Mindbomb同源物2基因轉染對人腦膠質瘤細胞U251增殖的影響及其機制

單小松，劉海鵬，鄭克彬，方川，丁亞楠

(河北大學附屬醫(yī)院，河北保定071000)

Mindbomb同源物2基因轉染對人腦膠質瘤細胞U251增殖的影響及其機制

單小松，劉海鵬，鄭克彬，方川，丁亞楠

(河北大學附屬醫(yī)院，河北保定071000)

目的 觀察Mindbomb同源物2(MIB2)基因轉染對人腦膠質瘤細胞U251增殖的影響，并探討其作用機制。方法 將U251細胞分為空白對照組、陰性對照組、實驗組1、實驗組2；空白對照組不作任何處理，陰性對照組轉染空載體FLAG質粒，實驗組1轉染MIB2-FLAG質粒，實驗組2轉染siMIB2。用PCR法檢測各組細胞的MIB2 mRNA，用蛋白質印跡法檢測各組細胞的MIB2、核因子κB(NF-κB)抑制性蛋白(IκB)、NF-κB蛋白，用MTT法檢測各組細胞的光密度值。結果 實驗組1的MIB2 mRNA相對表達量為19.43±3.21、實驗組2為0.43±0.17、陰性對照組為1.03±0.12；實驗組1、實驗組2與陰性對照組相比，P均<0.01。實驗組1的MIB2、核因子κB(NF-κB)抑制性蛋白、NF-κB蛋白相對表達量分別為5.11±0.41、0.49±0.13、4.99±0.32，實驗組2分別為0.43±0.17、3.12±0.36、0.49±0.14，陰性對照組分別為1.09±0.11、1.02±0.46、1.01±0.21；實驗組1、實驗組2與陰性對照組相比，P均<0.01；在36、48、72 h三個時點，與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組1的U251細胞光密度值升高(P均<0.01)。結論 轉染MIB2基因后人腦膠質瘤U251細胞的增殖能力增強，MIB2基因可能是通過MIB2蛋白調控NF-κB信號通路而發(fā)揮作用。

Mindbomb同源物2；核因子κB；核因子κB抑制性蛋白；腦膠質瘤；細胞增殖

人腦膠質瘤是顱內常見的侵襲性腫瘤之一。核因子κB(NF-κB)信號通路的異常活化在腦膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[1,2]。作為一種重要的核轉錄調控因子，NF-κB在不同類型的腫瘤發(fā)生過程中均有異?；罨?，它可以抑制有缺陷的細胞進入凋亡的過程、促進腫瘤細胞增殖、輔助腫瘤細胞轉移、誘導腫瘤細胞對放療和化療的耐受并導致腫瘤復發(fā)[3]。NF-κB表達被其抑制分子NF-κB抑制性蛋白(IκB)所調控，IκB可以與NF-κB的Rel同源結構域相互作用，通過覆蓋NF-κB上的核定位序列阻礙其活化[4]。Mindbomb同源物2(MIB2)是泛素連接酶E3的配體，它可以通過泛素化途徑降解IκB并最終實現(xiàn)對NF-κB的調控[5]。腦膠質瘤細胞內是否存在泛素化調節(jié)途徑一直未見報道。2015年10月～2016年1月，我們通過建立腦膠質瘤細胞U251高表達和敲除MIB2基因的細胞模型，觀察該基因對U251細胞增殖的調節(jié)作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及實驗材料 U251細胞。MIB2-FLAG，MIB2抗體，NF-κB抗體，p-IKKα/β抗體，siMIB2序列(合成于北京奧科鼎盛生物科技有限公司)，α-Tubulin抗體，QuantiTect Probe RT-PCR Kit試劑盒，ECL化學發(fā)光試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 U251細胞分組及基因轉染 將U251細胞分為空白對照組、陰性對照組、實驗組1、實驗組2。將各組細胞接種于6孔板，細胞融合度達50%后進行基因轉染：空白對照組不作任何處理；陰性對照組加入5 μL的空載體FLAG質粒溶液與5 μL的LipofectamineTM3000，靜置5 min后加入200 μL的無血清RPMI1640培養(yǎng)基；實驗組1加入5 μL的MIB2-FLAG質粒溶液與5 μL的LipofectamineTM3000，靜置5 min后加入200 μL的無血清RPMI1640培養(yǎng)基；實驗組2加入5 μL的siMIB2溶液與5 μL的LipofectamineTM3000，靜置5 min后加入200 μL的無血清RPMI1640培養(yǎng)基。各組細胞培養(yǎng)16 h后，陰性對照組、實驗組1、實驗組2棄去原培養(yǎng)基，更換為含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞并進行后續(xù)實驗。

