8周耐力訓(xùn)練對Nrf2敲除鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控的影響

劉雨佳，毛雅蕓，張 纓

體育科學(xué)

8周耐力訓(xùn)練對Nrf2敲除鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控的影響

劉雨佳，毛雅蕓，張 纓

目的：研究8周耐力訓(xùn)練對Nrf2敲除鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+調(diào)節(jié)的作用及機制。方法：8周齡Nrf2敲除鼠和野生鼠各20只，分別隨機分為安靜組和運動訓(xùn)練組，即野生安靜組(WC)、野生運動組(WE)、敲除安靜組(KC)和敲除運動組(KE)。運動組動物適應(yīng)性訓(xùn)練1周后在標(biāo)準小動物跑臺上進行跑臺運動。運動方案：坡度0°，12 m/min，60 min/天，5天/周，共持續(xù)8周。在最后一次運動48 h后，所有小鼠脫頸椎處死，取兩側(cè)腿部骨骼肌。采用甲基百里香酚藍比色法測定骨骼肌中Ca2+濃度，Western Blot方法測定骨骼肌總蛋白蘭尼定受體(RyR)、FK506結(jié)合蛋白(FKBP12)、鈣調(diào)蛋白(CaM)和肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA)的表達。結(jié)果：1)KC組RyR、FKBP12、CaM蛋白表達顯著高于WC組(P<0.05)；KE組CaM蛋白表達顯著低于KC組(P<0.05)；2)KC組SERCA1蛋白表達顯著低于WC組(P<0.05)，KE組SERCA1蛋白表達顯著高于KC組(P<0.05)；3)Nrf2敲除鼠骨骼肌組織中Ca2+濃度與野生鼠無差異，8周耐力訓(xùn)練后也無顯著性變化。結(jié)論：1)Nrf2敲除鼠骨骼肌鈣釋放通道RyR和鈣調(diào)蛋白CaM表達呈現(xiàn)代償性增加。骨骼肌SERCA1蛋白表達減少，鈣回收功能下降；2)8周耐力訓(xùn)練增強了骨骼肌鈣釋放功能，對于野生鼠增加了鈣釋放通道RyR的表達，而對于Nrf2敲除鼠CaM對RyR功能的抑制作用減弱。另外，8周耐力訓(xùn)練可以改善Nrf2缺失引起的鈣回收功能下降。

耐力訓(xùn)練；Nrf2；Ca2+調(diào)控；骨骼肌

1 前言

Ca2+作為生物體內(nèi)的重要第二信使，參與了細胞內(nèi)多項生命活動的發(fā)生與調(diào)節(jié)，如：肌肉收縮[20]、腺體分泌[21]、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[13]、細胞凋亡[15]等。在骨骼肌收縮過程中，Ca2+是興奮收縮耦聯(lián)的必要物質(zhì)，肌漿網(wǎng)對胞漿鈣離子濃度([Ca2+]i)的調(diào)控是保證骨骼肌收縮的必要前提[23]。在長

時間大強度運動中，運動所需能量增加，引起骨骼肌線粒體電子漏增加以及黃嘌呤代謝途徑的激活，導(dǎo)致骨骼肌自由基生成增多[16,17]。增多的自由基，一方面可以引起肌漿網(wǎng)鈣通道功能失調(diào)，造成骨骼肌胞漿內(nèi)Ca2+超載，影響肌纖維興奮-收縮耦聯(lián)功能，從而使骨骼肌的收縮功能下降[8]。另一方面，自由基可攻擊線粒體膜，使線粒體鈣攝取增加，使能量代謝出現(xiàn)障礙，并進一步刺激自由基的生成，產(chǎn)生惡性循環(huán)[27]。因此，過量自由基導(dǎo)致的骨骼肌肌漿網(wǎng)對[Ca2+]i的失調(diào)是導(dǎo)致骨骼肌運動性疲勞的一個重要因素[12]。同時，長期適宜的耐力訓(xùn)練可以增強骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控能力[3]，但作用機理并不十分清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2p45-related factor 2，Nrf2)作為轉(zhuǎn)錄因子，被認為是細胞抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者[24]。當(dāng)機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，Nrf2被激活，進入細胞核，識別并結(jié)合核內(nèi)大部分抗氧化酶基因中啟動子含有的特異DNA序列——抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)，從而可啟動一系列抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)多種保護性酶的表達，以清除體內(nèi)過多的自由基[14,19,26]。已有研究證實，Nrf2在運動引起的骨骼肌氧化應(yīng)激過程中可上調(diào)抗氧化酶表達，對骨骼肌細胞起著重要的保護作用[2,25]，那么Nrf2是否也介導(dǎo)了對骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)作用呢？目前國內(nèi)、外鮮見報道。因此，本研究試圖以Nrf2為切入點，探討長期耐力訓(xùn)練對骨骼肌肌漿網(wǎng)的鈣調(diào)節(jié)的影響及可能的機制。

