• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    瞬時受體電位陽離子通道蛋白6高表達對轉(zhuǎn)化生長因子—β1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)小鼠腎足細胞損傷的作用

    2017-01-05 14:45黃海庭林栩尤燕舞湯春榮
    右江醫(yī)學(xué) 2016年4期
    關(guān)鍵詞:細胞核腎小球誘導(dǎo)

    黃海庭++林栩++尤燕舞++湯春榮++古賢君++黃美英++覃幼玲++譚軍華++黃非凡

    【摘要】目的探討瞬時受體電位陽離子通道蛋白6(TRPC6)高表達對轉(zhuǎn)化生長因子β1 (TGFβ1)干預(yù)下體外培養(yǎng)小鼠腎足細胞nephrin、desmin、caspase9表達及細胞凋亡的影響。

    方法用脂質(zhì)體Lip2000將針對小鼠TRPC6的基因真核表達載體pEX3TRPC6轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠足細胞,48小時后Western blot檢測轉(zhuǎn)染后TRPC6蛋白表達變化。將足細胞分為4組:正常對照組,TGFβ1干預(yù)組,TGFβ1+pEX3NC組(空載體組),TGFβ1+pEX3TRPC6組(TRPC6高表達組),干預(yù)48小時后用western blot和real time PCR 檢測caspase9、desmin、nephrin蛋白和mRNA表達水平,用流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率,DAPI染色觀察凋亡細胞核形態(tài)學(xué)變化。

    結(jié)果轉(zhuǎn)染48 小時后TRPC6高表達組TRPC6蛋白水平較正常對照組明顯升高(P<0.01),空載體組TRPC6蛋白表達水平無明顯變化;TGFβ1干預(yù)48小時后caspase9、desmin蛋白和mRNA表達水平顯著升高(P<0.05),nephrin蛋白和mRNA表達水平明顯下降(P<0.01),使TRPC6高表達后上述變化更明顯(P<0.05);TGFβ1干預(yù)后足細胞凋亡增多并出現(xiàn)典型凋亡細胞核形態(tài)學(xué)改變,TGFβ1干預(yù)組足細胞凋亡率為(12.30±0.81)%,TRPC6高表達組凋亡率為(21.26±1.16)%,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),空載體組細胞凋亡率與TGFβ1干預(yù)組比較無明顯差異。

    結(jié)論TRPC6在 TGFβ1誘導(dǎo)足細胞損傷中發(fā)揮重要作用,其機制之一可能通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)足細胞凋亡,減少nephrin表達,增加desmin表達來實現(xiàn)。

    【關(guān)鍵詞】足細胞;轉(zhuǎn)化生長因子β1;凋亡;結(jié)蛋白;nephrin;caspase9

    中圖分類號:R692文獻標(biāo)識碼:ADOI:10.3969/j.issn.10031383.2016.04.003

    瞬時受體電位陽離子通道蛋白6(TRPC6)是新近發(fā)現(xiàn)的聯(lián)系足細胞裂孔隔膜與細胞骨架的重要分子,通過對人類多種獲得性蛋白尿性腎小球疾病的研究則表明TRPC6表達升高是足細胞損傷的重要因素[1],但TRPC6在足細胞損傷中的具體機制目前尚未完全明確。轉(zhuǎn)化生長因子β1 (TGFβ1)具有誘導(dǎo)足細胞損傷的作用,有研究表明TRPC6可能是TGFβ1下游作用因子之一[2~3],但TRPC6是否參與TGFβ1誘導(dǎo)足細胞的損傷過程,目前尚未檢索到相關(guān)研究。本研究通過基因過表達技術(shù),誘導(dǎo)足細胞TRPC6高表達,觀察TRPC6高表達對TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡及nephrin、desmin、caspase9表達的影響,以期為足細胞損傷的防治提供新靶點。

    1材料與方法

    1.1實驗細胞和試劑

    腎小球足細胞株(MPC5)購于上海復(fù)旦大學(xué)細胞中心,RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清[??寺∩锘瘜W(xué)制品(北京)有限公司],重組人TGFβ1(ProSpecTany)、BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物工程研究所)、RNA提取試劑盒(愛思進 AxyPrep)、SuperQuickRT MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)、UltraSYBR MixturePCR(北京康為世紀生物科技有限公司)、TRPC6、nephrin、desmin、GAPDH一抗及HRP標(biāo)記的二抗(美國Abcam),DAPI溶液(北京索萊寶),pEX3NC、pEX3TRPC6質(zhì)粒(上海吉瑪公司),F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋),Lipofeetamine2000(Invitrogen公司)。

    1.2足細胞培養(yǎng)

