白藜蘆醇抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用與促進(jìn)骨形態(tài)蛋白9及其受體表達(dá)的關(guān)系研究

曾于樺，邵 英，李 洋，陳前昭，任文艷，周林云，周 益，劉榮興，何百成

(1. 重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，重慶 400016)

白藜蘆醇抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用與促進(jìn)骨形態(tài)蛋白9及其受體表達(dá)的關(guān)系研究

曾于樺1，2，邵 英1，2，李 洋1，2，陳前昭1，2，任文艷1，2，周林云1，2，周 益1，2，劉榮興1，2，何百成1，2

(1. 重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，重慶 400016)

目的 研究白藜蘆醇(resveratrol, Res)對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖的抑制作用與骨形態(tài)蛋白9(bone morphorgenetic protein 9, BMP9)之間的可能關(guān)系。方法 采用結(jié)晶紫染色與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Res對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Res對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。利用RT-PCR和Western blot檢測(cè)Res在LoVo細(xì)胞中對(duì)BMP9表達(dá)的影響，以及對(duì)BMP9的受體ALK2和ALK3表達(dá)的影響。采用ALK2和ALK3的抑制劑，通過結(jié)晶紫染色分析BMP9介導(dǎo)Res抑制LoVo細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。結(jié)果 與對(duì)照組相比，Res明顯呈濃度依賴性抑制LoVo細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞發(fā)生S期阻滯; Res呈濃度依賴性增加LoVo細(xì)胞凋亡比例；Res促進(jìn)BMP9的mRNA表達(dá)并明顯增加其蛋白水平；外源性過表達(dá)BMP9能增強(qiáng)Res對(duì)LoVo細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用；Res能誘導(dǎo)BMP9的受體ALK2和ALK3的mRNA表達(dá)，抑制ALK2和ALK3能明顯促進(jìn)LoVo細(xì)胞增殖，并減弱Res對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)論 Res對(duì)LoVo細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，這種作用可能與Res促進(jìn)BMP9及其受體表達(dá)有關(guān)。

白藜蘆醇；骨形態(tài)蛋白9；結(jié)腸癌；LoVo細(xì)胞；增殖抑制

結(jié)腸癌是臨床常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，每年約有近100萬新增結(jié)腸癌患者，大約60萬的患者死于結(jié)腸癌[1]。結(jié)腸癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化的關(guān)鍵信號(hào)通路調(diào)節(jié)失控被認(rèn)為是結(jié)腸癌的發(fā)生的主要原因之一，如TGF-β信號(hào)和Wnt/β-catenin信號(hào)等[2-3]。其中，TGF-β信號(hào)不僅參與調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育和個(gè)體內(nèi)環(huán)境平衡，同時(shí)也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化。研究顯示，TGF-β受體或Smad突變均能明顯增加結(jié)腸癌的發(fā)生危險(xiǎn)。近年來，隨著對(duì)結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步深入和開展早期篩查，其臨床治療已有較大改善，5年生存率也有明顯提高[1]。這種提高也與近年來一些靶向藥物的成功應(yīng)用有關(guān)，如貝伐單抗和西妥昔單抗等，但結(jié)腸癌的治療效果及預(yù)后狀況仍不十分理想[4]。因此，臨床急需開發(fā)新型或高效的結(jié)腸癌治療藥物?；熕幬锏亩拘耘c癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌治療所面臨的最主要挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)中藥是抗癌藥物的重要來源之一，如長(zhǎng)春新堿等早已用于結(jié)腸癌的治療[5]。白藜蘆醇(resveratrol, Res)又名芪三酚，主要來源于虎杖、葡萄、花生、桑葚等植物[6]。作為一種多酚類物質(zhì)，Res具有明顯的抗氧作用，故可用于防治高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病以及缺血性心臟病等疾病[7-8]。除此之外，研究表明Res還具有明顯的抗腫瘤作用，能有效地抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和肝癌等[9-10]。到目前為止，Res抗腫瘤作用的機(jī)制仍不十分清楚。本研究將進(jìn)一步分析Res抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用及可能的分子機(jī)制，為將Res開發(fā)成用于治療和預(yù)防結(jié)腸癌的藥物或輔助藥物提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及細(xì)胞培養(yǎng) LoVo細(xì)胞購(gòu)自American Type Culture Collection(ATCC)。白藜蘆醇(resveratrol, Res)購(gòu)自西安昊軒生物科技有限公司，所用一抗均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司，ALK2和ALK3抑制劑(LDN-193189)購(gòu)自賽力克公司(selleck)。LoVo細(xì)胞置于37 ℃，5%的CO2孵箱中，采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100 U·ml-1和鏈霉素0.1 g·L-1)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 按實(shí)驗(yàn)要求，設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。采用DMSO溶解Res，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞采用不同濃度的Res進(jìn)行處理，對(duì)照組細(xì)胞則用相同體積的DMSO進(jìn)行處理。

