植物NBS類R基因的分類、進(jìn)化、調(diào)控及應(yīng)用

劉靜，暢志堅(jiān)，郭慧娟，李欣，張曉軍，詹海仙，任永康，喬麟軼，

（1.山西大學(xué)研究生院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

植物NBS類R基因的分類、進(jìn)化、調(diào)控及應(yīng)用

劉靜1，暢志堅(jiān)2，郭慧娟2，李欣2，張曉軍2，詹海仙2，任永康2，喬麟軼1，2

（1.山西大學(xué)研究生院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

NBS類抗病基因作為抗病基因中數(shù)目最多的家族，在植物抵御病蟲害中起著關(guān)鍵作用。綜述了NBS類抗病基因的分類、功能、數(shù)目、起源進(jìn)化、表達(dá)調(diào)控以及應(yīng)用等方面的研究進(jìn)展，并對(duì)該類基因的研究前景進(jìn)行了展望。

NBS；分類；進(jìn)化；調(diào)控；應(yīng)用

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中不斷面臨著真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲等病原體的侵襲，而在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中植物也逐漸形成了一系列復(fù)雜的防御機(jī)制，特別是植物抗病基因編碼的蛋白對(duì)病原體的特異性識(shí)別。隨著對(duì)抗病基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能研究，以及植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中其他組分的進(jìn)一步解讀，人們對(duì)有關(guān)植物與病原體互作、抗病基因進(jìn)化的分子機(jī)制的研究不斷深入。盡管基因產(chǎn)物針對(duì)的病原體及致病因子截然不同，但其植物抗性基因的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)特征相對(duì)十分保守，常見的有蛋白激酶（protein kinase，PK）、跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TM）和核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide binding site，NBS）等，其中，NBS類基因是植物中普遍存在的抗病基因，在植物抵抗各種病原物侵襲的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

1 NBS類抗病基因的分類、功能及數(shù)目

NBS結(jié)構(gòu)域是該類基因所編碼蛋白中最保守的序列，存在于真核生物的許多蛋白中（如ATP合酶的亞基、核糖體延伸因子、ras蛋白等），能夠結(jié)合ATP或GTP，可能參與抗病信號(hào)的傳導(dǎo)[1]。根據(jù)NBS類抗病基因編碼蛋白的N端結(jié)構(gòu)不同，可將其分為TIR-NBS-LRR（TNL）和non-TIR-NBS-LRR（non-TNL）兩類。其中，TIR通過(guò)與病原物及其產(chǎn)物的結(jié)合，產(chǎn)生信號(hào)并將信號(hào)傳遞給傳導(dǎo)因子，從而引發(fā)抗病反應(yīng)[2]；LRR結(jié)構(gòu)域由一系列相似重復(fù)的模體構(gòu)成，主要參與對(duì)Avr蛋白的特異性識(shí)別[3-4]；non-TNL的N端為CC卷曲螺旋結(jié)構(gòu)[2]，該結(jié)構(gòu)由2個(gè)或2個(gè)以上的螺旋相互作用形成一個(gè)超級(jí)螺旋，分散在疏水氨基酸殘基中，與病原產(chǎn)生的配體結(jié)合，進(jìn)而感知病原侵染。

NBS類抗病基因廣泛存在于植物基因組中，目前，多種植物的NBS類抗病基因的數(shù)目已確定。由表1可知，數(shù)目最少的為短柄草，只有23個(gè)，而小麥高達(dá)1 219個(gè)，差異較大可能是由基因組大小不同[5]以及在進(jìn)化過(guò)程中病蟲害和環(huán)境選擇壓力不同所造成的[6]。

表1 16種植物中NBS類抗病基因數(shù)目

2 NBS類抗病基因的起源與進(jìn)化

許多研究表明，NBS，LRR，TIR，CC結(jié)構(gòu)域在抗病基因發(fā)揮作用中必不可少，因此，研究這些結(jié)構(gòu)域的起源是研究抗病基因起源中的最關(guān)鍵部分。隨著植物全基因組序列的不斷公布以及基于BLAST的同源搜索和簡(jiǎn)并引物PCR的產(chǎn)生，有關(guān)結(jié)構(gòu)域起源的研究已取得了一定進(jìn)展。2002年，Meyers等[15]通過(guò)在小立碗蘚的ETS數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST搜索發(fā)現(xiàn)，其中2個(gè)TIR序列在陸生植物中普遍存在。同年，Akita等[16]通過(guò)簡(jiǎn)并引物PCR法，也發(fā)現(xiàn)了TIR類似片段。2012年，Yue等[17]對(duì)NBS類抗病基因的起源進(jìn)行了更深的研究，結(jié)果表明，TNL類起源于苔蘚類植物，non-TNL類起源于石松類植物，且NBS，LRR各自在真核生物和原核生物之前已出現(xiàn)，但在陸生植物中才發(fā)生融合，隨后擴(kuò)展到被子植物和裸子植物中。