    腎小球足細胞培養(yǎng)參照文獻[4],并稍做修改,細胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

    1.3細胞轉(zhuǎn)染及分組

    實驗前一天,接種1×104細胞至24孔板中,加入500 μL含血清培養(yǎng)液,5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至65%融合。分別將pEX3NC、 pEX3TRPC6與脂質(zhì)體Lipofeetamine2000混合(1∶4),室溫靜置30分鐘后加入24孔板,以無血清的1640培養(yǎng)液孵育6小時后改用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24及48小時后通過倒置熒光顯微鏡觀察足細胞中GFP的表達,測定轉(zhuǎn)染效率(轉(zhuǎn)染細胞率=熒光蛋白表達細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%);48小時后應(yīng)用Western blot檢測TRPC6蛋白的表達。將細胞分為4組:正常對照組,TGFβ1干預(yù)組,TGFβ1干預(yù)+pEX3NC,TGFβ1干預(yù)+pEX3TRPC6組。在后3組細胞中加入TGFβ1,使其終濃度為12 ng/ml,干預(yù)48小時后收集各組細胞分別進行檢測,實驗重復(fù)3次。

    1.4real time RTPCR檢測caspase9、nephrin、desmin mRNA表達

    模型建立后按 RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA。用紫外分光光度計測 RNA 的濃度并用電泳測得RNA的完整性和降解情況。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求加入相應(yīng)的試劑,放入PTC200儀進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物均由上海生物工程公司生產(chǎn),引物序列見表1。反應(yīng)總體系20 μL,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min,95℃變性15 s,61.7℃延伸58 s,循環(huán)40次。同時設(shè)熔解曲線55℃~95℃ 10 s共81個循環(huán)。每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔,同時設(shè)空白對照和陰性對照,每個樣本重復(fù)3次,取其平均值為樣本Ct值。目標(biāo)基因相對于內(nèi)參基因進行相對定量,采用2△△CT法進行mRNA相對表達量的比較。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因特異性。

    去除24孔板中的培養(yǎng)液,每孔細胞中加入50 μL IP(IP使用前與PMSF混勻,使PMSF終濃度為1 mmol/L)充分裂解細胞,用槍頭上下吹打細胞10~20次后收集細胞至1.5 ml離心管中,14 000 g離心5 min,取上清液至200 μL離心管中得細胞總蛋白質(zhì),用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。將提取的總蛋白溶于5%SDS,100℃,5分鐘熱變性。每孔加50 μg總蛋白進行SDSPAGE凝膠電泳,300 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜2.5 h。3%BSA室溫封閉1小時,加入按適當(dāng)比例稀釋的一抗(兔抗TRPC6多克隆抗體,稀釋度1∶300;兔抗caspase9,稀釋度1∶300;兔抗nephrin,稀釋度1∶200;兔抗desmin,稀釋度1∶500;兔抗GAPDH,稀釋度1∶500),4℃冰箱搖床孵育過夜。TBST洗膜3次,10 min/次,加入羊抗兔多克隆二抗,稀釋度1∶5000,室溫孵育1小時,TBST洗膜3次,20 min/次,ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色,曝光、顯影、定影,掃描條帶,利用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值,以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶的灰度值的比值表示其相對含量,每組實驗重復(fù)3次,取其平均值。

    1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

    各組細胞先用預(yù)冷的PBS洗2次,然后用胰酶消化,1.5 ml離心管收集各組細胞,800 g離心5 min分鐘,去上清,用1 ml PBS重懸細胞,再次離心去上清,重復(fù)兩次以去除胰酶中的ETDA。最后將細胞重懸于150 μL結(jié)合緩沖液中,調(diào)整細胞濃度為1×106/ml,分別加入2.5 μL Annexin V和0.5 μL 100 μg/ml的PI溶液,室溫避光孵育15 min。上機檢測前補加200 μL結(jié)合液,輕輕混勻。立即將染色細胞進行流式分析,每組實驗重復(fù)3次,取其平均值。

    1.7DAPI熒光染色觀察足細胞凋亡的核形態(tài)學(xué)變化

    各組細胞干預(yù)72 h后,取10 μg 1 mg/ml的DAPI水溶液加到1 ml PBS中,配制成10 μg/ml的DAPI溶液,每孔細胞加入50 μL的10 μg/ml DAPI溶液,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞15 min,然后置于熒光顯微鏡360 nm激發(fā)波長下觀察,取圖。

    1.8統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 17.0軟件進行分析,計量資料先進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗,符合正態(tài)分布及方差齊性,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用方差分析,進一步兩兩比較采用q檢驗(NewmanKeuls法),檢驗水準(zhǔn):α=0.05。