1.3 結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)良好的LoVo細(xì)胞消化后種到24孔板中，等細(xì)胞貼壁后用不同濃度的Res(0、10、20、40、60和80 μmol·L-1)或同體積的DMSO進(jìn)行處理。24 h、48 h或72 h后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，檢測(cè)Res對(duì)LoVo細(xì)胞增殖能力的影響。具體方法簡(jiǎn)述如下：棄培養(yǎng)基后用PBS小心清洗24孔板2次，每孔加5%的結(jié)晶紫染液(用PBS緩沖的10%甲醛配制)0.5 mL，于室溫下孵育20 min。棄結(jié)晶紫染液，然后用自來水將24孔板小心清洗干凈并置于空氣中自然風(fēng)干，最后進(jìn)行掃描或定量分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)周期和凋亡分析實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LoVo細(xì)胞均勻種于6孔板，等細(xì)胞貼壁以后采用不同濃度的Res(0、20、40和60 μmol·L-1)或同體積的DMSO進(jìn)行處理。48 h后收集細(xì)胞并按試劑盒說明書操作，然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行周期分析；對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凋亡分析時(shí)，利用不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞，按試劑盒說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.5 RNA提取及RT-PCR實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LoVo細(xì)胞消化并種到T25培養(yǎng)瓶，等細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的Res(0、20、40和60 μmol·L-1)或同體積DMSO進(jìn)行處理。利用TRIzol法提取總RNA,然后通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，最后通過PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平變化情況。所用引物如下：GAPDH 上游引物5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA -3′, 下游引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTG GTG-3′；BMP9上游引物5′-CCTGGGCACAACAAGGAC-3′,下游引物5′-CCTTCCCTGGCAGTTGAG-3′；ALK2上游引物5′-AGGGCTCATCACCACCAA-3′,下游引物5′-TTCCGTTTCCCTGAACCA-3′；ALK3上游引物5′-TCAGATGGTCCGGCAAGT-3′,下游引物5′-CATGGCGCATTAGCACAG-3′。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LoVo細(xì)胞消化后均勻種于6孔板，用不同濃度Res(0、20、40和60 μmol·L-1)或同體積DMSO對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)提取各處理組的總蛋白，按常規(guī)方法進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，最后利用ECL試劑盒顯影并采集圖像。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Res對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響 Res對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制作用，但具體機(jī)制仍不十分清楚。為進(jìn)一步分析Res抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，本研究首先分析Res對(duì)LoVo細(xì)胞的增殖影響。結(jié)晶紫染色分析結(jié)果顯示，Res對(duì)LoVo細(xì)胞的增殖抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性增強(qiáng)(Fig 1A)。周期分析結(jié)果顯示，Res能明顯誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞發(fā)生S期阻滯(Fig 1B)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Res對(duì)LoVo細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用。

Fig 1 Effects of Res on proliferation in LoVo cells

A:Crystal violet staining results showed the effect of Res on proliferation in LoVo cells; B：Flow cytometery analysis results showed the effect of Res on cell cycle arrest in LoVo cells

2.2 Res對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡的影響 抗腫瘤藥物多數(shù)都能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此本研究進(jìn)一步分析Res對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡的影響。流式分析結(jié)果顯示，經(jīng)Res處理后，LoVo細(xì)胞凋亡比例明顯隨藥物濃度升高而增加，當(dāng)Res為20 μmol·L-1時(shí)LoVo就已明顯出現(xiàn)凋亡(Fig 2)。結(jié)果提示, Res對(duì)LoVo細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用。

2.3 Res對(duì)LoVo細(xì)胞中BMP9表達(dá)的影響 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明Res對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，但具體機(jī)制仍不清楚。骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)屬于TGF-β超家簇成員，對(duì)細(xì)胞的增殖分化具有重要調(diào)節(jié)作用，同時(shí)BMPs信號(hào)的異常也與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展密切

Fig 2 Effects of Res on apoptosis in LoVo cells

Flow cytometry analysis results showed the effect of Res on apoptosis in LoVo cells.