2 研究對象與方法

2.1 研究對象

8周齡Nrf2敲除小鼠(來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所)，及同周齡野生型C57BL/6J小鼠(購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司)各20只，分別隨機分為安靜對照組和運動組，每組10只，即野生安靜組(WC)、野生運動組(WE)、敲除安靜組(KC)和敲除運動組(KE)。保持動物飼養(yǎng)房內(nèi)燈光 12∶12晝夜循環(huán)照明，室內(nèi)濕度控制在50%～70%，室溫保持在22℃～25℃，自由飲食、飲水，以國家標(biāo)準嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

WC組和KC組小鼠正?；\中活動，WE組和KE組小鼠首先進行1周適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，方案為：坡度0°，跑速12 m/min，持續(xù)時間15 min/天，運動頻率5天/周。之后采用正式訓(xùn)練方案：坡度0°，跑速12 m/min(約75%最大攝氧量強度[11])，運動強度持續(xù)時間60 min/天，運動頻率5天/周，共8周。

2.2 取材

所有小鼠取材均在最后一次運動后48 h進行。小鼠脫頸椎處死，立即取小鼠兩側(cè)腿部骨骼肌，迅速稱量，用錫紙包裹，標(biāo)記，立刻投入液氮中。然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，保存待用。

2.3 骨骼肌組織鈣含量測定

Ca2+含量測定采用甲基百里香酚藍(MTB)比色法測定，組織中Ca2+在堿性溶液中與甲基百里香酚藍結(jié)合，生成藍色絡(luò)合物,通過比色與同樣處理的鈣標(biāo)準進行比較，可計算出Ca2+含量。取100 mg骨骼肌，以去離子水為介質(zhì)勻漿，取上清液。根據(jù)試劑盒說明，加入工作液，酶標(biāo)儀測定吸光度計算出組織中Ca2+含量。

2.4 Western Blot測定鈣調(diào)控蛋白表達

取100 mg凍存骨骼肌組織，加入1 mL含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液(碧云天)中。剪碎，高速勻漿;冰上靜置 30 min;12 000 r/min，4℃離心 30 min，取上清液于離心管中，-20℃凍存?zhèn)溆谩２捎妹绹鳳ierce公司生產(chǎn)的蛋白濃度試劑盒，BCA方法測定骨骼肌的蛋白濃度。以上樣蛋白量20 μg為1次上樣量，根據(jù)測定的蛋白濃度計算蛋白上樣量。采用美國life technologies公司產(chǎn)Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus和NuPAGE 3%～8% Tris-Acetate凝膠，電泳分離鈣調(diào)蛋白(CaM)、FK506結(jié)合蛋白(FKBP12)、Ca2+-ATP酶(SERCA)、蘭尼定受體(RyR)及內(nèi)參(β-actin)，然后采用美國Invitrogen公司的iBlot Gel Transfer System轉(zhuǎn)移電泳膠將電泳后蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃一抗過夜(CaM一抗：Santa Crus 稀釋比例1∶200；FKBP12一抗：Santa Crus 稀釋比例1∶200；SERCA1一抗：Santa Crus 稀釋比例1∶500；SERCA2一抗：Santa Crus 稀釋比例1∶200；RyR一抗：Santa Crus 稀釋比例1∶200；β-actin一抗：Santa Crus 稀釋比例1∶1 000)。次日TBST洗3次，每次10 min。然后用二抗[羊抗兔(中杉金橋) ：CaM( 1∶2 000)，羊抗小鼠(中科晨宇)：FKBP12(1∶1 000)，SERCA1(1∶5 000)，SERCA2(1∶2 000)，RyR(1∶5 000)，β-actin(1∶5 000)]室溫孵育搖床1 h，后用 TBST 洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光顯影，膠片曝光，放入Bio-Rad 凝膠成像儀中進行拍攝得到目的條帶圖像。用Image Lab軟件讀取條帶的積分灰度值，用公式(1)計算的比值表示最后的結(jié)果。

(1)

