苯胺法和間苯三酚法測(cè)定游離棉酚的比較研究

■朱利民 林 鵬 張 劍

（武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

棉酚是一種多酚類黃色化合物，存在于棉花植物及其加工制品中。棉殼、棉粕、棉仁、棉油等都含有該類物質(zhì)。棉酚按其存在的形式可分為游離棉酚和結(jié)合棉酚兩種。結(jié)合棉酚由于其活性基團(tuán)醛基被封閉，在動(dòng)物的消化道內(nèi)不被吸收，無毒。游離棉酚分子結(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán)醛基未被其它物質(zhì)“封閉”，在動(dòng)物體內(nèi)能與Fe2+、各種功能蛋白質(zhì)、酶結(jié)合，導(dǎo)致動(dòng)物生理功能紊亂，引起雄性動(dòng)物不育，甚至死亡。游離棉酚含量大小直接關(guān)系到棉油品質(zhì)及配合飼料的質(zhì)量。

游離棉酚的測(cè)定方法有紫外分光光度法[1-2]、苯胺法[3]、間苯三酚法[4-5]、高效液相色譜法[6]等。由于天然產(chǎn)物成分復(fù)雜，許多化合物在紫外區(qū)對(duì)游離棉酚測(cè)定有干擾，使紫外分光光度法測(cè)定結(jié)果偏高。苯胺法、間苯三酚法基于游離棉酚與苯胺、間苯三酚作用形成一種新化合物在可見光區(qū)有較強(qiáng)吸收，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)游離棉酚定量。可見分光光度法測(cè)得的結(jié)果實(shí)質(zhì)為游離棉酚及其衍生物總量，其選擇性明顯高于紫外分光光度法。高效液相色譜法基于物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)不同將各物質(zhì)分離，然后通過檢測(cè)器定量。該法能反映出樣品中游離棉酚的真實(shí)質(zhì)量，該法測(cè)得的游離棉酚結(jié)果要低于紫外、可見分光光度法。事實(shí)上，游離棉酚的衍生物也具有毒性。因此，可見分光光度法能真實(shí)的反映出游離棉酚的毒性及其含量。

本文比較了間苯三酚法和苯胺法對(duì)棉粕和棉油樣品中的游離棉酚定量結(jié)果，通過標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算兩種分析方法的回收率，并探討了兩種分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑：98%醋酸棉酚（AR,西安玉泉生物科技有限公司）；苯胺（AR，天津天力化學(xué)試劑有限公司），使用前用鋅粉充分振蕩，回流，收集180℃餾分，置于棕色瓶中保存；3-氨基-1-丙醇（CP,上海遠(yuǎn)帆助劑廠）；異丙醇（AR,天津大茂化學(xué)試劑廠）；正己烷（AR,天津科密歐化學(xué)試劑）；二水間苯三酚（AR，英國(guó)進(jìn)口分裝）；丙酮（AR）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：7200分光光度計(jì)(UNIC公司)、恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 間苯三酚法

原理：在6.6 mol/l的HCl介質(zhì)中，芳香醛與間苯三酚作用生成紫紅色化合物，在550 nm處有最大吸收，其顏色深淺與芳香醛含量呈正比，據(jù)此定量。

1 mg/ml游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.028 5 g醋酸棉酚，用70%的丙酮水溶液溶解，定容至25 ml。即為母液。

0.02 mg/ml游離棉酚工作液：準(zhǔn)確移取母液1 ml，用70%丙酮水溶液稀釋，定容至50 ml，即為工作液。

顯色劑：將二水間苯三酚1 g，溶于16.6 ml濃鹽酸，用95%乙醇定容至100 ml，混勻。轉(zhuǎn)入棕色瓶，置于4℃冰箱保存，備用。

游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取游離棉酚工作液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 ml，依次用70%丙酮水溶液定容至1.00 ml，加顯色劑2 ml，搖勻。于55℃恒溫水浴中5 min，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入1 cm比色皿，以未加游離棉酚試樣為空白，于550 nm處測(cè)吸光度（見表1）。以吸光度對(duì)游離棉酚質(zhì)量作圖（見圖1），其線性回歸方程為：y=0.018 8x-0.015 5，R2=0.995 3。樣品測(cè)定，按鄭清梅等[4]的優(yōu)化方法進(jìn)行。

表1 不同濃度棉游離酚標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度

棉粕樣品：準(zhǔn)確稱取經(jīng)機(jī)械粉碎后且過100目篩的棉粕樣品1 g（精確到0.1 mg），置于具塞錐形瓶中，加入50 ml 70%丙酮水溶液，蓋上瓶塞，置于36℃的恒溫振蕩器中振蕩2 h。以中速濾紙過濾。取濾液1 ml，加入2 ml顯色劑，混勻，于55℃恒溫水浴中5 min，然后比色測(cè)定。每組樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值。根據(jù)游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出棉粕樣品中游離棉酚含量。