    2結(jié)果

    2.1足細胞形態(tài)學(xué)觀察及特異性抗原nephrin檢測

    正常足細胞呈多邊形或梭形,細胞輪廓清晰,自細胞體伸出少量樹枝樣突起(圖1A)。間接免疫細胞化學(xué)染色:nephrin分布于胞膜、核周及細胞質(zhì)(圖1B)。real time RTPCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示該細胞系表達nephrin(圖1C),nephrin是足細胞特異性分子,因此可以認為實驗用細胞系來源于足細胞。

    A:正常足細胞形態(tài);B:免疫熒光染色nephrin在足細胞上的表達、分布;C:nephrin熒光定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳。

    2.2TRPC6轉(zhuǎn)染效率

    將pEX3NC、pEX3TRPC6轉(zhuǎn)染足細胞48小時后,Westernblot 結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pEX3TRPC6(高表達組)TRPC6蛋白明顯升高(P<0.05),傳染pEX3NC(空載體組)對TRPC6蛋白表達無明顯影響(P>0.05)。正常對照組、空載體組、高表達組TRPC6/GAPDH蛋白灰度值之比分別為(0.49±0.02)、(0.50±0.001)、(1.01±0.04)。見圖2A、B。

    A:westernblot蛋白條帶原始圖;B:目的蛋白表達相對灰度值之比,與正常組相比,a:P<0.01,與空載體組相比,b:P<0.01。

    2.3TRPC6高表達對TGFβ1干預(yù)下足細胞nephrin、caspase9、desmin mRNA表達的影響

    TGFβ1干預(yù)48小時后足細胞nephrin mRNA表達水平明顯降低(P<0.05),caspase9、desmin mRNA表達水平明顯升高(P<0.05),TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3TRPC6(TRPC6高表達) 組上述變化更加明顯 (P<0.05)。TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3NC (空載體)組與TGFβ1干預(yù)組nephrin、caspase9、desmin mRNA表達水平無明顯差異。見表2。

    2.4TRPC6高表達對TGFβ1干預(yù)下足細胞nephrin、caspase9、desmin 蛋白表達的影響

    TGFβ1刺激48小時后足細胞nephrin 蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),caspase9、desmin 蛋白表達水平明顯升高(P<0.01),TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3TRPC6(TRPC6高表達組)上述變化更加明顯 (P<0.05)。TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3NC(空載體組)與TGFβ1干預(yù)組nephrin、caspase9、desmin 蛋白表達水平無明顯差異。見圖3。

    2.5DAPI染色結(jié)果

    細胞核形態(tài)學(xué)改變是細胞凋亡的重要鑒別依據(jù)。在熒光顯微鏡下(圖4A),可觀察到正常足細胞的染色質(zhì)疏松,熒光強度相對較弱,細胞核大小一致,形態(tài)規(guī)則(圖4A); 細胞發(fā)生凋亡時染色質(zhì)濃縮,熒光強度增強,一些細胞核碎裂,呈現(xiàn)大小不一的熒光斑塊,即“凋亡小體”(圖4B); 各組細胞經(jīng)DAPI染色后均可見典型細胞凋亡的細胞核形態(tài)學(xué)改變,但各組細胞凋亡細胞數(shù)明顯不一(圖4C~F)。

    A:western blot 蛋白條帶原始;B:目的蛋白表達相對灰度值之比:與正常組相比,a:P<0.01;與TGFβ1干預(yù)組相比,b:P<0.01。

    A,B(×20倍):箭頭表示斷裂的染色質(zhì)及濃縮的細胞核,三角形表示正常細胞核;A:正常足細胞細胞核形態(tài),B:TGFβ1誘導(dǎo)足細胞凋亡的細胞核形態(tài)。C、D、E、F(×10倍):各組細胞核形態(tài)變化;C:正常對照組,D:TGFβ1干預(yù)組,E:TGFβ1干預(yù)+高表達組,F(xiàn):TGFβ1干預(yù)+高空載體組。

    2.6TRPC6高表達對TGFβ1誘導(dǎo)下足細胞凋亡的影響

    流式細胞術(shù)結(jié)果顯示正常對照組足細胞凋亡率為(1.34±0.15)%,應(yīng)用TGFβ1處理48 小時后凋亡率明顯升高,其凋亡率為(12.30±0.81)%,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而TGFβ1干預(yù)+TRPC6高表達組凋亡率為(21.26±1.16)%,明顯高于TGFβ1干預(yù)組(P<0.01),轉(zhuǎn)染空載體組細胞凋亡率為(13.20±1.25)%,與TGFβ1干預(yù)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5A~D、表3。

