黃精種子破眠技術(shù)的優(yōu)化

程秋香，曹 丹，李吟平，劉 峰，席鵬洲，李軍超，張躍進(jìn)

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，西安 710075)

黃精種子破眠技術(shù)的優(yōu)化

程秋香1，曹 丹1，李吟平1，劉 峰2，席鵬洲2，李軍超1，張躍進(jìn)1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，西安 710075)

為了篩選出促進(jìn)黃精種子萌發(fā)的最佳破眠技術(shù)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，研究GA3質(zhì)量濃度、浸種溫度、浸種時(shí)間、消毒劑4個(gè)因素對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明： GA3質(zhì)量濃度為100 mg/L，浸種溫度20 ℃，浸種時(shí)間12 h，消毒劑為w=3%的過(guò)氧化氫是黃精種子萌發(fā)的最佳處理?xiàng)l件，萌發(fā)率可達(dá)92.36%。4種因素中，浸種溫度是影響黃精種子萌發(fā)的主要因素，浸種時(shí)間和GA3質(zhì)量濃度次之，消毒劑的使用可以有效控制黃精種子在萌發(fā)過(guò)程中的霉變現(xiàn)象。

黃精；破眠技術(shù)；正交試驗(yàn)

黃精(PolygonatumsibiricumRed.)為百合科黃精屬多年生草本植物,集藥用、食用和觀賞價(jià)值于一身。其根莖入藥，具有潤(rùn)肺滋陰、補(bǔ)腎益精、降血脂、降血糖、提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)心肌收縮力、抗病原微生物、提高耐缺氧能力等功效[1-2]。黃精繁殖方式為有性繁殖(種子)和無(wú)性繁殖(根莖)2種[3-4]。多年來(lái)，黃精藥材的人工種植主要依靠其根莖，既浪費(fèi)商品藥材也導(dǎo)致其后代退化，病蟲(chóng)害加重，使黃精藥材的品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。利用黃精種子進(jìn)行繁殖既可以節(jié)約大量商品藥材，發(fā)揮其雜種優(yōu)勢(shì)，還能防止其品種退化。然而黃精種子休眠期長(zhǎng)，自然條件下發(fā)芽率極低，對(duì)有性繁殖造成很大的障礙。本試驗(yàn)在以往單因素研究的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，系統(tǒng)分析GA3質(zhì)量濃度、浸種溫度、浸種時(shí)間和消毒劑4個(gè)因素對(duì)黃精種子萌發(fā)的綜合影響，旨在篩選出促進(jìn)黃精種子萌發(fā)的最佳破眠技術(shù)，為黃精種子的有性繁殖提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

黃精種子來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院藥用植物資源圃。2013年10月采集成熟黃精果實(shí)，經(jīng)發(fā)酵漂洗獲得黃精種子，室外沙藏。

1.2 方 法

1.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黃精種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)等為考核指標(biāo)，以GA3質(zhì)量濃度(A)、浸種溫度(B)、浸種時(shí)間(C)、消毒劑(D)4個(gè)因素設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)L9(34)，詳見(jiàn)表1和表2。表中，消毒劑的3個(gè)水平分別指：w=3%的過(guò)氧化氫處理15 min；φ=75%的乙醇處理30 min；w=0.8%次氯酸鈉處理30 min。

1.2.2 發(fā)芽試驗(yàn) 黃精種子經(jīng)2個(gè)月沙藏后取出，用清水沖洗干凈，挑選表面光滑、完整、大小適中的種子，備用。根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行種子處理，每組處理選取種子50粒，每組處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中1號(hào)為例，取挑選備用的黃精種子50粒放置在培養(yǎng)皿中，加入質(zhì)量濃度為100 mg/L的GA3溶液10 mL，20 ℃條件下浸種12 h；然后用蒸餾水清洗3次；加入w=3%的過(guò)氧化氫10 mL浸泡15 min，蒸餾水清洗3次。

將處理后的黃精種子播種在鋪有雙層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，置于MGC-300A型智能光照培養(yǎng)箱中25 ℃避光培養(yǎng)，發(fā)芽期限設(shè)定60 d，每天觀察記錄種子萌發(fā)情況，以突破種皮的下胚軸長(zhǎng)度超過(guò)種子自身長(zhǎng)度視為發(fā)芽[5]，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)、帶菌率。試驗(yàn)期間，適時(shí)澆水保持濾紙濕潤(rùn)，發(fā)現(xiàn)霉?fàn)€種子及時(shí)清理并更換污染濾紙。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