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

3 研究結(jié)果

3.1 骨骼肌Nrf2蛋白表達

為了驗證Nrf2基因敲除動物模型，本實驗用Western Blot方法測定了4組小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達，結(jié)果如圖1所示：Nrf2 敲除鼠中并未呈現(xiàn)Nrf2抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，而野生鼠中則顯示出清晰的Nrf2條帶，表明Nrf2基因敲除小鼠模型建立成功；另外，經(jīng)過8周耐力訓(xùn)練后，野生鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達明顯升高。

圖 1 各組小鼠骨骼肌Nrf2總蛋白表達量Figure 1. The Expression of Nrf2 in Mice Skeletal Muscle among Groups

3.2 耐力訓(xùn)練對細胞內(nèi)鈣離子調(diào)節(jié)蛋白表達的影響

3.2.1 耐力訓(xùn)練對RyR表達的影響

如圖2所示，與WC組相比，WE組RyR表達顯著增加(P<0.05)，即8周耐力訓(xùn)練顯著增加了野生鼠骨骼肌RyR的表達。與KC組相比，KE組RyR表達無顯著性差異，8周耐力訓(xùn)練對Nrf2敲除鼠RyR表達作用不明顯。與WC組相比，KC組RyR表達顯著增加(P<0.05)。

圖 2 8周耐力運動對骨骼肌RyR蛋白表達的影響Figure 2. Effects of Eight Weeks Endurance Exercise Training on Protein Expression of RyR in Mice Skeletal Muscle

注：*表示與同種鼠的對照組相比P<0.05，#表示與同種干預(yù)方式下的WT鼠相比P<0.05，下同。

3.2.2 耐力訓(xùn)練對FKBP12表達的影響

如圖3所示，與WC組相比，KC組FKBP12表達顯著增加(P<0.05)，而KE組與WE組無明顯差異；與相同基因型安靜組相比，運動組與安靜組無顯著變化。在安靜狀態(tài)下，Nrf2的缺失使FKBP12表達增加，而8周耐力訓(xùn)練對FKBP12表達影響不明顯。

圖 3 8周耐力運動對骨骼肌FKBP12蛋白表達的影響Figure 3. Effects of Eight Weeks Endurance Exercise Training on Protein Expression of FKBP12 in Mice Skeletal Muscle

3.2.3 耐力訓(xùn)練對CaM表達的影響

如圖4所示，與WC組相比，KC組CaM表達顯著增高(P<0.05)，而KE組與WE組相比，無顯著性差異。與KC組相比，KE組CaM表達顯著降低(P<0.05)，而WE組與WC組無顯著性變化。Nrf2的缺失使CaM表達增加，而8周耐力訓(xùn)練可以使由于Nrf2的缺失引起的CaM增加得到恢復(fù)。

圖 4 8周耐力運動對骨骼肌CaM蛋白表達的影響Figure 4. Effects of Eight Weeks Endurance Exercise Training on Protein Expression of CaM in Mice Skeletal Muscle

3.2.4 耐力訓(xùn)練對SERCA表達的影響

如圖5所示，KC組SERCA1表達顯著低于WC組(P<0.05)，而KE組顯著高于KC組(P<0.05)。但是，WE組與WC組無差異。KC組SERCA2蛋白表達較WC組有降低趨勢，但無顯著差異。各組間SERCA2表達均無顯著性差異。Nrf2的缺失使SERCA1表達減少，8周耐力訓(xùn)練可以促進Nrf2敲除鼠SERCA1的恢復(fù)。

3.3 耐力訓(xùn)練對骨骼肌組織鈣離子濃度的影響

如圖6中所示，各組骨骼肌的Ca2+濃度無明顯差異，Nrf2敲除并未引起骨骼肌組織中鈣離子濃度明顯變化，8周耐力訓(xùn)練也未對骨骼肌組織中鈣離子濃度產(chǎn)生明顯影響。

圖 5 8周耐力運動對骨骼肌SERCA蛋白表達的影響Figure 5. Effects of Eight Weeks Endurance Exercise Training on Protein Expression of SERCA in Mice Skeletal Muscle

圖 6 8周耐力訓(xùn)練對骨骼肌組織鈣離子濃度的影響Figure 6. Effects of Eight Weeks Endurance Exercise Training on [Ca2+] in Mice Skeletal Muscle

4 分析討論

在體實驗和離體實驗均證實，Nrf2的缺失引起細胞或組織氧自由基(ROS)的生成增多[18,22]，出現(xiàn)多器官功能失調(diào)。ROS的增加是影響骨骼肌鈣信號的重要因素，本研究試圖將Nrf2與骨骼肌肌漿網(wǎng)的鈣調(diào)控相結(jié)合，進一步闡述Nrf2在骨骼肌鈣調(diào)控中的作用機制。