    A:正常組;B:TGFβ1干預(yù)組;C:TGFβ1干預(yù)+高表達組;D:TGFβ1干預(yù) + 空載體組

    3討論

    瞬時受體電位陽離子通道蛋白6(transient receptor potential channel6,TRPC6)作為瞬時受體電位超家族中的一員,是一種非選擇性的陽離子通道。TRPC6是2005年Winn研究小組通過對家族性遺傳性局灶節(jié)段性腎小球硬化癥研究所發(fā)現(xiàn),隨后免疫共沉淀技術(shù)顯示TRPC6和podocin、nephrin共表達,且與這些蛋白之間有相互作用,TRPC6參與構(gòu)成裂孔隔膜信號復(fù)合體[5], TRPC6的發(fā)現(xiàn)將足細胞裂孔隔膜蛋白與離子通道聯(lián)系起來,拓寬了足細胞分子網(wǎng)絡(luò),為復(fù)雜腎臟疾病的研究提供新的思路。但目前對于TRPC6的研究尚處于起步階段,具體作用機制尚未完全闡明。

    TRPC6基因突變可以導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性局灶節(jié)段性腎小球硬化,在高糖[6]、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)[7]、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)[8]的足細胞損傷過程中,TRPC6高表達可通過誘導(dǎo)細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流增加,引起足細胞骨架分布紊亂、裂孔隔膜蛋白表達異常。在糖尿病腎病[9]、膜性腎病[10]等多種人類獲得性蛋白尿性腎小球疾病中其表達量與蛋白尿程度呈正比。TGFβ1是公認的致腎臟纖維化細胞因子,具有誘導(dǎo)足細胞損傷的作用,但在此過程中TRPC6是否參與其中目前尚無研究。鑒于此,本研究通過轉(zhuǎn)染TRPC6真核表達載體至足細胞使其高表達TRPC6,觀察TRPC6高表達對TGFβ1干預(yù)下足細胞損傷的影響。通過實驗我們發(fā)現(xiàn),在TGFβ1作用下,nephrin表達明顯下降,desmin表達明顯增多,基因誘導(dǎo) TRPC6高表達后nephrin下降更加明顯,desmin表達升高更加明顯,這表明TRPC6高表達能促進TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞損傷過程,與上述研究結(jié)果相似。

    足細胞丟失是導(dǎo)致腎小球硬化的關(guān)鍵因素,而凋亡則是導(dǎo)致足細胞丟失的重要原因之一,深入探討足細胞凋亡機制對延緩腎小球硬化進程具有重要意義。TGFβ1是一種多功能細胞因子,參與細胞增殖分化、凋亡、血管形成、細胞外基質(zhì)形成等多種生物學(xué)事件[11]。在TGF損傷足細胞的多種機制中,促凋亡是其重要的環(huán)節(jié),但TRPC6與TGF誘導(dǎo)足細胞凋亡的關(guān)系目前國內(nèi)外尚未檢索到相關(guān)報道。因此,本研究中我們首先通過DAPI染色觀察足細胞核形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn),各組細胞經(jīng)DAPI染色后均可見典型細胞凋亡的細胞核形態(tài)學(xué)改變,TRPC6高表達后細胞凋亡數(shù)目明顯增多。由此可初步判斷TRPC6高表達參與TGF誘導(dǎo)的足細胞凋亡過程。為使實驗結(jié)果更有說服力,我們又通過流式細胞檢測各組細胞的凋亡率。結(jié)果顯示,TGFβ1作用48小時后足細胞凋亡率由(1.34±0.15)%增高至(1230±0.81)%,而使TRPC6高表達后凋亡率升高至(21.26±1.16)%,轉(zhuǎn)染空載體組細胞凋亡率較TGFβ1干預(yù)組無明顯差異。上述實驗結(jié)果說明TRPC6高表達參與了TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡過程。

    既往研究發(fā)現(xiàn),線粒體凋亡途徑在TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Das等[12]通過體外構(gòu)建TGFβ1誘導(dǎo)條件永生化小鼠足細胞損傷模型,發(fā)現(xiàn)TGFβ1通過SmadERK1/2mTORC1軸提高Nox4的表達,進而使ROS產(chǎn)生增多、線粒體功能障礙,最終導(dǎo)致足細胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶家族(caspase) 是一類凋亡特異性蛋白酶,在細胞凋亡過程中處于中心地位,其中caspase9是線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源凋亡途徑中首先被激活的因子[13]。為了進一步研究TRPC6在TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡中的可能作用機制,本實驗觀察了TRPC6高表達對TGFβ1干預(yù)下足細胞caspase9表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGFβ1作用48小時后足細胞caspase9表達水平明顯上調(diào),說明線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑確實參與了TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡過程,而當(dāng)使TRPC6高表達后caspase9在基因及蛋白水平均明顯升高,這說明TRPC6至少部分通過調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑caspase9的表達進而增加TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡。

