羊口瘡病毒陜西分離株B2L基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)

何亞鵬，張 琪，龐文靜，徐麗美，付明哲，許信剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

羊口瘡病毒陜西分離株B2L基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)

何亞鵬，張 琪，龐文靜，徐麗美，付明哲*，許信剛*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為了對羊口瘡病毒(ORFV)陜西分離株B2L基因進(jìn)行克隆、序列分析及原核表達(dá)，根據(jù)GenBank已登錄的ORFV(JN565694.1)B2L基因序列，設(shè)計(jì)合成一對特異性引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增ORFV B2L基因，并將目的基因連接到原核表達(dá)載體pET-28a中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-B2L，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。結(jié)果表明，成功克隆了ORFV陜西分離株B2L全基因序列，核苷酸序列分析表明，陜西分離株B2L基因與國內(nèi)外已報(bào)道的ORFV毒株核苷酸同源性超過97.3%，氨基酸同源性超過95.0%。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)分子質(zhì)量約為42 ku 的重組蛋白，該蛋白能與羊口瘡陽性血清特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性。研究結(jié)果為ORFV的分子生物學(xué)特性研究提供資料，為進(jìn)一步研制ORFV單克隆抗體及抗體檢測ELISA試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

羊口瘡病毒；B2L基因；克隆；序列分析；原核表達(dá)

羊口瘡(Orf)又稱羊接觸傳染性膿皰皮炎(Contagious pustular dermatitis)，是由羊口瘡病毒(Orf virus,ORFV)引起的一種急性接觸性人獸共患傳染病，我國將其列為三類動物疫病[1-2]。羊口瘡病毒屬于痘病毒科副痘病毒屬，病毒粒子大小約為280 nm×170 nm，一般呈橢圓形，也有球形、錐形等，且病毒粒子表面有囊膜包裹。ORFV基因組全長約140 kb，基因組中間是一個長的中心編碼區(qū)，編碼約130個蛋白，兩頭是相同的反向末端重復(fù)序列。羊口瘡病毒的編碼區(qū)又分為中心保守區(qū)和末端變異區(qū)。中心保守區(qū)是病毒完成復(fù)制和形成病毒粒子所必需的。兩側(cè)非必須的末端變異區(qū)種間變異性較大，主要為病毒的毒力基因，因此與病毒的致病性密切相關(guān)[3-4]。B2L基因是位于病毒的保守區(qū)，基因全長1 137 bp，是一個完整的閱讀框，編碼蛋白質(zhì)大小約為42 ku。B2L蛋白是ORFV的病毒粒子囊膜的重要組成部分，是其主要的免疫優(yōu)勢抗原，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，清除病原[5-6]，大量研究表明B2L蛋白是羊口瘡病毒優(yōu)勢抗原之一[7]。本研究擴(kuò)增出羊口瘡病毒陜西分離株B2L基因，進(jìn)行序列分析及原核表達(dá)，為進(jìn)一步研制羊口瘡ELISA抗體檢測試劑盒以及基因工程疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞株 羊口瘡病毒陜西分離株(Shannxi,GenBank accession:KU194469)由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；pEASY-T1 Cloning Kit、感受態(tài)細(xì)胞Trans5a、BL21菌株為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pET-28a質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.2 主要試劑 2×EsTaqMaster Mix、DNA Marker DL 2 000、Super DNA Marker、廣譜蛋白Marker為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；各種內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；IPTG為Sigma公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 血清 ORFV陽性血清為采自臨床免疫過ORFV弱毒疫苗株(山東泰豐生物有限公司產(chǎn)品)的羊血清。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)及病毒核酸的提取 根據(jù)GenBank 中收錄的ORFV(JN565694.1)B2L基因序列，利用Primer 5.0引物分析軟件，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增ORFV的B2L基因(B2L-F/B2L-R)引物，上游引物B2L-F 5′- CGCGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCC-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物B2L-R 5′-CCGCTCGAGTTAATTTATTGGTTTGCAGAACTCC -3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增長度為1 137 bp，引物由Invitrogen上海貿(mào)易有限公司合成。取ORFV細(xì)胞培養(yǎng)物200 μL，根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取病毒基因組DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 B2L基因的克隆及序列分析 以提取的ORFV基因組DNA為模板，50 μL PCR反應(yīng)體系：2×ESTaqMastermix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，滅菌雙蒸水21 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。核酸凝膠電泳，膠回收目的條帶，連接pEASY-T1克隆載體。將含有目的基因B2L的pEASY-T1質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，同時用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET-28a空質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物。將B2L基因亞克隆到pET-28a載體中，挑取單克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)，分別進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，提取陽性質(zhì)粒送華大基因(北京)測序，將鑒定正確的重組原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-B2L。