肌漿網(wǎng)對胞漿Ca2+濃度的調(diào)控是通過對Ca2+的釋放和回收來實現(xiàn)的，這也是興奮-收縮耦聯(lián)的基礎(chǔ)。如圖7中所示，RyR是肌漿網(wǎng)上主要的Ca2+釋放通道，介導(dǎo)了肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+的快速釋放，其活動受到多種蛋白的調(diào)控，其中包括FKBP12和CaM等。FKBP12可以與RyR緊密結(jié)合，維持RyR 4個亞基之間疏水性區(qū)域的相互聯(lián)系[1]，因此，F(xiàn)KBP12被認為是RyR的穩(wěn)定蛋白，維持RyR的正常結(jié)構(gòu)和功能。CaM對RyR的調(diào)節(jié)取決于Ca2+的濃度。在低濃度Ca2+(nmol/L)時，促進肌漿網(wǎng)對Ca2+的釋放，提高RyR的活化敏感性；在高濃度Ca2+(μmol/L)時，CaM對RyR的活性起抑制作用。SERCA是肌漿網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運 ATP酶，其功能是將Ca2+回收至肌漿網(wǎng)。SERCA1主要表達于骨骼肌快肌纖維，而SERCA2表達于慢肌纖維和心肌。

圖 7 肌漿網(wǎng)對Ca2+調(diào)節(jié)作用的分子機制Figure 7. Molecular Mechanism of Regulation of Sarcoplasmic Reticulcon of Calcium

4.1 Nrf2對骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控的作用

有研究發(fā)現(xiàn)，H2O2作為氧化應(yīng)激的刺激劑可以激活肌漿網(wǎng)對Ca2+的釋放，增加RyR通道的開放概率[6,10]。本研究中結(jié)果顯示，Nrf2敲除鼠RyR、FKBP12表達顯著增加，與上述文獻結(jié)果基本一致。由于Nrf2的缺乏，體內(nèi)ROS積累，使Nrf2敲除鼠骨骼肌鈣釋放功能長期處于代償狀態(tài)，RyR和FKBP12表達呈現(xiàn)代償性增加。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2敲除鼠CaM表達較野生鼠增多，增加的CaM可能會對RyR活性起到抑制作用。推測由于RyR的表達增加，為了維持肌漿網(wǎng)鈣釋放功能在正常范圍內(nèi)，CaM也呈現(xiàn)代償性增加。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，Nrf2敲除鼠SERCA1表達較野生鼠顯著降低。表明Nrf2敲除鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)對Ca2+的回收功能降低。Ralf等人[9]關(guān)于Nrf2敲除鼠心肌SERCA2a表達顯著性降低的結(jié)果，與我們骨骼肌的結(jié)果相一致，盡管組織不同，但機制可能相同，仍有待于進一步研究。

4.2 有氧運動訓(xùn)練對Nrf2敲除鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控的作用

有氧耐力運動是一種非常普遍的健身方式，對機體多個系統(tǒng)的生理功能都有有益的影響。有研究表明，耐力訓(xùn)練可以增加大鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+的釋放率，推測可能的機制是RyR通道表達和/或活性增加[3,4,5]。本研究發(fā)現(xiàn)，野生鼠運動組較安靜組RyR表達增加，與前人結(jié)果相一致。對于Nrf2敲除鼠，8周耐力訓(xùn)練后RyR表達變化并不明顯，但CaM表達顯著降低。這說明，由于CaM表達的下降，可減弱CaM對RyR的抑制，從而增強RyR的作用，促進骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+釋放。

前人有研究顯示，耐力訓(xùn)練同樣可以增強肌漿網(wǎng)Ca2+的回收功能。肌漿網(wǎng)回收Ca2+能力主要通過SERCA活性和SERCA蛋白表達來實現(xiàn)[7]。本研究中SERCA1和SERCA2在運動組中蛋白表達呈現(xiàn)增加的趨勢，但是并無顯著性。在實驗中SERCA1和SERCA2的活性是否得到提高，仍需要驗證。對于Nrf2敲除鼠，8周耐力訓(xùn)練可以改善由于Nrf2的缺失引起的SERCA表達降低，恢復(fù)肌漿網(wǎng)對Ca2+的回收功能。耐力訓(xùn)練是通過何種途徑來影響RyR、CaM、SERCA的表達，目前仍不清楚。

