pH值、溫度和鹽度對(duì)墨吉明對(duì)蝦蛋白酶和淀粉酶活力的影響

■郭文浚 楊世平 劉慧玲王成桂 孫成波

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江 524088）

墨吉明對(duì)蝦(Fenneropenaeus merguiensis)隸屬于十足目(Decapoda)、枝鰓亞目(Dendrobranchiata)、對(duì)蝦科(Penaeidae)、明對(duì)蝦屬(Fenneropenaeus)，遍布在亞洲和澳大利亞的熱帶及亞熱帶海域，在我國(guó)主要分布于東南沿海等海域。其食性較雜，生長(zhǎng)周期較短，具有肉質(zhì)鮮美、個(gè)體較大、經(jīng)濟(jì)效益較高和生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，也是中國(guó)傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)對(duì)蝦品種[1]。21世紀(jì)70年代開(kāi)始，一些機(jī)構(gòu)開(kāi)展了墨吉明對(duì)蝦幼體培育、疾病防治等研究。但由于凡納濱對(duì)蝦引進(jìn)后迅速形成了規(guī)?；B(yǎng)殖，影響墨吉明對(duì)蝦的養(yǎng)殖規(guī)模和研究進(jìn)展。近年來(lái)，由于凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中病害的暴發(fā)，影響了對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，墨吉明對(duì)蝦的研究再次被關(guān)注，包括養(yǎng)殖生態(tài)、病害防治、胚胎發(fā)育、幼體發(fā)育、代謝等研究[2-7]。

關(guān)于水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物消化酶的研究較多，如中國(guó)龍蝦(Panulirus stimpsoni)[8]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus van?namei)[9-11]、中國(guó)明對(duì)蝦(P.chinensis)[12]、日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)[12]、虎紋蛙(Hoplobatrachus ru?gulosus)[13]等，說(shuō)明消化酶的研究在基礎(chǔ)研究中的重要性。鑒于有關(guān)墨吉明對(duì)蝦消化酶的資料尚缺，本文研究不同pH值、溫度和鹽度條件下，墨吉明對(duì)蝦肝胰臟和腸道中淀粉酶和蛋白酶的活力變化規(guī)律及最適條件，為墨吉明對(duì)蝦人工養(yǎng)殖和配合飼料的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)，促進(jìn)墨吉明對(duì)蝦的規(guī)模化養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

墨吉明對(duì)蝦[體長(zhǎng)（10.0±0.5）cm]采自廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地，選取健康無(wú)損傷的活潑個(gè)體，置于預(yù)先充氧的桶內(nèi)暫養(yǎng)，并保持24 h不投喂飼料，使其處于長(zhǎng)時(shí)間不進(jìn)食狀態(tài)，令腸道內(nèi)食物殘?jiān)九懦鲋翢o(wú)殘?jiān)鼱顟B(tài)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

隨機(jī)選取50尾對(duì)蝦，將活體置于冰浴的培養(yǎng)皿內(nèi)解剖，取出其肝胰臟，隨后取出腸道并用預(yù)冷蒸餾水（約4℃）將腸道內(nèi)未能排出的殘?jiān)鼪_洗干凈，用吸水紙分別吸干表面多余的水分。然后將50尾蝦的肝胰臟、腸道樣本分別混合在一起，接著，按照其質(zhì)量加入9倍體積（m/V）預(yù)冷蒸餾水，用玻璃勻漿器在冰浴中勻漿。充分勻漿后，將勻漿液置于5 000×g、4℃離心機(jī)中離心15 min，最后取上清液（即酶粗提取液）置于-20℃冰箱中保存待測(cè)酶活力。