種子萌發(fā)率=60 d內(nèi)萌發(fā)的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

萌發(fā)指數(shù)(Gi)=∑Gt/Dt(Gt為td的萌發(fā)數(shù)，Dt為相應(yīng)的萌發(fā)時(shí)間)

處理后種子帶菌率=60 d發(fā)霉的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA3質(zhì)量濃度、浸種溫度、浸種時(shí)間及不同消毒劑對(duì)黃精種子萌發(fā)率的影響

極差分析法是一種直觀反映試驗(yàn)中各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大小的方法[6]。由表2可知，不同處理?xiàng)l件下黃精種子萌發(fā)率之間存在一定差異，其中1號(hào)處理黃精種子的萌發(fā)率最高，為92.36%；6號(hào)處理最差，為60.6%；其余處理介于二者之間。從處理的4個(gè)因素來(lái)看，浸種溫度的極差值(R)最大，GA3質(zhì)量濃度次之，浸種時(shí)間和消毒劑較小。說(shuō)明浸種溫度對(duì)黃精種子萌發(fā)率影響最大，GA3質(zhì)量濃度次之。

方差分析[7]結(jié)果見(jiàn)表3，與極差分析結(jié)果相吻合，其中浸種溫度對(duì)黃精種子萌發(fā)率的影響達(dá)到極顯著(P=0.001)，GA3質(zhì)量濃度對(duì)黃精種子的萌發(fā)率影響達(dá)到顯著水平(P=0.027)，而其余2個(gè)因素的作用效果不顯著(P>0.05)。4因素A、B、C、D不同水平對(duì)黃精種子萌發(fā)率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可以看出：A1、B1、C3、D1的效應(yīng)分別最大，即GA3質(zhì)量濃度為100 mg/L、浸種溫度20 ℃、浸種時(shí)間24 h為最佳水平，消毒劑以過(guò)氧化氫為佳。由于因素D的3個(gè)水平為非連續(xù)變量，所以在圖1、2、3中均以散點(diǎn)形式呈現(xiàn)。

表2 不同處理下黃精種子的萌發(fā)率

表3 各因素對(duì)黃精種子萌發(fā)率影響的方差分析

圖1 4種因素對(duì)萌發(fā)率的效應(yīng)曲線

2.2 GA3質(zhì)量濃度、浸種溫度、浸種時(shí)間及不同消毒劑對(duì)黃精種子萌發(fā)指數(shù)的影響

由表4可知，1號(hào)處理黃精種子的萌發(fā)指數(shù)最高，為1.54。GA3質(zhì)量濃度、浸種溫度、浸種時(shí)間、消毒劑這4個(gè)因素中，浸種溫度的極差值(R)最大，浸種時(shí)間次之，GA3質(zhì)量濃度和消毒劑極差值較小，說(shuō)明浸種溫度對(duì)黃精種子萌發(fā)指數(shù)影響最大，浸種時(shí)間次之。

表5表明，浸種溫度和浸種時(shí)間對(duì)黃精種子萌發(fā)指數(shù)的影響達(dá)到極顯著水平。其中，浸種溫度P=0.002，浸種時(shí)間P=0.001。其余2個(gè)因素作用效果不顯著(P>0.05)。結(jié)合各因素對(duì)萌發(fā)率影響的方差分析結(jié)果，浸種溫度對(duì)黃精種子的萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)均有極顯著作用；浸種時(shí)間對(duì)黃精種子的萌發(fā)率影響作用不顯著，但對(duì)萌發(fā)指數(shù)有極顯著作用；GA3質(zhì)量濃度對(duì)黃精種子萌發(fā)率有顯著影響，對(duì)萌發(fā)指數(shù)影響不顯著，消毒劑對(duì)黃精種子萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)的影響均不顯著。因此，實(shí)際生產(chǎn)中首要應(yīng)考慮浸種溫度，其次考慮浸種時(shí)間與GA3質(zhì)量濃度。由圖2可知，因素A、B、C、D對(duì)萌發(fā)指數(shù)的影響中，A3、B1，C1，D1的效應(yīng)分別最大，即GA3質(zhì)量濃度200 mg/L、浸種溫度20 ℃、浸種時(shí)間12 h為最佳水平，消毒劑以過(guò)氧化氫為佳。

表4 不同處理下黃精種子的萌發(fā)指數(shù)