1.2.2 各組U251細胞MIB2 mRNA檢測 采用實時定量PCR技術。取“1.2.1”中收集的各組U251細胞，用TRIzol裂解后提取總RNA，合成cDNA，對MIB2 mRNA和內參GAPDH mRNA進行實時定量PCR擴增，反應體系20 μL。第一步：95 ℃ 3 min，循環(huán)1次；第二步：95 ℃ 12 s，62 ℃ 60 s，循環(huán)35次；第三步：62～95 ℃，每2 s升高0～2 ℃，循環(huán)1次。將空白對照組的MIB2 mRNA定義為1，陰性對照組、實驗組1、實驗組2的MIB2 mRNA相對表達量用各組MIB2 mRNA與空白對照組MIB2 mRNA的比值表示。

1.2.3 各組U251細胞MIB2、IκB、NF-κB蛋白檢測 采用蛋白質印跡法。取“1.2.1”中收集的各組U251細胞，蛋白裂解液裂解后收集到1.5 mL的EP管中，煮沸5 min后12 000 r/min離心1 min，棄上清；BCA法進行蛋白定量。向SDS-PAGE凝膠中加入樣本，電泳分離后電轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜；加入α-Tubulin、MIB2、IκB和NF-κB抗體，4 ℃過夜孵育后加入二抗，37 ℃孵育30 min。采用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測分析各條帶的光密度值。將空白對照組的MIB2蛋白光密度值定義為1，陰性對照組、實驗組1、實驗組2的MIB2蛋白相對表達量用各組MIB2蛋白光密度值與空白對照組MIB2蛋白光密度值的比值表示。

1.2.4 各組U251細胞增殖情況觀察 采用MTT法。取“1.2.1”中收集的各組U251細胞，胰酶消化后計數(shù)，按5×104/孔的密度接種96孔板，每組設5個復孔。分別于培養(yǎng)12、24、36、48、72 h時，每孔加入含5 mg/mL的MTT無血清DMEM培養(yǎng)基120 μL，避光培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL的DMSO，置水平搖床上混勻15 min，于酶標儀490 nm波長處檢測光密度值(光密度值高表示細胞增殖能力強)。

2 結果

2.1 各組U251細胞的MIB2 mRNA表達比較 實驗組1的MIB2 mRNA相對表達量為19.43±3.21、實驗組2為0.43±0.17、陰性對照組為1.03±0.12；實驗組1、實驗組2與陰性對照組相比，P均<0.01。

2.2 各組U251細胞的MIB2、IκB、NF-κB蛋白表達比較 實驗組1的MIB2、IκB、NF-κB蛋白相對表達量分別為5.11±0.41、0.49±0.13、4.99±0.32，實驗組2分別為0.43±0.17、3.12±0.36、0.49±0.14，陰性對照組分別為1.09±0.11、1.02±0.46、1.01±0.21；實驗組1、實驗組2的各指標與陰性對照組相比，P均<0.01。

2.3 各組U251細胞的增殖情況比較 各時點各組U251細胞光密度值比較見表1。

表1 各時點各組U251細胞光密度值比較±s)

注：與空白對照組相比，*P<0.01；與陰性對照組相比,#P<0.01。

3 討論

NF-κB介導的細胞信號傳導通路在腫瘤細胞的異常增殖過程中發(fā)揮重要作用，當NF-κB信號通路被異常激活，可以加速腫瘤細胞的增殖、增強腫瘤細胞的侵襲能力、提高腫瘤細胞的耐藥性[6]。NF-κB家族包括p65 (Rel-A)、Rel-B、Rel (c-Rel)、NF-κB1 (p105/p50)與 NF-κB2 (p100/p52)。通常情況下NF-κB處于非活化狀態(tài)，其活化直接受到IκB的抑制。在靜息狀態(tài)下，IκB氨基端上的絲氨酸發(fā)生特異磷酸化的蛋白激酶IκK處于無活性狀態(tài)[7]。IκK由兩個催化亞單位IκKα和IκKβ，以及一個調節(jié)亞單位IκKγ構成。IκK活化主要依賴于上游激酶對IκKβ氨基端的激酶結構域的磷酸化作用，活化后的IκKβ可以進一步磷酸化IκKα，而IκKβ和IκKα通過對IκBα亞基磷酸化，磷酸化后的IκBα的氨基端第21和22位賴氨酸殘基通過E3泛素連接酶復合物與多個泛素分子共價結合而降解[8]。IκB的降解途徑主要受到泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)的調節(jié)。UPS是由泛素、泛素啟動酶(包括泛素激活酶El、泛素載體蛋白E2、泛素連接酶E3和26S蛋白酶體)組成[9]。MIB2是泛素連接酶E3的配體，它可以活化泛素連接酶E3，這一過程可以直接導致內源性的UPS激活。當UPS活化時，就會降解IκB，使得NF-κB的信號通路活化，而這一信號通路活化后最直接的表現(xiàn)就是腫瘤細胞增殖能力、侵襲能力、耐藥性增強[10,11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，當人腦膠質瘤細胞U251中MIB2高表達時，其IκB蛋白的表達降低，而受到IκB蛋白直接調控的NF-κB蛋白表達明顯增加，細胞增殖能力也明顯增強。這一結果說明MIB2通過UPS實現(xiàn)對NF-κB的調節(jié)作用，進而對U251細胞的增殖發(fā)揮調節(jié)作用。