利用NCBI BLAST功能將B2L測序結(jié)果與GenBank已收錄的羊口瘡病毒基因組DNA序列進(jìn)行比對。利用Internet在線軟件預(yù)測B2L所編碼蛋白的信號肽 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和跨膜區(qū)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)。利用DNA Star軟件預(yù)測分析其蛋白的親水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性。

1.2.3 重組蛋白B2L的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化 將pET-B2L和pET-28a空載體分別轉(zhuǎn)化表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21，挑取單克隆，37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)，按1%轉(zhuǎn)接5 mL新鮮LB培養(yǎng)基后，培養(yǎng)至對數(shù)期，加入IPTG 至終濃度1.0 mmol/L 誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)后3、4、5、6、7 h收集菌體， 然后進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.2.4 重組蛋白B2L表達(dá)形式的分析 在最佳誘導(dǎo)條件下，分別取菌液上清、菌體超聲裂解上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，分析重組蛋白的表達(dá)形式。

1.2.5 目的蛋白的Western blot分析 將重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE后，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h。以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h，分別以1∶500倍稀釋的羊口瘡陽性血清4 ℃孵育PVDF膜過夜。TBST振蕩洗滌3次，每次20 min。將PVDF膜以1∶5 000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體室溫孵育2.5 h，TBST振蕩洗滌3次，每次20 min。ECL反應(yīng)液孵育PVDF膜，暗室壓片曝光。同時設(shè)立陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的病毒基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到1 137 bp的B2L基因，與預(yù)期大小相符(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.B2L擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR products of B2L gene

圖1 B2L基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR results of B2L gene

2.2 重組質(zhì)粒pET-B2L雙酶切鑒定結(jié)果

將重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，均獲得與預(yù)期大小一致的片段(圖2)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 10 000；1.pET-28a雙酶切產(chǎn)物；2.pET-B2L雙酶切產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 10 000；1.Double enzyme digestion products of pET-28a plasmid；2.Double enzyme digestion products of recombanant plasmid pET-B2L

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

Fig.2 Identification of recombinant plasmids by enzyme digestion

2.3 B2L目的基因同源性及進(jìn)化樹分析

序列測定結(jié)果表明，B2L基因大小為1 137 bp，編碼378個氨基酸殘基。將測定序列上傳至GenBank，登錄號為KU194469。利用DNA Star 分析軟件對該毒株核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中登錄的8個ORFV毒株B2L序列進(jìn)行同源性比較分析。結(jié)果表明，ORFV Shaanxi株與其他13株ORFV的B2L核苷酸同源性為97.3%～98.4%，氨基酸序列同源性為95.0%～98.2%(圖3)。在分析同源性的基礎(chǔ)上進(jìn)行核苷酸遺傳進(jìn)化分析，并繪制其系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(圖4)。從進(jìn)化樹上可以看出，ORFV Shaanxi株與Hub株(GU320351.1)、Shanxi株(JN565696.1)、Liaoning株(HQ694773.1)位于一個小分支，親緣關(guān)系最近。

圖3 ORFV不同毒株的推導(dǎo)B2L氨基酸同源性比較

圖4 ORFV B2L核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 B2L基因編碼氨基酸親水性及抗原表位分析