圖1 游離棉酚質(zhì)量與吸光度的關(guān)系

棉油樣品：準(zhǔn)確移取5 ml棉油，加入45 ml 70%丙酮水溶液，后續(xù)操作同棉粕樣品。

標(biāo)準(zhǔn)加入法：分別取棉油樣品提取液1.00、0.96、0.92 ml,用含400 μg/ml游離棉酚的70%丙酮溶液補(bǔ)齊至1.00 ml,加入2 ml顯色劑，混勻。后續(xù)操作與樣品測(cè)定方法相同。

1.2.2 苯胺法

原理：在3-氨基-1-丙醇存在下，用異丙醇與正己烷混合溶劑（6∶4，v/v）提取游離棉酚，游離棉酚與苯胺作用生成苯胺棉酚，該化合物在440 nm處有最大吸收，其顏色深淺與游離棉酚含量呈正比，據(jù)此定量。

1 mg/ml游離棉酚儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取醋酸棉酚0.028 5 g，用溶劑A（470 ml混合溶劑、1 ml 3-氨基-1-丙醇、4 ml冰醋酸、25 ml超純水）溶解，并定容至25 ml。

100 μg/ml游離棉酚工作液：取5.00 ml游離棉酚儲(chǔ)備液，用溶劑A定容至50.00 ml。

游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取100 μg/ml游離棉酚工作液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 ml各2份，用溶劑A定容至5.00 ml。其中一份加入經(jīng)鋅粉還原并新蒸餾得到的苯胺餾分1 ml，沸水浴30 min后，冷卻至室溫，用混合溶劑（異丙醇∶正己烷=6∶4）定容至12.5 ml，靜置1 h；另一份直接用混合溶劑定容至12.5 ml，充當(dāng)相應(yīng)參比溶液。用1 cm比色皿在440 nm處測(cè)定各自吸光度(表2)。以吸光度對(duì)游離棉酚質(zhì)量作圖（見圖2），其線性回歸方程為：y=80.112x+0.035 9；R2=0.999 4。

樣品測(cè)定，按GB 13086—91方法，略作改動(dòng)，具體操作如下：

表2 不同濃度游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值

棉粕樣品：準(zhǔn)確稱取經(jīng)機(jī)械粉碎后且過100目篩的棉粕樣品1 g（精確到0.1 mg），置于具塞錐形瓶中，加入50 ml溶劑A，蓋上瓶塞，置于振蕩器中振蕩1 h，以提取棉粕中的游離棉酚。以中速濾紙過濾，取濾液5 ml兩份，后續(xù)操作同游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)樣品平行試驗(yàn)3次，取平均值。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出棉粕樣品中游離棉酚含量。

圖2 吸光度與游離棉酚質(zhì)量關(guān)系

棉油樣品：準(zhǔn)確移取10.00 ml棉油，用40 ml溶劑A提取，提取方法以及后續(xù)操作與棉粕樣品相同。

棉粕樣品中游離棉酚的計(jì)算公式如下：

式中：X——棉粕或棉油中游離棉酚含量(mg/kg)；

A——吸光度；

ms——稱取試樣的質(zhì)量(g)；

a——質(zhì)量吸光系數(shù)，本試驗(yàn)為80.112 L/(cm·g)，與GB 13086—1991中的62.5 L/(cm·g)有別；

b——比色皿的厚度(1 cm)；

c——游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線中的截距，本試驗(yàn)為0.035 9；

V1——提取棉粕樣品中游離棉酚所用溶液總體積，本試驗(yàn)為50 ml；

V2——測(cè)定游離棉酚所取濾液的體積，本試驗(yàn)為5 ml；

V3——樣品測(cè)定時(shí)最后定容體積，本試驗(yàn)為12.5 ml；

106——將單位g/g換算為mg/kg。

對(duì)于棉油樣品，其所含游離棉酚的計(jì)算式與棉粕樣品基本相同，只是將稱取試樣質(zhì)量ms換成移取試樣體積V；游離棉酚含量的單位X：mg/kg轉(zhuǎn)換成mg/l；106：將單位g/ml換算為mg/l。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品中游離棉酚的兩種分析方法結(jié)果(見表3)

表3 不同樣品兩種方法的游離棉酚測(cè)定結(jié)果

表3列出了各種樣品的苯胺法和間苯三酚法測(cè)定結(jié)果。對(duì)于同一樣品，間苯三酚法測(cè)得的游離棉酚結(jié)果普遍高于苯胺法。以江西棉粕分析結(jié)果為例，苯胺法為863.0 μg/g，間苯三酚法為1 006.5 μg/g。這可能與提取樣品中游離棉酚所用溶劑及提取時(shí)間有關(guān)。美國(guó)油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOCS）明確規(guī)定“凡能被70%丙酮水溶液提取的棉酚及其衍生物統(tǒng)稱游離棉酚”。可見，70%丙酮提取樣品中游離棉酚較為徹底，而使用異丙醇和正己烷為溶劑提取樣品中游離棉酚的效果要差一些。此外，苯胺法（GB 13086—1991）提取樣品中游離棉酚的時(shí)間偏少，也是游離棉酚溶解不完全，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低的原因之一。

