(kuò)增結(jié)果中出現(xiàn)了新增或缺失條帶，與對(duì)照相比，突變體新增條帶11條，缺失條帶12條，鳳尾雞冠花耐鹽突變體與對(duì)照差異較大，變異率為31.73%，充分說(shuō)明了NaN3結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)能有效地誘導(dǎo)鳳尾雞冠花基因變異。

3 討論

RAPD是一種有效的檢測(cè)基因差異的技術(shù)，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于體外誘變育種引起的DNA多態(tài)性分析，鳳尾雞冠花組培苗經(jīng)NaN3處理后，結(jié)合植物組織培養(yǎng)技術(shù)，在半致死劑量的NaCl脅迫下誘變耐鹽突變體，RAPD擴(kuò)增結(jié)果差異顯著。與對(duì)照相比，擴(kuò)增帶型出現(xiàn)了差異，這些差異帶型主要有擴(kuò)增條帶的消失、增加以及擴(kuò)增條帶的強(qiáng)弱變化。引起擴(kuò)增帶消失或新增的原因肯是引物互補(bǔ)位點(diǎn)發(fā)生堿基突變，或互補(bǔ)位點(diǎn)間的DNA發(fā)生插入或缺失，或插入片段過(guò)大，這些都能導(dǎo)致差異片段的出現(xiàn)。引起擴(kuò)增條帶強(qiáng)度變化的原因可能是多拷貝引物結(jié)合位點(diǎn)上某些堿基發(fā)生突變，使引物結(jié)合量減少，造成DNA量減少，或是新增片段與原有某片段的分子量相近，使譜帶加深，即反映出譜帶深淺的變化。這些差異充分說(shuō)明NaN3誘變結(jié)合體細(xì)胞無(wú)性系變異能引起遺傳物質(zhì)發(fā)生豐富的變異。

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作者簡(jiǎn)介：王霞，碩士，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，講師，研究方向：植物分子生物學(xué)及天然產(chǎn)物分離。