1.2.2 酶活力的測(cè)定

采用黃耀桐等[14]方法改良后對(duì)蛋白酶活力進(jìn)行測(cè)定，而淀粉酶活力則采用榮俊等[15]方法進(jìn)行改良測(cè)定。酶活力則統(tǒng)一用酶的比活力來(lái)表示，即酶的比活力=酶活力單位/該粗酶液中蛋白質(zhì)的含量（U/mg prot.）。蛋白酶與淀粉酶測(cè)定均設(shè)置pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5的10個(gè)pH值梯度，溫度為25、30、35、40、45、50、55 ℃和60 ℃的8個(gè)溫度梯度，鹽度為0、10、20、30、40、50、60和70的8個(gè)梯度。總蛋白質(zhì)含量測(cè)定，采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒（南京建成生物科技有限公司）按說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。再用EXCEL 2010和SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析和Ducan's法多重比較，P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pH值對(duì)墨吉明對(duì)蝦消化酶的影響（見(jiàn)表1）

表1 pH值對(duì)墨吉明對(duì)蝦淀粉酶和蛋白酶的影響（U/mg prot.）

如表1所示，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)pH值范圍內(nèi)，墨吉明對(duì)蝦肝胰臟和腸道中的蛋白酶和淀粉酶的比活力均隨著pH值的升高呈現(xiàn)先升高后下降的的趨勢(shì)，在pH值6.0時(shí)，不同組織中兩種酶的比活力達(dá)到最大值。因此，認(rèn)為兩種酶的最適pH值都是6.0，屬于偏弱酸性酶。從消化酶的比活力來(lái)看，在相同條件下，肝胰臟和腸道中蛋白酶的比活力相近，而在肝胰臟中淀粉酶的比活力高于腸道中。

2.2 溫度對(duì)墨吉明對(duì)蝦消化酶的影響（見(jiàn)表2）

表2 溫度對(duì)墨吉明對(duì)蝦淀粉酶和蛋白酶的影響（U/mg prot.）

由表2可知，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)溫度范圍內(nèi)，墨吉明對(duì)蝦肝胰臟和腸道中的蛋白酶和淀粉酶的比活力均隨著溫度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)。兩種組織中蛋白酶的比活力的最大值出現(xiàn)在55℃時(shí)，而兩種組織中淀粉酶的比活力的最大值出現(xiàn)在40～45℃時(shí)。在相同溫度條件下，肝胰臟中淀粉酶的比活力高于腸道中的酶活力，達(dá)腸道中的3.52～4.88倍。兩種消化酶的最適溫度都顯著高于墨吉明對(duì)蝦正常的棲息水溫，符合水生動(dòng)物消化酶特性。

2.3 鹽度對(duì)墨吉明對(duì)蝦消化酶的影響（見(jiàn)表3）

表3 鹽度對(duì)墨吉明對(duì)蝦淀粉酶和蛋白酶的影響（U/mg prot.）

由表3可知，在鹽度為0～70范圍內(nèi)，隨著鹽度的升高兩種組織中的消化酶均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在鹽度40時(shí)，兩種組織中的蛋白酶的比活力均顯著高于其它鹽度條件下的比活力（P＜0.05），而淀粉酶的比活力卻是在鹽度10條件下顯著高于其它鹽度條件下（P＜0.05）。

3 討論

3.1 pH值對(duì)墨吉明對(duì)蝦消化酶的影響

pH值是影響酶活力的一個(gè)因素，主要是通過(guò)改變蛋白酶的構(gòu)象使其失活，或者影響酶分子側(cè)鏈上極性基團(tuán)的解離從而使酶活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生變化影響產(chǎn)物的生成[16]。本研究結(jié)果表明，pH值對(duì)墨吉明對(duì)蝦消化酶活力都有影響，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)pH值范圍內(nèi)均呈現(xiàn)消化酶活力先升高后降低的趨勢(shì)。

大多數(shù)生物學(xué)者認(rèn)為海洋甲殼動(dòng)物消化酶最適pH值范圍大約在5.0～7.9[17]，與本試驗(yàn)測(cè)得結(jié)果相近。本試驗(yàn)測(cè)得墨吉明對(duì)蝦肝胰臟和腸道中蛋白酶的最適pH值都是6.0，屬于偏弱酸性的酶，與黃燕華等[9]在凡納濱對(duì)蝦上的研究結(jié)果相似，與姜永華[8]等研究中國(guó)龍蝦、胡毅等[17]研究三疣梭子蟹(Portunus tritu?berculatus)時(shí)，發(fā)現(xiàn)的最適pH值約為4.0左右有差異，這可能是物種之間的差異所致。李廣麗等[18]測(cè)定的中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)以及姜鶴等[19]測(cè)得大連蝦蛄(Oratosquilla oratoria)的數(shù)據(jù)也進(jìn)一步證實(shí)淀粉酶在偏弱酸性條件下最適合促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)，不同物種的消化酶最適pH值可能不同，這可能與不同物種的生活習(xí)性、生活環(huán)境的不同，以及自身遺傳物質(zhì)不同而形成不同代謝方式，使得自身內(nèi)部酶的性質(zhì)也形成差異，甚至不同生長(zhǎng)發(fā)育階段其消化酶活力也會(huì)發(fā)生變化[17]。