利用Internet在線軟件預(yù)測B2L的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有信號肽和跨膜區(qū)。利用DNA Star軟件分析B2L的親水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性。結(jié)果表明，ORFV B2L編碼的囊膜蛋白在58-67、87-97、103-114、149-168、190-198、206-234、278-285、314-321、337-346、351-359、362-376位的氨基酸殘基處有較高的親水性(圖5)。由抗原表位分析圖可知，B2L基因編碼的囊膜蛋白在第9-15、42-46、56-80、85-98、106-116、160-167、205-235、264-273、278-287、288-298、309-333、337-343、351-378位可能存在抗原表位(圖5)。

圖5 B2L蛋白的親水性、抗原指數(shù)及抗原表位分析

2.5 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

當(dāng)IPTG終濃度為1.0 mmol/L時，誘導(dǎo)后3、4、5、6、7 h收集菌體。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)5 h后，重組蛋白B2L表達(dá)量顯著增加，在7 h時表達(dá)量最大，而pET-28a空質(zhì)粒對照組和pET-B2L未誘導(dǎo)對照組均沒有重組蛋白的表達(dá)(圖6)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)pET-28a；2.未誘導(dǎo)pET-B2L；3～7.分別誘導(dǎo)3、4、5、6、7 h的pET- B2L

M. Protein molecular weight Marker；1.Induced cells containing pET-28a；2.Uninduced cells containing pET- B2L； 3-7.Cells containing pET-B2L induced for 3,4,5 ,6，7 h，respectively

圖6 不同誘導(dǎo)時間對B2L重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響

Fig.6 Effects of different induction time on expression of B2L fusion proteins

2.6 重組蛋白B2L表達(dá)形式的分析

在最佳誘導(dǎo)條件下，分別取菌液上清、菌體超聲裂解上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，在上清中未見預(yù)期蛋白條帶，在沉淀中可見預(yù)期的蛋白條帶，表明重組蛋白B2L主要以包涵體的形式存在。

2.7 重組蛋白的Western blot分析

Western blot結(jié)果表明，B2L重組蛋白能與羊口瘡陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶，而與陰性對照轉(zhuǎn)染空載體pET-28a的重組菌不反應(yīng)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2.B2L重組蛋白；3.pET-28a對照菌

M. Protein molecular weight Marker；1-2.B2L recombinant proteins；3.pET-28a control

圖7 B2L重組蛋白的Western blot分析

Fig.7 Western blot analysis of B2L recombinant protein

3 討論

3.1 B2L序列分析

羊口瘡病毒能引起反芻動物和人發(fā)病，流行范圍廣，在我國西部地區(qū)廣泛流行，春季、夏季多發(fā)，可引起羔羊死亡[3,8]。其感染率高，傳播速度快，但容易被忽視而對羔羊造成嚴(yán)重危害。ORFV的B2L基因編碼主要的免疫囊膜蛋白，該基因較保守，不同分離株同源性在97%以上，常被用于建立病毒PCR鑒定方法[9-10]。B2L蛋白是ORFV囊膜的重要組成部分，是主要的免疫優(yōu)勢抗原，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，清除病原[11-13]。本研究成功地克隆了ORFV Shaanxi株B2L的全長基因(登錄號：KU194469)，并將其與NCBI上登錄的其他ORFV毒株的B2L基因進(jìn)行了核苷酸序列比較分析。結(jié)果表明，分離毒株與其他ORFV毒株的核苷酸同源性均超過97.3%，氨基酸同源性均超過95.0%，其中Shaanxi株與國內(nèi)Hub株(GU320351.1)、Shanxi株(JN565696.1)、Liaoning株(HQ694773.1)同源性最高。從進(jìn)化樹也可以看出，Shaanxi(KU194469)株在進(jìn)化樹上與與國內(nèi)Hub株(GU320351.1)、Shanxi株(JN565696.1)、Liaoning株(HQ694773.1)同位于一個小分支。