相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，BMP9能抑制胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖，但目前尚不清楚BMP9是否對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞也有類似的作用。為此本研究首先分析Res在結(jié)腸癌細(xì)胞中對(duì)BMP9表達(dá)的影響。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Res能明顯促進(jìn)BMP9的mRNA表達(dá)(Fig 3A)。Western blot分析結(jié)果顯示，經(jīng)Res處理后LoVo細(xì)胞中BMP9蛋白水平也明顯升高(Fig 3B)。進(jìn)一步分析表明，在FHC和幾種常見的結(jié)腸癌細(xì)胞中，BMP9均存在內(nèi)源性表達(dá)；并且BMP9在FHC細(xì)胞中的水平明顯高于結(jié)腸癌細(xì)胞(Fig 3C)。結(jié)果提示 BMP9可能與Res抑制LoVo細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。

2.4 BMP9對(duì)Res抑制LoVo細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用的影響 Res能促進(jìn)BMP9表達(dá)，而BMP9本身對(duì)細(xì)胞的增殖與分化具有重要調(diào)節(jié)作用，因此本研究進(jìn)一步分析BMP9對(duì)Res抑制LoVo細(xì)胞增殖作用的影響。結(jié)果顯示，外源性過表達(dá)BMP9能明顯抑制LoVo細(xì)胞增殖(Fig 4A)，增強(qiáng)Res對(duì)LoVo細(xì)胞的S期阻滯作用(Fig 4B)，以及增強(qiáng)Res誘導(dǎo)Bad表達(dá)和抑制Bcl-2表達(dá)的作用(Fig 4C)；沉默BMP9雖然不能逆轉(zhuǎn)Res對(duì)Bcl-2表達(dá)的抑制作用，但能明顯減弱Res對(duì)Bad表達(dá)的誘導(dǎo)作用(Fig 4C)。結(jié)果提示，上調(diào)BMP9可能參與介導(dǎo)Res對(duì)LoVo細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。

2.5 ALK2/3對(duì)Res抑制LoVo細(xì)胞增殖作用的影響 BMP9與其受體ALK2和ALK3結(jié)合，通過經(jīng)典或非經(jīng)典BMPs/Smads信號(hào)通路發(fā)揮各種作用。RT-PCR分析結(jié)果顯示，Res能明顯促進(jìn)BMP9的受體，即ALK2和ALK3的表達(dá)(Fig 5A)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)Res處理后雖然BMP9表達(dá)明顯升高，但并未明顯增加Smad1/5/8的磷酸化水平，而是有一定程度降低。提示，BMP9在LoVo細(xì)胞中的作用可能與非經(jīng)典BMPs/Smads信號(hào)有關(guān)(Fig 5B)。進(jìn)一步分析表明，抑制ALK2/3能促進(jìn)LoVo細(xì)胞增殖，并減弱Res對(duì)LoVo細(xì)胞的增殖抑制作用(Fig 5C)。以上結(jié)果提示，BMP9可能通過非經(jīng)典BMPs/Smads信號(hào)介導(dǎo)Res對(duì)LoVo細(xì)胞的增殖抑制作用。

3 討論

結(jié)腸癌作為一種臨床常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，僅次于肝癌、肺癌和胃癌，每年全球約有近60萬的患者因結(jié)腸癌而死 亡[1]。目前治療結(jié)腸癌所面臨的主要挑戰(zhàn)包括傳統(tǒng)化療藥物的嚴(yán)重不良反應(yīng)以及癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等。雖然對(duì)結(jié)腸癌的診斷和治療水平都已有較大程度的提高，但其預(yù)后仍不十分樂觀。因此，臨床急需一些高效而低毒性的抗腫瘤藥物。本研究結(jié)果顯示，Res對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞具有明顯的增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用；Res的這種作用可能與其促進(jìn)BMP9及其受體表達(dá)有關(guān)，但Res促進(jìn)BMP9表達(dá)的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚。

Fig 3 Effects of Res on expression of BMP9 in LoVo cells

A： RT-PCR assay results showed the effect of Res on mRNA expression of BMP9 in LoVo cells； B： Western blot analysis results showed the effect of Res on the level of BMP9 in LoVo cells； C： Western blot analysis results showed the endogenous expression of BMP9 in FHC cell and colon cancer cells.