3.2 溫度對(duì)墨吉明對(duì)蝦消化酶的影響

眾所周知，酶活力會(huì)受到溫度影響。對(duì)蝦是變溫動(dòng)物，水溫是決定對(duì)蝦體溫的最主要因素，可以直接影響到對(duì)蝦體內(nèi)消化酶活力。溫度影響酶促反應(yīng)速率主要是通過(guò)在適當(dāng)溫度范圍內(nèi)，溫度會(huì)使活化分子增多從而加快酶促反應(yīng)，其次是因?yàn)榇蟛糠置副举|(zhì)為蛋白質(zhì)，會(huì)隨著溫度升高而逐漸變性甚至完全失活而影響酶促反應(yīng)的效率[16]。

本試驗(yàn)測(cè)得墨吉明對(duì)蝦肝胰臟和腸道中蛋白酶的最適溫度都為55℃，與沈文英等[10]研究的凡納濱對(duì)蝦最適溫度50～60℃，吳根等[12]研究的中國(guó)明對(duì)蝦、日本囊對(duì)蝦的最適溫度為45～55℃的結(jié)果較為相近。淀粉酶最適溫度測(cè)得為40～45℃，高于姜鶴等[19]在研究大連蝦蛄的最適溫度為30℃，也高于沈文英等[10]研究的凡納濱對(duì)蝦最適溫度為30～35℃，這可能是墨吉明對(duì)蝦生活環(huán)境溫度較高，受到環(huán)境長(zhǎng)期影響所致。有實(shí)驗(yàn)表明，墨吉明對(duì)蝦適合生長(zhǎng)溫度為26～27℃[20]，墨吉明對(duì)蝦肝胰臟和腸道的兩種消化酶的最適溫度均比棲息水溫要高，尤其是蛋白酶。在雜色鮑(Hali?otis diversicolor)[21]、駝背鱸(Cromileptes altivelis)[22]和海蜇(Rhopilema esculenta)[23]等常見(jiàn)的水生動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似結(jié)論。消化酶的比活力是在實(shí)驗(yàn)室規(guī)定條件下進(jìn)行測(cè)定，受到反應(yīng)時(shí)間等的限制，而實(shí)際上蝦體內(nèi)消化酶起作用時(shí)間要更長(zhǎng)，同時(shí)，其分泌量會(huì)受到外界溫度影響。因此，和最適pH值一樣，消化酶的最適溫度只有在一定條件下才有生物學(xué)上的意義。

3.3 鹽度對(duì)墨吉明對(duì)蝦消化酶的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶最適鹽度為40，鹽度為40～60時(shí)，蛋白酶活性都有顯著差異(P＜0.05)。淀粉酶最適鹽度為10，鹽度為0～60時(shí)，淀粉酶都有差異。從兩種酶活力變化來(lái)看，說(shuō)明蛋白酶對(duì)于鹽度變化耐受性更好并且活力相對(duì)比較穩(wěn)定，而淀粉酶受到鹽度變化的影響更大，可能與蛋白酶和淀粉酶的結(jié)構(gòu)有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。李希國(guó)等[24]研究黃鰭鯛（Sparus latus）幼魚(yú)消化酶活性時(shí)，也發(fā)現(xiàn)蛋白酶的最適鹽度高于淀粉酶。

4 結(jié)論

蛋白酶和淀粉酶最適pH值為6.0，最適溫度為55℃和40～45℃，最適鹽度為40和10。