本研究同時設計了MIB2基因被敲除的陰性對照實驗，結果顯示，在實驗組2中，當U251細胞的MIB2基因被敲除后，其MIB2蛋白、NF-κB蛋白表達明顯降低，IκB蛋白的表達增加，這從反面進一步說明MIB2通過UPS實現(xiàn)對NF-κB的調節(jié)作用。但實驗組2的U251細胞增殖能力沒有明顯變化，其原因可能是實驗組2中MIB2基因只敲除了50%(不能做到基因完全敲除)，MIB2、NF-κB的表達雖然降低，但對細胞增殖能力的調控作用沒用明顯變化；如果使用MIB2抑制劑，可能會完全沉默MIB2基因，這樣就會看到細胞增殖能力降低，但目前市場上尚無成品MIB2抑制劑出售，這是本實驗的一個缺憾。

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Effects of Mindbomb homologue 2 gene transfection on proliferation of human glioma U251 cells

SHANXiaosong,LIUHaipeng,ZHENGKebin,FANGChuan,DINGYanan

(AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding071000,China)

Objective To observe the effects of Mindbomb homologue 2 (MIB2) gene transfection on the proliferation of human glioma U251 cells, and to explore its mechanism. Methods U251 cells were divided into four groups: the control group, negative control group, experimental group 1 and experimental group 2. U251 cells in the control group was untreated; U251 cells in the negative control group was transfected with vector FLAG plasmid; and U251 cells in the experimental group 1 was transfected with MIB2-FLAG plasmid; U251 cells in the experimental group 2 was transfected siMIB2. MIB2 mRNA was detected by PCR, the expression of MIB2, nuclear factor-κB (NF-κB) inhibitory protein (IκB) and NF-κB protein was detected by Western blotting in each group, and the optical density (OD) values were detected by MTT. Results The expression of MIB2 mRNA in the experimental group 1, experimental group 2 and negative control group was 19.43±3.21, 0.43±0.17, and 1.03±0.12, respectively; and significant difference was found in the MIB2 mRNA between the experimental groups 1, 2 and the negative control group (allP<0.01). The expression of MIB2, IκB and NF-κB protein in the experimental group 1 was 5.11±0.41, 0.49±0.13 and 4.99±0.32, respectively; the expression of MIB2, IκB and NF-κB protein in the experimental group 2 was 0.43±0.17, 3.12±0.36 and 0.49±0.14, respectively; and the expression of MIB2, IκB and NF-κB protein in the negative control group was 1.09±0.11, 1.02±0.46 and 1.01±0.21, respectively. Significant difference was found in the expression of MIB2, IκB and NF-κB protein between the experimental groups 1, 2 and the negative control group (allP<0.01). At 36, 48 and 72 h, compared with the negative control group and blank control group, OD value of U251 cells in the experimental group 1 increased significantly (allP< 0.01). Conclusion After MIB2 gene tranfection, the proliferation of human glioma U251 cells increases and MIB 2 gene may play an important role in the regulation of NF-κB signaling pathway through MIB2 protein.

Mindbomb homologue 2; nuclear factor-κB; nuclear factor-κB inhibitory protein; glioma; cell proliferation

河北省臨床醫(yī)學優(yōu)秀人才培養(yǎng)和基礎課題研究項目(361007)。

單小松(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向為神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的診斷及治療。E-mail： shanxs888@outlook.com

簡介：丁亞楠(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向為腦膠質瘤、腦血管病和癲癇的外科治療。E-mail： 2739718156@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.002

R739.41

A

1002-266X(2016)43-0004-03

2016-07-15)