    綜上所述,我們的研究表明TRPC6是TGF誘導(dǎo)足細胞損傷過程中的重要分子,通過加深TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡程度,減少nephrin表達,增加desmin表達可能是其作用機制之一。阻斷病理狀況下TRPC6的高表達或許是治療蛋白尿性腎臟疾病的新策略,我們將在后續(xù)試驗中進一步探討。

    參考文獻

    [1]SzabóT,Ambrus L,Zákány N,et al.Regulation of TRPC6 ion channels in podocytes Implications for focal segmental glomerulosclerosis and acquired forms of proteinuric diseases[J].Acta Physiol Hung,2015,102(3):241251.

    [2]姚興梅.晚期糖基化終末產(chǎn)物對腎小球系膜細胞瞬時受體電位陽離子通道蛋白 6(TRPC6)表達的影響[D].蘇州:蘇州大學(xué),2010.

    [3]Graham S,Yuan JP,Ma R.Canonical transient receptor potential channels in diabetes[J].Exp Biol Med (Maywood),2012,237(2):111118.

    [4]雷鳳英.全反式維甲酸對體外培養(yǎng)阿霉素致腎小球足細胞損傷的作用及其分子機制[D].南寧:廣西醫(yī)科大學(xué),2014.

    [5]Winn MP,Conlon PJ,Lynn KL,et al.A mutation in the TRPC6 cation channel causes familial focal segmental glomerulosclerosis[J].Science,2005,308(5729):18011804.

    [6]Sonneveld R,van der Vlag J,Baltissen MP,et al.Glucose specifically regulates TRPC6 expression in the podocyte in an AngIIdependent manner[J].Am J Pathol,2014,184(6):17151726.

    [7]Zhang H,Ding J,F(xiàn)an Q,et al.TRPC6 upregulation in Ang IIinduced podocyte apoptosis might result from ERK activation and NFkappaB translocation[J].Exp Biol Med (Maywood),2009,234(9):10291036.

    [8]Zhang X,Song Z,Guo Y,et al.The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZinduced diabetic rats[J].Mol Cell Biochem,2015,399(12):155165.

    [9]Ma R,Liu L,Jiang W,et al.FK506 ameliorates podocyte injury in type 2 diabetic nephropathy by downregulating TRPC6 and NFAT expression[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(11):1406314074.

    [10]Hofstra JM,Coenen MJ,Schijvenaars MM,et al.TRPC6 single nucleotide polymorphisms and progression of idiopathic membranous nephropathy[J].PLoS One, 2014,9(7):e102065.

    [11]Meng XM,Tang PM,Li J,et al.TGFβ/Smad signaling in renal fibrosis[J].Front Physiol,2015(6):82.

    [12]Das R,Xu S,Nguyen TT,et al.Transforming Growth Factor β1induced Apoptosis in Podocytes via the Extracellular Signalregulated KinaseMammalian Target of Rapamycin Complex 1NADPH Oxidase 4 Axis[J].J Biol Chem,2015,290(52):3083030842.

    [13]Brentnall M,RodriguezMenocal L,De Guevara RL,et al.Caspase9,caspase3 and caspase7 have distinct roles during intrinsic apoptosis[J].BMC Cell Biol,2013(14):32.

    (收稿日期:2016-04-24修回日期:2016-08-06)

    (編輯:梁明佩)