表5 各因素對(duì)黃精種子萌發(fā)指數(shù)影響的方差分析

圖2 4種因素對(duì)萌發(fā)指數(shù)的效應(yīng)曲線

2.3 不同消毒處理的消毒效果

種子消毒處理的效果主要根據(jù)消毒后種子的帶菌率來(lái)體現(xiàn)。帶菌率高表明該消毒方法效果不佳，無(wú)法達(dá)到消毒的預(yù)期目的。黃精種子由于自身結(jié)構(gòu)等原因，造成其萌發(fā)歷時(shí)較長(zhǎng)，容易引起種子霉?fàn)€。因此，消毒處理及消毒劑的選擇是黃精種子萌發(fā)中非常重要的一環(huán)。各種消毒劑的消毒效果如表6及圖3所示，不同消毒方法間消毒效果存在一定差異，其中D1即過(guò)氧化氫的消毒效果最好，其相應(yīng)的K值最小，其他2種消毒劑效果次之，故在黃精種子繁殖中選用過(guò)氧化氫作為前期處理的消毒劑。

3 結(jié)論與討論

4種因素對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響程度存在較大差異，其中，浸種溫度對(duì)黃精種子萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)的影響極顯著，且最佳效應(yīng)水平為20 ℃；浸種時(shí)間對(duì)黃精種子萌發(fā)率影響不顯著，對(duì)萌發(fā)指數(shù)影響極顯著，且兩者最佳效應(yīng)水平不一致，應(yīng)選擇影響萌發(fā)指數(shù)最佳效應(yīng)水平，即浸種時(shí)間12 h；GA3質(zhì)量濃度對(duì)黃精種子萌發(fā)率影響達(dá)到顯著水平，對(duì)黃精種子萌發(fā)指數(shù)影響不顯著，所以應(yīng)選擇影響萌發(fā)率最佳效應(yīng)水平，即100 mg/L；不同消毒劑對(duì)黃精種子帶菌率的影響中,w=3%過(guò)氧化氫處理15 min效果最好，帶菌率最低。綜上分析，本試驗(yàn)所得到的最佳組合為A1B1C1D1，即黃精種子萌發(fā)的最佳破眠技術(shù)組合為GA3質(zhì)量濃度100 mg/L，處理溫度20 ℃，處理時(shí)間12 h，最后用w=3%的過(guò)氧化氫處理15 min。

表6 不同消毒劑下黃精種子的帶菌率

圖3 不同消毒劑處理對(duì)帶菌率的效應(yīng)

沙藏層積處理是一種古老而有效的破除種子休眠的方法，對(duì)因含萌發(fā)抑制物質(zhì)而導(dǎo)致生理休眠的種子效果顯著。沙藏處理可以促進(jìn)胚形態(tài)發(fā)育成熟，激素含量發(fā)生變化，抑制物質(zhì)降解，大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，提高一些酶的活力，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)，種皮透性增強(qiáng)，以及使胚對(duì)脫落酸的敏感降低等[8-9]。黃精種子屬于綜合休眠，一方面存在胚的后熟現(xiàn)象[10]；另一方面，黃精種皮、胚乳和胚等不同部位存在一定的內(nèi)源抑制物質(zhì)[11]，在實(shí)際生產(chǎn)中，新收獲的黃精種子常先沙藏起來(lái)，待用時(shí)再篩出，對(duì)黃精種子而言，沙藏不僅是一種破眠方法，更是一種合理的貯藏方法，因而在黃精種子破眠方面，沙藏常作為一種必不可少的前處理方法。常用的沙藏層積有變溫層積和恒溫層積，變溫層積通常模擬休眠種子的自然環(huán)境條件，有利于種子的胚完成生理后熟過(guò)程。王占紅等[12]對(duì)黃精種子的4種不同沙藏方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)黃精果實(shí)經(jīng)發(fā)酵漂洗獲得種子室外沙藏效果最佳，因此本試驗(yàn)選用室外沙藏處理作為黃精種子的前處理方法。

浸種催芽是常用的催芽方法之一，通過(guò)浸種處理可以去除種子內(nèi)部分抑制物，能有效提高種子發(fā)芽率，適當(dāng)溫度的浸種處理具有更佳的效果[13]。本研究中所得到的最適浸種溫度為20 ℃，最適浸種時(shí)間為12 h,與朱伍鳳等[14]的研究存在一定差異，朱伍鳳等所進(jìn)行的為單因素試驗(yàn)，而本試驗(yàn)為4因素3水平正交試驗(yàn)，這可能是引起差異的主要原因。另外，浸種效果的好壞取決于水溫和浸種時(shí)間兩個(gè)方面，一般情況下浸種時(shí)水溫越低，需要浸種時(shí)間越長(zhǎng)，反之水溫越高，浸種時(shí)間可適當(dāng)縮短。