Fig 4 Effects of BMP9 on anti-proliferation and apoptosis inducing effects of Res in LoVo cells

A： Crystal violet staining results showed the effect of BMP9 on the proliferation of LoVo cells； B： Flow cytometry assay results showed the effect of BMP9 on Res induced cell cycle arrest in LoVo cells； C： Western blot analysis results showed the effect of exogenous BMP9 on Res-induced apoptosis in LoVo cells； D： Western blot analysis results showed the effect of knockdown BMP9 on Res-induced apoptosis in LoVo cells.

結(jié)腸癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，包括生活方式、年齡和基因突變等。文獻(xiàn)報(bào)道， TGF-β和Wnt/β-catenin等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在結(jié)腸癌細(xì)胞中明顯存在異常[2-3]。TGF-β信號(hào)在胚胎發(fā)育、個(gè)體穩(wěn)態(tài)的維持以及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化等過程中扮演著重要的角色。BMPs作為TGF-β超家族的成員，與其受體結(jié)合后通過經(jīng)典或非經(jīng)典BMPs/Smads信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等過程。BMPs信號(hào)參與調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，BMP6能抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，但促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移并對(duì)雄激素耐藥[11-12]；卵巢癌癌旁間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)部分BMPs成員，其中BMP4和BMP6對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，而BMP2則抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[13]。不同BMPs成員對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響不一致，可能與細(xì)胞種類以及細(xì)胞突變類型及微環(huán)境有關(guān)。研究表明，在結(jié)腸癌細(xì)胞中正常的BMPs信號(hào)能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，該信號(hào)異常與結(jié)腸癌發(fā)生有關(guān)；Samd4缺失明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]，BMP4能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞分化并增加其對(duì)化療藥物的敏感性[15]。BMP9是目前已發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化最強(qiáng)的因子之一，同時(shí)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖也具有明顯影響，如抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖[16-17]。到目前為止，BMP9對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響還不清楚。

Res是一種天然的多酚類物質(zhì)，主要來源于葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物。因具有明顯的抗氧化作用，所以Res可用于相關(guān)心血管疾病的防治，如動(dòng)脈粥樣硬化等。近來越來越多的研究表明，Res具有明顯的抗腫瘤作用，能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，如肺癌、肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞等[9-10]。Res的抗腫瘤作用機(jī)制可能與增強(qiáng)p53功能、抑制Wnt/β-catenin和促進(jìn)PTEN表達(dá)等有關(guān)[18-19]，但具體作用機(jī)制仍不清楚。

Fig 5 Effects of ALK2/3 inhibitor on the anti-proliferation effect of Res in LoVo cells

A:RT-PCR assay results show the effect of Res on the expression of ALK2 and ALK3 in LoVo cells; B: Western blot analysis results show the effect of Res on the phosphorylation of Smad1/5/8 in LoVo cells. (B) Crystal violet staining results show the effect of ALK2/3 inhibitor on the anti-proliferation effect of Res in LoVo cells(LDN: inhibitor for ALK2 and ALK3).

課題組前期研究已證實(shí)Res對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，機(jī)制可能與促進(jìn)PTEN表達(dá)有關(guān)[20 ]；由于BMP9在促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的過程中，能明顯抑制PTEN表達(dá)，所以課題組推測(cè)Res抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖可能與抑制BMP9表達(dá)有關(guān)。結(jié)果顯示，Res不僅不抑制BMP9表達(dá)，而且明顯促進(jìn)BMP9表達(dá)；BMP9在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC中的表達(dá)水平明顯高于在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平(Fig 3)。提示BMP9可能對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖具有重要調(diào)控作用并參與Res對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用。進(jìn)一步分析表明，外源性過表達(dá)BMP9能抑制LoVo細(xì)胞的增殖，并明顯增強(qiáng)Res對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用(Fig 4A，B)；外源性過表達(dá)BMP9明顯增強(qiáng)Res誘導(dǎo)LoVo凋亡的作用，而沉默BMP9則能部分逆轉(zhuǎn)Res對(duì)LoVo細(xì)胞的這種作用(Fig 4C，D)。因此Res抑制LoVo細(xì)胞增殖可能與其促進(jìn)BMP9表達(dá)有關(guān)。BMP9與其受體結(jié)合后可通過經(jīng)典與非經(jīng)典BMPs/Smads信號(hào)發(fā)揮作用。結(jié)果顯示,Res能促進(jìn)BMP9的受體(ALK2和ALK3)表達(dá)，但并不能增加Smad1/5/8的磷酸化水平；同時(shí)，抑制ALK2和ALK3明顯減弱Res對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的抑制作用(Fig 5)。提示，在LoVo細(xì)胞中，BMP9可能通過非經(jīng)典的BMPs/Smads信號(hào)發(fā)揮對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。