    猜你喜歡
    細胞核腎小球誘導(dǎo)
    指向科學(xué)思維的“細胞核的結(jié)構(gòu)與功能”教學(xué)設(shè)計
    青霉素鈉、鹽酸貝那普利片聯(lián)合腎復(fù)康膠囊治療急性腎小球腎炎的療效觀察
    玉米單倍體誘導(dǎo)系XKY—1和XKY—2的選育研究
    一類捕食食餌系統(tǒng)中交叉擴散誘導(dǎo)的圖靈不穩(wěn)和斑圖
    “細胞核—系統(tǒng)的控制中心”一節(jié)的教學(xué)設(shè)計
    母系遺傳對有氧耐力運動項目運動員選拔的影響
    治急性腎小球腎炎
    包頭智能停車誘導(dǎo)系統(tǒng)將建成
    高中生物必修模塊一“細胞核
    腎功能不全怎樣分級
    久久久精品94久久精品| 欧美激情国产日韩精品一区| 91精品国产九色| 精品欧美国产一区二区三| 午夜亚洲福利在线播放| 色哟哟·www| 久久久久久久久大av| 精品不卡国产一区二区三区| 看黄色毛片网站| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲av免费高清在线观看| 嫩草影院精品99| 九九热线精品视视频播放| 亚洲18禁久久av| 热99在线观看视频| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲成人av在线免费| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 国产v大片淫在线免费观看| 久久精品夜色国产| 中国美女看黄片| 乱人视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲精品成人久久久久久| 永久网站在线| 大香蕉久久网| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产伦在线观看视频一区| av在线老鸭窝| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产69精品久久久久777片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 2022亚洲国产成人精品| 国产免费男女视频| 精品久久久久久久久久久久久| 99热精品在线国产| 一本一本综合久久| 欧美zozozo另类| 久久精品综合一区二区三区| 91av网一区二区| 成人特级黄色片久久久久久久| 成人美女网站在线观看视频| 久久99热6这里只有精品| 久久午夜福利片| 欧美性感艳星| 日韩成人av中文字幕在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产三级中文精品| 不卡一级毛片| 国产老妇女一区| 婷婷亚洲欧美| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产亚洲精品av在线| 欧美高清成人免费视频www| a级一级毛片免费在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲在线观看片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日韩一区二区视频免费看| 天堂影院成人在线观看| 亚洲不卡免费看| 性欧美人与动物交配| 在线免费观看不下载黄p国产| 99久国产av精品国产电影| 99久国产av精品国产电影| 99在线视频只有这里精品首页| 好男人在线观看高清免费视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜福利视频1000在线观看| 在现免费观看毛片| 一本久久精品| 日本欧美国产在线视频| 免费观看的影片在线观看| 成人午夜高清在线视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 精品免费久久久久久久清纯| 久久久精品欧美日韩精品| 乱人视频在线观看| 久久6这里有精品| 欧美日韩乱码在线| 日本av手机在线免费观看| 久久久久久大精品| 久久精品综合一区二区三区| a级毛片a级免费在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 一级毛片久久久久久久久女| 黄色视频,在线免费观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 69人妻影院| 日本av手机在线免费观看| 欧美zozozo另类| 日日干狠狠操夜夜爽| 色播亚洲综合网| 最近手机中文字幕大全| 亚洲av免费高清在线观看| 久久精品夜色国产| 国产日本99.免费观看| 国内精品宾馆在线| 国产麻豆成人av免费视频| 51国产日韩欧美| 99热全是精品| 校园春色视频在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲人成网站高清观看| 国产日韩欧美在线精品| 看片在线看免费视频| 久久久欧美国产精品| 欧美高清成人免费视频www| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 日韩视频在线欧美| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产精品99久久久久久久久| 看免费成人av毛片| h日本视频在线播放| 天堂中文最新版在线下载 | 色尼玛亚洲综合影院| 国产在线男女| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩国内少妇激情av| 日本成人三级电影网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 全区人妻精品视频| 亚洲成人久久性| 日本色播在线视频| 免费观看a级毛片全部| 99久久精品热视频| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 欧美高清成人免费视频www| 国产成人精品久久久久久| 国产在视频线在精品| 国产精华一区二区三区| 嫩草影院精品99| 18禁在线播放成人免费| 69人妻影院| 成人无遮挡网站| 午夜精品在线福利| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品蜜桃在线观看 | 久久精品国产亚洲av涩爱 | 综合色丁香网| 国产精品久久视频播放| 99riav亚洲国产免费| 久久国内精品自在自线图片| 人妻少妇偷人精品九色| 国产视频内射| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品久久久噜噜| 国产午夜精品一二区理论片| av在线亚洲专区| av.在线天堂| 亚洲精品自拍成人| 欧美日韩精品成人综合77777| 我的女老师完整版在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 免费搜索国产男女视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 免费看av在线观看网站| 国产精品永久免费网站| 中文字幕久久专区| 97超碰精品成人国产| 国产精品99久久久久久久久| .