有研究還發(fā)現(xiàn)，NBS結(jié)構(gòu)中既存在保守型區(qū)域，也含有多態(tài)性的片段，推測(cè)NBS基因在進(jìn)化過(guò)程中，一些具有重要功能的結(jié)構(gòu)域被保存下來(lái)，而為了適應(yīng)多變的環(huán)境產(chǎn)生了變異。導(dǎo)致真核生物的基因數(shù)目及復(fù)雜度增加的最重要原因?yàn)榛驈?fù)制[18]，其有助于基因網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)化，并為新遺傳系統(tǒng)以及基因功能的進(jìn)化提供了新素材。例如，Martin等[19]對(duì)萵苣基因組研究發(fā)現(xiàn)了通過(guò)染色體復(fù)制產(chǎn)生的整套新的抗性基因簇；Pamiske等[20]研究發(fā)現(xiàn)，cf9基因至少存在2個(gè)同源基因族，暗示cf類型基因是DNA復(fù)制的產(chǎn)物；Wang等[21]研究表明，xa21基因家族中含有17 kb的大片段重復(fù)，說(shuō)明有基因參與復(fù)制的跡象。

在被子植物和裸子植物中，TNL和non-TNL 2種類型的NBS抗病基因都存在，而在雙子葉植物中只有TNL類型存在。有關(guān)數(shù)據(jù)表明，這2種類型的進(jìn)化模式不同，Zhong等[22]通過(guò)對(duì)反義替換Ka與同義替換Ks的比值研究TNL，non-TNL的進(jìn)化模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同植物中其比值可能大于1，也可能小于1，即不同植物有不同的生命歷程，其TNL，non-TNL多樣化的進(jìn)化模式是由其所在的特定生態(tài)環(huán)境所決定。

3 NBS類抗病基因的表達(dá)與調(diào)控

植物NBS類抗病基因的表達(dá)存在差異性，即在不同物種或同一物種不同組織器官中表達(dá)有先后，且表達(dá)產(chǎn)物以及表達(dá)量有差異。Akita等[16]研究發(fā)現(xiàn)，苔蘚植物中，NBS類抗病基因的表達(dá)與發(fā)育有關(guān)，在配子體階段，其表達(dá)水平比絲狀體高。宋霄等[23]對(duì)MdNBS-LRR1基因的組織表達(dá)特異性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，MdNBS-LRR1在分析的6種組織中均有表達(dá)，但在幼葉中的表達(dá)量最高。楊慧等[24]也比較了PB-LRR基因在野生型水稻不同器官中的表達(dá)模式，結(jié)果表明，PB-LRR基因在水稻葉片中的表達(dá)水平約是根中的13倍。

植物抗病基因的表達(dá)除具有組織特異性外，主要還受環(huán)境、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、miRNA以及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Wang等[25]對(duì)含NBS結(jié)構(gòu)的OsRP1L1基因在高鹽、高低溫、強(qiáng)滲透壓條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，其中，高鹽、高溫抑制該基因的表達(dá)，而強(qiáng)滲透壓與低溫對(duì)其表達(dá)影響較小。Que等[26]研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸對(duì)甘蔗NBS基因（SNLR）的表達(dá)有一定的影響。Guo等[27]測(cè)定了水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（TE）等對(duì)水稻苗期NBS基因（DEPG1）表達(dá)的影響，結(jié)果表明，這3種激素均不同程度地抑制DEPG1基因的表達(dá)。

病原菌侵染導(dǎo)致抗病基因的瞬時(shí)表達(dá)，由于表達(dá)量過(guò)高可能會(huì)引起過(guò)敏性反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的局部死亡，這對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育非常不利；而植物可通過(guò)其內(nèi)源性抗病毒防御系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控引起基因沉默，進(jìn)而影響基因的表達(dá)。He等[28]在白菜中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特有的miRNA，可以靶向沉默TNL類基因，并證明這個(gè)miRNA可以被TuMV誘導(dǎo)表達(dá)，使TNL基因被切割降解。2009年，Klevebring等[29]對(duì)楊樹基因組中的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的miRNA，其靶基因?yàn)镹BS-LRR類抗病基因，可能調(diào)控該類基因的表達(dá)。當(dāng)病原菌侵染植物后通過(guò)信號(hào)傳遞把轉(zhuǎn)錄因子激活，轉(zhuǎn)錄因子與抗病基因的啟動(dòng)子結(jié)合，從而引起基因表達(dá)。