通過表3還能得到如下結(jié)論：棉油中的游離棉酚含量遠(yuǎn)低于棉粕；江西生產(chǎn)的棉粕中游離棉酚含量明顯高于湖北棉粕。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)間苯三酚法測(cè)定結(jié)果的影響(見表4)

表4描述了標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)間苯三酚法測(cè)定結(jié)果的影響。無論是棉粕樣品，還是棉油樣品，采用間苯三酚法測(cè)定樣品中的游離棉酚回收率均在100%～108.8%之間，都能較好地反映樣品中游離棉酚的實(shí)際含量。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)苯胺法測(cè)定結(jié)果的影響（見表5）

由表5可知，苯胺法測(cè)定游離棉酚含量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)加入量的回收率與原樣品中游離棉酚含量有關(guān)。當(dāng)棉粕樣品中游離棉酚含量在800～900 μg/g時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)加入量的回收率為77.12%～82.32%；對(duì)于游離棉酚含量較低（13.75 μg/ml）的棉油樣品，標(biāo)準(zhǔn)加入量的回收率與上述樣品相近；當(dāng)棉粕樣品中游離棉酚含量在400～600 μg/g時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)加入量的回收率為93.39%～104.04%。可見，苯胺法測(cè)定樣品中游離棉酚時(shí)，游離棉酚含量在400～600 μg/g，回收率才與真實(shí)值更接近，分析誤差??；而樣品游離棉酚含量過高或過低，均會(huì)導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果偏低。

表4 標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)間苯三酚法測(cè)定結(jié)果的影響

表5 標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)苯胺法測(cè)定結(jié)果的影響

2.4 兩種測(cè)定方法的比較

試劑的穩(wěn)定性。苯胺易氧化變質(zhì)。采用苯胺法開展試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)先檢驗(yàn)顯色劑苯胺是否變質(zhì)，檢驗(yàn)過程費(fèi)時(shí)。使用剛純化的苯胺開展試驗(yàn)，試劑誤差?。ˋ=0.009），放置時(shí)間過長(zhǎng)，試劑誤差越來越大。當(dāng)吸光度≥0.022，苯胺應(yīng)作純化處理。即先經(jīng)鋅粉還原，再回流蒸餾，收集180℃餾分。每純化一次苯胺，即使置于棕色瓶中4℃冰箱保存，使用時(shí)間也不宜超過3 d。間苯三酚試劑也極易變質(zhì)，一般現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑的消耗與操作。每完成一個(gè)樣品測(cè)定，苯胺法均需在相同條件下準(zhǔn)備一份不加苯胺的對(duì)照樣品，操作繁瑣，且沸水浴完成后均需要用混合溶劑將待測(cè)樣品定容至12.5 ml或25.0 ml，試劑消耗量大；間苯三酚法，樣品測(cè)定時(shí)，只需準(zhǔn)備空白樣品一份，待測(cè)液也只需要1 ml，試劑消耗量小，且操作比苯胺法簡(jiǎn)單。

反應(yīng)條件與時(shí)間。間苯三酚法的反應(yīng)條件溫和，待測(cè)液只需在55℃作用5 min，即可測(cè)樣，勿需漫長(zhǎng)時(shí)間的等待；苯胺法，需在沸水浴加熱30 min，待反應(yīng)液冷卻后，還需定容和長(zhǎng)時(shí)間的靜置。整個(gè)試驗(yàn)操作下來，間苯三酚法比苯胺法耗時(shí)少。

測(cè)定結(jié)果與回收率。對(duì)于相同樣品，間苯三酚法得到的結(jié)果比苯胺法高。這是因?yàn)楸崛悠分械挠坞x棉酚比正己烷和異丙醇更完全。另外，棉粕或棉油樣品中也有一些其他的芳醛化合物與間苯三酚作用，導(dǎo)致間苯三酚法測(cè)定結(jié)果偏高。采用苯胺法測(cè)樣時(shí)，每份樣品均需設(shè)置一個(gè)參比，可以有效地排除不同加入量的試劑對(duì)測(cè)定吸光度的影響。

就回收率而言，苯胺法只有在樣品提取液中游離棉酚含量在一定劑量范圍內(nèi)才能獲得理想的回收率；而間苯三酚法對(duì)所有含游離棉酚樣品的回收率均在試驗(yàn)誤差范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

綜上所述，無論從試劑用量、操作時(shí)間，還是從標(biāo)準(zhǔn)加入量的回收率來看，間苯三酚法均優(yōu)于苯胺法。因此，測(cè)定棉粕或棉油樣品中的游離棉酚，選用間苯三酚法不失為一種簡(jiǎn)便且十分可行的分析方法。