本研究結(jié)果證實(shí)Res能明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，具有潛在治療和預(yù)防結(jié)腸癌的作用；Res可能通過促進(jìn)BMP9表達(dá)并激活非經(jīng)典BMPs/Smads信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)這種作用，但具體機(jī)制仍不清楚。課題組將進(jìn)一步分析Res在結(jié)腸癌細(xì)胞中促進(jìn)BMP9表達(dá)及抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的可能分子機(jī)制，研究結(jié)果將有利于促進(jìn)Res的臨床應(yīng)用開發(fā)。

[致謝:本研究主要在重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。課題組感謝芝加哥大學(xué)何通川(Tongchuan He)教授為本研究提供所需的重組腺病毒載體(BMP9和GFP)]

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Study on relationship between anti-proliferation effect of resveratrol and resveratrol-induced bone morphogenetic protein 9 and its receptors in colon cancer cells

ZENG Yu-hua1,2,SHAO Ying1,2,LI Yang1,2,CHEN Qian-zhao1,2,REN Wen-yan1,2,ZHOU Lin-yun1,2,ZHOU Yi1,2,LIU Rong-xing1,2,HE Bai-cheng1,2

(1.DeptofPharmacology,SchoolofPharmacy,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2.ChongqingKeyLaboratoryofBiochemistryandMolecularPharmacology,Chongqing400016,China)

Aim To study the anti-proliferation effect of resveratrol (Res) and the role of Res-induced bone morphorgenetic protein 9 (BMP9) in this process in colon cancer cells. Methods Crystal violet staining and flow cytomtry were introduced to assay the anti-proliferation effect of Res in LoVo cells. The effect of Res on apoptosis in LoVo cells was also detected with flow cytometry. Then, RT-PCR and Western blot assay were employed to unveil the effect of Res on the expression of BMP9. The effect of BMP9 on the anti-proliferation of Res in LoVo cells was analyzed with crystal violet staining and flow cytometry too. Finally, the effect of Res on the expression of ALK2 and ALK3 was assayed with RT-PCR, and the inhibitor of ALK2 and ALK3 was used to figure out the possible mechanism of BMP9 on Res-induced proliferation inhibition in LoVo cells. Results Res apparently inhibited the proliferation, arrested the cell cycle at S phase in LoVo and increased the percentage of apopotic cells in LoVo cells. Res increased the expression of mRNA and protein of BMP9 concentration dependently. Exogenous expressed-BMP9 enhanced the anti-proliferation and apoptosis inducing effects of Res in LoVo cells, but BMP9 knockdown decreased these effects of Res. Although Res had no apparent effect on increasing the phosphorylation of Smad1/5/8, it increased the expression of ALK2 and ALK3. Inhibition of ALK2 and ALK3 decreased the anti-proliferation effect of Res partly in LoVo cells. Conclusion Res is potent to inhibit the proliferation of LoVo cells, Which may be mediated by up-regulating the expression of BMP9 and its receptor at least.

resveratrol; BMP9; colon cancer; LoVo cells; anti-proliferation

時(shí)間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.028.html

2016-07-08，

2016-09-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81572226)

曾于樺(1991-)，女，碩士生，研究方向：分子藥理學(xué)，E-mail: 214981529@qq.com； 何百成(1972-)，男，博士，教授，研究方向：分子藥理學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)，通訊作者，E-mail: hebaicheng99@yahoo.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.014

A

1001-1978(2016)12-1705-07

R282.71；R329.24；R341；R392.11；R735.35；R979.1