GA3具有拮抗休眠種子內(nèi)源抑制物質(zhì)(包括ABA)的作用，能夠促進(jìn)α-淀粉酶、核酸酶、蛋白水解酶、ATP酶等的表達(dá)。GA3在促進(jìn)種子萌發(fā)的過(guò)程中至少起到兩種信號(hào)作用，一是軟化種胚周?chē)M織，克服種皮機(jī)械限制，二是促進(jìn)種胚的生長(zhǎng)[15]。同時(shí)，GA3對(duì)種子內(nèi)ABA有一個(gè)平衡作用。黃精種子堅(jiān)硬，吸水緩慢，在前期的單因素研究中發(fā)現(xiàn)除具有一定的機(jī)械障礙外，還存在一定的內(nèi)源抑制物(包括ABA含量較高)[10]， GA3浸種的應(yīng)用，可以緩解或消除上述不利因素，有利于促進(jìn)黃精種子萌發(fā)。本文研究表明在多因素綜合作用下，100 mg/L的 GA3溶液浸種，對(duì)黃精種子萌發(fā)有較好的促進(jìn)作用。

種子消毒技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較廣，如草種處理、種子包衣等。本試驗(yàn)采用常用過(guò)氧化氫、乙醇、次氯酸鈉3種消毒劑對(duì)黃精種子進(jìn)行消毒，其中以過(guò)氧化氫效果最佳，該結(jié)果與李榮峰等[16]對(duì)麻瘋樹(shù)種子消毒處理的結(jié)果一致。

正交試驗(yàn)相對(duì)于單因素試驗(yàn)來(lái)說(shuō)能更系統(tǒng)反應(yīng)不同因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響情況，能得出一個(gè)更加直觀可靠的結(jié)果。本試驗(yàn)研究是在前期單因素研究的基礎(chǔ)上開(kāi)展的研究工作，獲得的最佳破眠技術(shù)組合不僅萌發(fā)率高，而且萌發(fā)指數(shù)有較大的突破，在黃精的有性繁殖過(guò)程中，既可以節(jié)約時(shí)間，又可以增加苗子的整齊度，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

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(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Optimization Technology for Breaking Dormancy ofPolygonatumsibiricumRed. Seed

CHENG Qiuxiang1,CAO Dan1,LI Yingping1,LIU Feng2, XI Pengzhou2,LI Junchao1and ZHANG Yuejin1

(1.College of Life Science，Northwest A&F University，Yangling Shanxi 712100 China; 2.Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co.,Ltd.,Xi’an 710075,China)

In order to select the optimum technology for breaking dormancy. which could promote the seed germination ofPolygonatumsibiricum,studied we studied the effect of mass concentration of GA3,soaking temperature,soaking time and disinfectants four factors on seed germination ofPolygonatumsibiricumby the method of orthogonal experiment.The results showed that the best treatment conditions on seed germination ofPolygonatumsibiricumwas 100 mg/L GA3, 20 ℃ soaking for 12 hours,disinfectant with hydrogen peroxide(w=3%),and the germination rate could reach up to 92.36%. Among them ,the soaking temperature was the major influence factor ofPolygonatumsibiricumRed.seeds germination, soaking time and the mass concentration of GA3were the second to it, the use of disinfectant could control the contamination ofPolygonatumsibiricumeffectively during the seed germination process.

PolygonatumsibiricumRed;Dormancy-broken technology;Orthogonal experiment

ZHANG Yuejin,male,professor. Research area:mainly engaged in standardization production of medicinal plant.E-mail:qxzhang@126.com

2016-02-29

2016-04-07

陜西省科技攻關(guān)(S2014SF3834)；陜西省科技攻關(guān)(2015SF2-32)；楊凌示范區(qū)農(nóng)業(yè)科技示范推廣基地項(xiàng)目(A289021601)。

程秋香，女，碩士研究生，從事藥用植物規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)研究。E-mail:chengqiuxiang000@sina.com

張躍進(jìn)，男，教授，從事藥用植物規(guī)范化生產(chǎn)研究。E-mail:qxzhang@126.com

日期：2016-12-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1117.036.html

Q945

A

1004-1389(2016)12-1870-06

Received 2016-02-29 Returned 2016-04-07

Foundation item Shaanxi Province Program for Tackling Agricultural Technology(No.S2014SF3834);Shaanxi Province Program for Tackling Agricultural Technology(No.2015SF2-32);Yangling Demonstration Area Program for Agricultural Technology and Base Extensive(No.A289021601).First author CHENG Qiuxiang,female,master student.Research area:mainly engaged in standardization production technology in medicinal plant . E-mail:chengqiuxiang000@sina.com