孕烯醇酮衍生物體外抗癌活性研究*

耿曉宇，于春影，王艷秋

(1.通化師范學(xué)院制藥與食品科學(xué)學(xué)院，吉林通化134002;2.江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港224200; 3.通化市衛(wèi)生學(xué)校，吉林通化134002)

孕烯醇酮衍生物體外抗癌活性研究*

耿曉宇1，于春影2，王艷秋3

(1.通化師范學(xué)院制藥與食品科學(xué)學(xué)院，吉林通化134002;2.江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港224200; 3.通化市衛(wèi)生學(xué)校，吉林通化134002)

目的:研究孕烯醇酮衍生物的體外抗癌活性.方法:采用MTT活細(xì)胞染色法，對3個孕烯醇酮衍生物進(jìn)行了PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞體外增殖抑制實(shí)驗(yàn).結(jié)果:3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸(A2)具有較好的抗癌活性.結(jié)論:孕烯醇酮衍生物的抗癌活性值得進(jìn)一步研究.

3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯;3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸;孕烯醇酮衍生物;抗癌活性;MTT法

1 引言

2008年劉躍金等［1］報道了3β，5α，6β－三羥基膽－24－酸甲酯、膽甾－3β，5α，6β－三醇對小鼠肉瘤S180有一定的體內(nèi)抗癌活性.2011年，Carvalho JFS等［2］進(jìn)行了HT－29等7個瘤株的體外抗癌活性篩選，表明3β，5α－二羥基膽甾－6－肟、6β－甲氧基膽甾－3β，5α－二醇、膽甾－3β，4 β，5α，6β－四醇和6β－乙酰氧基膽甾－3β，5α－二醇均具有較好的體外抗癌活性.2013年Wang P等［3］在中國南海從柳珊瑚Menella kanisa中分離得到麥角甾 －3β，5α，6β－三醇、膽甾 －3β，5α，6β－三醇等27個甾體化合物，對人肺癌A549細(xì)胞具有不同的抗癌活性.同年，Liu TF等［4］在中國南海從柳珊瑚中分離得到膽甾－1β，3β，5α，6β－四醇，對A549和MG－63表現(xiàn)出較好的抗癌活性，并能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡.2016年，張楊梅［5］等在中國南海紅樹林底泥的海洋鏈霉菌 H41 －59發(fā)酵物中的次級代謝產(chǎn)物中分離得到10個甾醇類化合物，發(fā)現(xiàn)麥角甾－8(9)，22－二烯－3β，5α，6β，7α－四醇、麥角甾－8(14)，22－二烯－3β，5α，6β，7α －四醇對人肺癌細(xì)胞 NCIH460、人乳腺癌細(xì)胞MCF－7和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF－268具有較好的抑制活性.

PC－12細(xì)胞是從大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤克隆的細(xì)胞系，主要分泌產(chǎn)物為兒茶酚胺類遞質(zhì)，因其具有可傳代培養(yǎng)的特點(diǎn)，廣泛用于神經(jīng)生理、病理及藥理方面研究，有助于闡明神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制、藥物療效，探索新的藥物與治療手段［6］.

本文研究了3個孕烯醇酮衍生物對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長影響，進(jìn)行了體外抗癌活性篩選，以期獲得較好活性的甾體化合物.

2 材料與儀器

孕烯醇酮衍生物:3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸(A2)和3β，5α，6β－三羥基孕甾－20－酮(A3)含量皆為質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%(沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院提供);RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);四季青小牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司);其他試劑，分析純(天津市博迪化工有限公司);PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心).

北京普郎DNM－9602G酶標(biāo)儀，北京儀和方圓科技有限公司;INC02－108 CO2培養(yǎng)箱，德國Memmert公司等.

圖1 孕烯醇酮衍生物的結(jié)構(gòu)式

3 實(shí)驗(yàn)方法

PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞MTT活細(xì)胞染色法體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)取生長狀態(tài)良好的PC －12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，接種于含質(zhì)量濃度為10%小牛血清培養(yǎng)液，配制成單個細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔5～50個懸浮細(xì)胞·L－1，體積200μL.置37℃、CO2為體積分?jǐn)?shù)5%培養(yǎng)箱培養(yǎng)約4d.每孔加5mg·L－1MTT 150μL，搖床振蕩15min以充分溶解結(jié)晶物.在570nm用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度.