4 NBS類抗病基因的應(yīng)用

隨著克隆技術(shù)的發(fā)展，對(duì)抗病基因的結(jié)構(gòu)有了全面的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)這些基因都含有幾個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，利用其保守性，目前在許多植物中已克隆出抗病基因同源物。Klevebring等[29]利用TIGR和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)R基因保守結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，獲得900條RGA。高樹廣等[30]根據(jù)已知植物抗病基因的NBS-LRR類保守結(jié)構(gòu)域，合成1對(duì)簡(jiǎn)并、2對(duì)特異引物，對(duì)6個(gè)芝麻品種中的抗病基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到11條抗病基因同源序列。Ilag等[31]利用擬南芥的NBS-LRR抗病基因Rps2作為探針，從水稻IR64中篩選出3個(gè)NBS-LRR同源序列NRH1，NRH2和NRH3。張立榮等[32]利用已克隆植物抗病基因NBS序列中的保守結(jié)構(gòu)P-loop和GLPL合成簡(jiǎn)并引物，對(duì)小麥近等基因系TcLr24基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到13條具有連續(xù)ORF的抗病基因類似物。利用NBS抗病基因克隆出的RGA通常被應(yīng)用于分子標(biāo)記的開發(fā)，基于RGA開發(fā)的標(biāo)記主要有RFLP，STS，SSCP，CAPS和SSR等。Liu等[33]從25個(gè)花生RGA中開發(fā)出28個(gè)SSR標(biāo)記，并將其中一個(gè)標(biāo)記RGA121定位到連鎖群AhIV上。Samuelian等[34]同樣也從9個(gè)覆盆子RGA中開發(fā)出3個(gè)CAPS標(biāo)記。除以上2種外，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)NBS類抗病基因已在植物抗病育種中得到應(yīng)用。李海霞等[35]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將從毛白楊中克隆得到的TNL抗病基因（PtDRG01）導(dǎo)入煙草中，經(jīng)抗生素篩選和PCR分子檢測(cè)，獲得一批陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。郭立佳等[36]通過(guò)構(gòu)建NBS-LRR類基因Osxoc1334的超量表達(dá)載體，并在農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化中花11號(hào)水稻，最終獲得6株再生植株。

5 展望

近年來(lái)，隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，部分植物的基因組測(cè)序相繼完成。目前，已對(duì)NBS類抗病基因在全基因組水平上進(jìn)行了較全面的分析，主要包括基因結(jié)構(gòu)、數(shù)量、分布以及與其他植物NBS類基因的進(jìn)化和親緣關(guān)系的比較分析，但是對(duì)于NBS類基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究還有待進(jìn)一步深入。對(duì)于大部分NBS類抗病基因來(lái)說(shuō)，其只具有專化抗性，隨著病原菌的變異，植物抗病性很容易喪失。因此，發(fā)掘和克隆具有廣譜性的抗病基因?qū)⑹荖BS類抗病基因研究的重要內(nèi)容。

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Classification，Evolution，Regulation and Application of NBS R-genes in Plants

LIUJing1，CHANGZhi-jian2，GUOHui-juan2，LI Xin2，ZHANGXiao-jun2，ZHANHai-xian2，RENYong-kang2，QIAOLin-yi1，2
（1.College ofGraduate，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Shanxi Province KeyLaboratoryofCrop Genetics and Molecular Improvement，Institute ofCrop Sciences，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Nucleotide binding site（NBS）-encoding gene family,which contains the largest number of members,plays a critical role in plant resistance to pathogens and pests.In this review,we summarized the research progress of classification,function,number, evolution,expression and application ofNBSgenes in plant,and discussed the prospect ofresearch on them.

NBS;classification;evolution;regulation;application

Q943.2

A

1002-2481（2016）03-0423-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.37

2015-10-20

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20150311001-1）；山西省青年基金項(xiàng)目（2015021145）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院攻關(guān)項(xiàng)目（15YGG01）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點(diǎn)科研項(xiàng)目（YZD1501）

劉靜（1991-），女，山西呂梁人，在讀碩士，研究方向：種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用。喬麟軼為通信作者。