国产精品久久| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品人妻视频免费看| 国产高清激情床上av| 久久人人爽人人爽人人片va| 日本av手机在线免费观看| 老司机影院成人| 国产精品久久久久久久久免| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 午夜福利在线观看免费完整高清在| 满18在线观看网站| 日本av免费视频播放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 人人澡人人妻人| 91精品伊人久久大香线蕉| 老司机亚洲免费影院| 妹子高潮喷水视频| 免费少妇av软件| kizo精华| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美日韩在线观看h| 激情五月婷婷亚洲| 嫩草影院入口| 青春草国产在线视频| 丝袜喷水一区| 大香蕉久久网| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 最后的刺客免费高清国语| 老司机影院成人| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产伦理片在线播放av一区| 免费看光身美女| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲天堂av无毛| 五月玫瑰六月丁香| 高清不卡的av网站| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲,欧美,日韩| 高清午夜精品一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 丰满乱子伦码专区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久久久久久国产电影| 亚洲丝袜综合中文字幕| 波野结衣二区三区在线| 蜜臀久久99精品久久宅男| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 制服人妻中文乱码| 99久久精品国产国产毛片| 久久精品国产a三级三级三级| kizo精华| 伊人亚洲综合成人网| 五月玫瑰六月丁香| 制服人妻中文乱码| 99久久综合免费| 午夜激情av网站| 国产在线一区二区三区精| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 热99久久久久精品小说推荐| .国产精品久久| 国产精品成人在线| 国产一区二区在线观看av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 午夜老司机福利剧场| 国产精品一区二区在线不卡| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲,一卡二卡三卡| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产在线一区二区三区精| av专区在线播放| 国产一区二区三区综合在线观看 | 免费少妇av软件| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲国产精品专区欧美| 欧美性感艳星| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 晚上一个人看的免费电影| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲在久久综合| 亚洲精品视频女| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 我要看黄色一级片免费的| a级毛色黄片| 伊人久久国产一区二区| 亚洲国产精品999| 国产免费福利视频在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| xxx大片免费视频| 一区二区三区免费毛片| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产毛片在线视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 有码 亚洲区| 亚洲四区av| 丁香六月天网| 亚洲在久久综合| 亚洲av中文av极速乱| 亚州av有码| 日韩免费高清中文字幕av| 国产爽快片一区二区三区| 99re6热这里在线精品视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产成人91sexporn| 在线观看免费高清a一片| 国产日韩欧美视频二区| 精品视频人人做人人爽| 99视频精品全部免费 在线| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 99热这里只有是精品在线观看| 午夜免费观看性视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美日韩视频精品一区| 视频中文字幕在线观看| a级毛色黄片| 18+在线观看网站| 国产永久视频网站| 2018国产大陆天天弄谢| 一本久久精品| 中文字幕免费在线视频6| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | a级毛片在线看网站| 国产一区二区在线观看av| 午夜福利视频精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产亚洲最大av| 婷婷色综合www| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久久久久久久久免费av| 欧美日韩在线观看h| 欧美另类一区| 国产成人aa在线观看| 精品一区二区三卡| 久久热精品热| 少妇的逼好多水| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美97在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲精品日本国产第一区| 91成人精品电影| 99国产综合亚洲精品| 亚洲av成人精品一二三区| 99九九线精品视频在线观看视频| 少妇 在线观看| 国产乱人偷精品视频| 亚洲成色77777| 成人黄色视频免费在线看| 99九九线精品视频在线观看视频| 久久久久精品性色| 在线观看免费视频网站a站| 免费高清在线观看日韩| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日本爱情动作片www.在线观看| 秋霞在线观看毛片| 国产不卡av网站在线观看| 久久免费观看电影| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲精品日本国产第一区| 久久这里有精品视频免费| 男的添女的下面高潮视频| 久久99热这里只频精品6学生| 日本黄色片子视频| 国产精品国产av在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 久久99蜜桃精品久久| 国产精品一区二区在线不卡| 免费黄色在线免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 伦理电影免费视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩av在线免费看完整版不卡| 大片电影免费在线观看免费| 精品国产露脸久久av麻豆| 日本vs欧美在线观看视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美一级a爱片免费观看看| 男女免费视频国产| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产日韩欧美在线精品| av网站免费在线观看视频| 亚州av有码| 亚洲精品第二区| 亚洲av成人精品一区久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| av免费在线看不卡| videossex国产| av在线老鸭窝| 美女大奶头黄色视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | .国产精品久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 最后的刺客免费高清国语| 国产高清三级在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 久久久久精品久久久久真实原创| av国产精品久久久久影院| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲美女视频黄频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品久久久噜噜| 满18在线观看网站| 丰满乱子伦码专区| 成人二区视频| 午夜福利,免费看| 精品久久久久久久久亚洲| 精品少妇内射三级| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产免费福利视频在线观看| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精品第二区| 免费看光身美女| 精品久久久久久电影网| 国产 精品1| 免费大片黄手机在线观看| 精品久久久久久电影网| 大香蕉97超碰在线| 久久狼人影院| av播播在线观看一区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩成人在线一区二区| 色视频在线一区二区三区| 免费黄网站久久成人精品| 两个人的视频大全免费| 天堂8中文在线网| 涩涩av久久男人的天堂| 久久久亚洲精品成人影院| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲精品一区蜜桃| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 2018国产大陆天天弄谢| 飞空精品影院首页| 国产免费福利视频在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 晚上一个人看的免费电影| 欧美xxⅹ黑人| 黄片播放在线免费| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日本-黄色视频高清免费观看| 人人澡人人妻人| 国产高清三级在线| 国产精品无大码| 插阴视频在线观看视频| 免费看不卡的av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 性色avwww在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 少妇丰满av| 性色avwww在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 免费观看a级毛片全部| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美+日韩+精品| 久久久久久久久大av| 99热6这里只有精品| 日本黄色日本黄色录像| 黑人高潮一二区| 免费看av在线观看网站| 高清午夜精品一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | av视频免费观看在线观看| 一区在线观看完整版| 插阴视频在线观看视频| 蜜桃在线观看..| 草草在线视频免费看| 最近2019中文字幕mv第一页| 黄色一级大片看看| 精品一区二区免费观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 七月丁香在线播放| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久久国产一区二区| 精品亚洲成国产av| 午夜av观看不卡| 女性被躁到高潮视频| 少妇高潮的动态图| 国产精品免费大片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 久久99一区二区三区| 国产av国产精品国产| 精品视频人人做人人爽| 亚洲av成人精品一二三区| 少妇熟女欧美另类| 日本-黄色视频高清免费观看| 免费观看性生交大片5| 少妇的逼水好多| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产一级毛片在线| 国产黄色免费在线视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 少妇人妻 视频| a级毛色黄片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 美女cb高潮喷水在线观看| 黄色配什么色好看| 一级二级三级毛片免费看| h视频一区二区三区| 99热网站在线观看| 香蕉精品网在线| 亚洲精品视频女| 99久国产av精品国产电影| .国产精品久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 久热这里只有精品99| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 免费观看的影片在线观看| 国产欧美亚洲国产| 欧美性感艳星| av专区在线播放| 在线观看三级黄色| av在线app专区| 日本午夜av视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| 91精品三级在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 午夜免费观看性视频| 女人精品久久久久毛片| 中文字幕制服av| 一区二区三区精品91| 日韩一区二区三区影片| 两个人的视频大全免费| 午夜91福利影院| 亚洲中文av在线| 久久综合国产亚洲精品| 国产免费又黄又爽又色| 国产一区二区在线观看日韩| 春色校园在线视频观看| 国产av一区二区精品久久| 免费观看a级毛片全部| 91在线精品国自产拍蜜月| 日本欧美国产在线视频| 日本欧美国产在线视频| 午夜福利视频精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 性色av一级| 久久久久久久久久久久大奶| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久国产一区二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 日本wwww免费看| 午夜精品国产一区二区电影| 日本色播在线视频| 另类精品久久| 最新的欧美精品一区二区| 午夜激情av网站| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲四区av| 国产有黄有色有爽视频| 在线观看免费高清a一片| 免费看光身美女| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲国产精品999| 国产高清国产精品国产三级| 精品人妻在线不人妻| 精品久久国产蜜桃| 黄色欧美视频在线观看| 七月丁香在线播放| 高清毛片免费看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 18禁观看日本| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 三上悠亚av全集在线观看| 国产一区二区三区av在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 超色免费av| 韩国高清视频一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片 | 制服丝袜香蕉在线| av国产久精品久网站免费入址| 成人免费观看视频高清| 91在线精品国自产拍蜜月| 一个人看视频在线观看www免费| 黄片播放在线免费| 99国产精品免费福利视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 人妻制服诱惑在线中文字幕| av在线播放精品| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲色图综合在线观看| 国产成人freesex在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久久久久久久免费av| 美女福利国产在线| videosex国产| 亚洲国产最新在线播放| 国产有黄有色有爽视频| 最后的刺客免费高清国语| 高清午夜精品一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 两个人的视频大全免费| 人妻少妇偷人精品九色| 久久免费观看电影| 日韩一区二区三区影片| 黄片无遮挡物在线观看| 成人二区视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 99久久人妻综合| av免费在线看不卡| 国产高清三级在线| 久久久国产一区二区| 考比视频在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 国产成人一区二区在线| 黄色毛片三级朝国网站| 人体艺术视频欧美日本| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 在线观看www视频免费| 亚洲天堂av无毛| 99久久人妻综合| 国产精品人妻久久久影院| 久热这里只有精品99| 一级二级三级毛片免费看| 国产成人精品福利久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产成人aa在线观看| 国产 一区精品| av线在线观看网站| 亚洲综合色网址| 蜜桃在线观看..|