收集處于對數(shù)增長期的PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，然后用質(zhì)量濃度25%的胰酶消化，再以RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至1×106個懸浮細(xì)胞·L－1.在96孔培養(yǎng)板每孔接種100μL，置培養(yǎng)箱內(nèi)調(diào)溫度至37℃、CO2為體積分?jǐn)?shù)5%，培養(yǎng)24h.棄培養(yǎng)液，以磷酸鹽緩沖液洗兩次.樣品精密稱定，以二甲基亞砜助溶，加磷酸鹽緩沖液稀釋，每孔加入的終濃度為 0.012、0.024、0.048、0.096、0.192、0.384mmol·L－1培養(yǎng)20h.每孔加5mg·L－1MTT 20μL繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150μL，振蕩15min.在570nm用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度.抑制率=(1－加藥組吸光度值/對照組吸光度值)*100%，采用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS 19.0計算IC50值.

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)以濃度(x，mmol·L－1)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率(%)為縱坐標(biāo)，繪制三種物質(zhì)的濃度——細(xì)胞抑制率曲線如圖2－4所示.

圖2 3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1) 對PC－12細(xì)胞抑制率曲線

圖3 3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸(A2) 對PC－12細(xì)胞抑制率曲線

圖4 3β，5α，6β－三羥基孕甾－20－酮(A3) 對PC－12細(xì)胞抑制率曲線

(2)IC50值

表1 化合物A1－A3對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞體外IC50值

4 討論與結(jié)論

目前，惡性腫瘤的治療方法仍然是以手術(shù)、化療、放療為主的綜合治療.臨床常用的化療藥物主要是通過細(xì)胞毒作用殺傷腫瘤細(xì)胞，但由于大多數(shù)化療藥物毒性大，許多患者難以承受［7］.需要研制新抗腫瘤藥以提高療效，降低毒副作用，提升病人的生活質(zhì)量.近年來發(fā)現(xiàn)很多甾體化合物具有抗腫瘤活性，而且毒副作用小.

半數(shù)抑制濃度(IC 50)是指在用藥后存活的細(xì)胞數(shù)量減少一半時所需的藥物濃度，是標(biāo)志藥物效應(yīng)的一種重要定量指標(biāo).本實(shí)驗(yàn)用MTT活細(xì)胞染色法研究了不同濃度的3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸(A2)、3β，5α，6β－三羥基孕甾－20－酮(A3)對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞的生長影響.3種藥物IC50值分別為0.0814mmol·L－1、0.0977mmol·L－1、0.2132mmol·L－1，對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞都有一定抑制作用.

3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸(A2)、 3β，5α，6β－三羥基孕甾－20－酮(A3)對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞體外活性研究未見報道.本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)(A1)、(A2)對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的活性較好，值得進(jìn)一步進(jìn)行藥效學(xué)、毒理、作用機(jī)制等研究.另外，孕烯醇酮衍生物與現(xiàn)有的抗癌藥物聯(lián)合使用增加治療效果也是下一步所追求的目標(biāo).

［1］劉躍金，耿曉宇，王晶明，等.羥基膽烷酸類和羥基膽甾烷類化合物的體內(nèi)抗癌活性［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2008，25(7):601－604.

［2］CARVALHO JFS，SILVA MMC，MOREIRA JN，et al.Selective cytotoxicity of oxysterols through structural modulation on rings A and B.synthesis，in vitro evaluation，and SAR［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2011，54(18):6375－6393.

［3］WANG P，TANG H，LIU BS，et al.Tumor cell growth inhibitory activity and structure activity relationship of polyoxygenated steroids from the gorgonian Menella kanisa［J］.Steroids，2013，78(9):951－958.

［4］LIU TF，LU X，TANG H，et al.3β，5α，6β－Oxygenated sterols from the South China Sea gorgonian Muriceopsis flavida and their tumor cell growth inhibitory activity and apoptosis－inducing function ［J］.Steroids，2013，78(1):108－114.

［5］張楊梅，李先盛，李紅玉，等.海洋鏈霉菌H41－59甾醇類化學(xué)成分及其細(xì)胞毒活性研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28 (5):690－695.

［6］Mouri K，Sako Y.Optimality conditions for cell－fate heterogeneity that maximize the effects of growth factors in PC12 cells［J］.PLoS Comput Biol，2013，9(11):e1003320.

［7］Zhang HT，Luo H，Wu J，et al.Galangin induces apoptosis of hepatocellular carcinoma cells via the mitochondrial pathw ay［J］.World J Gastroenterol，2010，16:3377－3384.

(責(zé)任編輯:王海波)

O626.21

A

1008－7974(2016)06－0058－03

10.13877/j.cnki.cn22－1284.2016.12.018

2016－10－25

耿曉宇，遼寧莊河人，碩士研究生，助教.