4.3 有氧耐力訓(xùn)練對骨骼肌組織鈣濃度的影響

對于骨骼肌組織中Ca2+濃度檢測發(fā)現(xiàn)，在安靜狀態(tài)下，各組骨骼肌的Ca2+濃度均維持在正常范圍，無明顯差異。Nrf2敲除并未引起骨骼肌組織中Ca2+濃度明顯變化，雖然Nrf2敲除鼠RyR表達增加，但是，由于CaM表達也代償性增加，因而CaM對RyR的抑制作用也加強，因此整體Nrf2的缺失并未表現(xiàn)出Ca2+濃度的異常。

8周耐力訓(xùn)練也未對骨骼肌組織中Ca2+濃度產(chǎn)生顯著影響，說明肌漿網(wǎng)的鈣釋放和回收功能在8周耐力訓(xùn)練后可能產(chǎn)生了一定的適應(yīng)，總體鈣調(diào)控功能得到改善，使得骨骼肌Ca2+濃度在靜息狀態(tài)下能夠維持在正常生理范圍內(nèi)。

5 結(jié)論

1.Nrf2敲除鼠骨骼肌鈣釋放通道RyR和鈣調(diào)蛋白CaM表達呈現(xiàn)代償性增加。同時，骨骼肌SERCA1蛋白表達減少，鈣回收功能下降；

2.8周耐力訓(xùn)練增強了骨骼肌鈣釋放功能，對于野生鼠增加了鈣釋放通道RyR的表達，而對于Nrf2敲除鼠CaM對RyR功能的抑制作用減弱。另外，8周耐力訓(xùn)練可以改善Nrf2缺失引起的鈣回收功能下降。

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The Effects of Endurance Training on the Regulation of Sarcoplasmic Reticulum Calcium in Nrf2 Knockout Mice

LIU Yu-jia,MAO Ya-yun,ZHANG Ying

Objective:To investigate the effects of eight weeks endurance training on the regulation of sarcoplasmic reticulum calcium in Nrf2 knockout mice.Methods:Eight weeks Nrf2 knock out (KO)mice and wild mice were randomly assigned to a sedentary control group and an exercise training group (n=10):wild control group (WC),wild exercise group (WE),KO control group (KC)and KO exercise group (KE).Mice in exercise groups underwent 60min/day treadmill running at speed of 12m/min for eight weeks.Skeletal muscle was collected 48 hours after training.The concentration of Ca2+([Ca2+])was tested by MTB.The protein expressions of Nrf2,RyR,FKBP12,CaM and SERCA in skeletal muscle were analyzed by Western Blot.Results:1)Campared with WC,the expression of RyR,FKBP12 and CaM in KC were significantly increased (P<0.05); while after eight weeks training decreased the expression of CaM in KE than KC(P<0.05); 2)SERCA1 in KC was decreased than WC (P<0.05),while SERCA1 was increased in KE than KC; 3)There is no difference of [Ca2+] among groups.Conclusion:1)The expression of RyR and CaM were compensatory increased in Nrf2 KO mice; The expression of SERCA1 was decreased in Nrf2 KO mice,inducing the capacity of recruiting Ca2+in sarcoplasmic reticulum was decreased; 2)Eight weeks endurance training increased the capacity of sarcoplasmic reticulum Ca2+release by increasing the expression of RyR in wild mice,while by weakening the inhibition of CaM in Nrf2 KO mice.Eight weeks endurance training can repair the decline of the capacity of recruiting Ca2+in Nrf2 KO mice sarcoplasmic reticulum.

endurancetraining;Nrf2;Ca2+regulation;skeletalmuscle

1000-677X(2016)12-0053-05

10.16469/j.css.201612007

2016-09-06；

2016-11-07

國家自然科學(xué)基金資助項目(31471134)； 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助課題(2015ZX010)。

劉雨佳(1991-)，男，山東聊城人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動與氧化應(yīng)激，E-mail：liuyujia89@163.com；毛雅蕓(1995-)，女，江西上饒人，在讀碩士研究生，主要研究方向為運動與氧化應(yīng)激，E-mail：maoyayun11@163.com；張纓(1961-)，女，北京人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向為運動與骨骼肌代謝，Tel：(010)62989584，E-mail：zhyi9256@126.com。

北京體育大學(xué) 運動生物化學(xué)教研室， 北京 100084 Beijing Sport University,Beijing 100084,China.

G804.7

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