3.2 親水性、抗原表位分析

利用DNA Star的Protean軟件和在線生物軟件預(yù)測B2L蛋白序列，B2L編碼蛋白質(zhì)大小為42 ku，B2L蛋白沒有信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域。親水性分析表明，ORFV B2L編碼的囊膜蛋白在58-67、87-97、103-114、149-168、190-198、206-234、278-285、314-321、337-346、351-359、362-376位的氨基酸殘基處有較高的親水性；由抗原表位分析圖可知，B2L基因編碼的囊膜蛋白在第9-15、42-46、56-80、85-98、106-116、160-167、205-235、264-273、278-287、288-298、309-333、337-343、351-378位可能存在抗原表位，這說明B2L蛋白具有較強(qiáng)的抗原性和親水性且抗原性峰值和親水性峰值基本同步。正是因?yàn)锽2L蛋白具有良好的抗原性，使其成為臨床上診斷ORFV感染的理想抗原，對羊口瘡診斷方法的建立和血清學(xué)調(diào)查有重要價(jià)值[14-15]。ORFV-Shaanxi株B2L基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)，不僅豐富了陜西地區(qū)ORFV的流行病學(xué)資料，也為國內(nèi)外關(guān)于ORFV的遺傳起源、傳播路徑和流行規(guī)律的研究提供了新思路，為新型疫苗和增強(qiáng)免疫效果的研究奠定了基礎(chǔ)。

3.3 B2L蛋白原核表達(dá)分析

大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)具有過程簡單、表達(dá)量大等優(yōu)點(diǎn)。雖然其表達(dá)產(chǎn)物多為不溶性包涵體蛋白，且產(chǎn)物無法進(jìn)行正確的糖基化修飾，但產(chǎn)物可以用來進(jìn)行免疫性質(zhì)的研究。本試驗(yàn)將B2L基因克隆于pET-28a原核表達(dá)載體，通過條件的優(yōu)化，在宿主菌BL21中成功誘導(dǎo)表達(dá)了ORFV B2L蛋白。表達(dá)的B2L蛋白分子質(zhì)量約為42 ku，主要以包涵體的形式存在，與預(yù)期結(jié)果相符。本試驗(yàn)在大腸埃希菌中表達(dá)了B2L蛋白，為ORF診斷抗原的研究、基因工程疫苗的研制以及抗B2L單克隆抗體的研制提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Cloning,Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of B2L Gene of Orf Virus Shaanxi Strain

HE Ya-peng,ZHANG Qi,PANG Wen-jing,XU Li-mei,FU Ming-zhe,XU Xin-gang

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

According to the published sequence of B2L gene of ORFV(JN565694.1)，a pair of specific primers were designed and synthesized for cloning,sequence analysis and prokaryotic expression of B2L gene of Orf virus Shannxi strain. The B2L gene was amplified by PCR from Orf virus of Shaanxi strain.B2L gene sequence was analyzed and cloned into pET-28a vector.The prokaryotic expression plasmid pET-B2L containing B2L gene was successfully constructed.The expression of recombinant plasmid pET-B2L inE.coliBL21competent cells was induced and detected by SDS-PAGE and Western blot.B2L gene sequence was successfully obtained.Nucleotide sequence analysis showed that B2L gene of Shaanxi strain is similar to some domestic and foreign strains.Nucleotide sequence similarity is more than 97.3%,amino acid sequence similarity is more than 95.0%.SDS-PAGE analysis showed that 42 ku recombinanti protein was expressed by IPTG induction.Western blot analysis showed that the recombinant fusion protein had good reactiongenicity.The result provided the reference for studying molecular biology characteristics of ORFV.Furthermore,the B2L protein can be used to prepare monoclonal antibody and ELISA detection kit.

Orf virus；B2L gene； clone；sequence analysis；prokaryotic expression

2016-05-03

陜西省重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新鏈項(xiàng)目(2016KTZDNY02-06)；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-092)；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站(基地)科技成果推廣項(xiàng)目(TGZX2015-32)

何亞鵬(1990-)，男，河南內(nèi)鄉(xiāng)人，碩士，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.1

A

1007-5038(2016)12-0019-05