聯(lián)合使用脫甲基化藥物和紫杉醇對腎癌細(xì)胞的侵襲能力影響機(jī)制研究

楊凱鈞 朱斌 潘衛(wèi)兵 謝禮仁

聯(lián)合使用脫甲基化藥物和紫杉醇對腎癌細(xì)胞的侵襲能力影響機(jī)制研究

楊凱鈞 朱斌 潘衛(wèi)兵 謝禮仁

目的 觀察聯(lián)合使用脫氧雜胞苷(DAC)與紫杉醇(PTX)對腎患細(xì)胞是否存在協(xié)同作用，并探究其機(jī)制。方法離體培養(yǎng)腎透明細(xì)胞癌ACHN細(xì)胞株，將120培養(yǎng)皿隨機(jī)分為空白對照組、DAC組、PTX組、聯(lián)合組，每組30個。DAC組：用DAC：0.5、1、2、4、8 μmol/L處理 3 d；PTX組：用 PTX：1、2、4、8、16 nmol/L處理 3 d；聯(lián)合組：用DAC+ PTX處理 3 d。使用高速分選流式細(xì)胞儀觀察T肽協(xié)同樹突狀細(xì)胞對腎癌細(xì)胞的凋亡率；通過ELISA檢測淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(LEF1)和E-cadherin在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)；通過ELISA技術(shù)檢測凋亡蛋白caspass-3在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果DAC組、PTX組以及聯(lián)合組對腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯，其中聯(lián)合組對腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)(P<0.05)，而且DAC和PTX對腫瘤細(xì)胞的抑制作用與藥物濃度成正比(P<0.05)。與DAC組、PTX組比較，聯(lián)合組中LEF1的表達(dá)水平最低(P<0.05)，E-cadherin、caspass-3的表達(dá)水平最高(P<0.05)，而且DAC和PTX對LEF1表達(dá)的抑制作用、對E-cadherin、caspass-3的表達(dá)的促進(jìn)作用與藥物濃度成正比(P<0.05)。結(jié)論DAC與 PTX聯(lián)合干預(yù)腎癌細(xì)胞，具有協(xié)同作用，而且 LEF1是新的腎癌治療靶點(diǎn)，DAC與 PTX合用可以提高腎癌細(xì)胞的凋亡率，并且降低腎癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

脫甲基化藥物；紫杉醇；腎癌；侵襲能力；分子機(jī)制

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤[1-3]，其發(fā)病率僅略低于膀胱腫瘤?；蚣谆墓τ檬欠€(wěn)定基因結(jié)構(gòu)的堿基序列，使其能夠編碼正常的基因。如果基因組的基因甲基化和去甲基化的平衡發(fā)生異常變化，造成染色質(zhì)復(fù)制不穩(wěn)定，可引起細(xì)胞突變，造成生長失控，從而誘發(fā)腫瘤。脫氧雜氮胞苷亦稱地西他濱(5-aza-2 deoxycytidine，DAC)是經(jīng)典的去甲基化藥物，其可有效抑制胞嘧啶甲基化的過程，隨著細(xì)胞分裂逐漸減低DNA甲基化的程度[4-6]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)屬于抗微管藥，其能下調(diào)細(xì)胞漿內(nèi)的IkB-α水平，使得可以誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制微管解聚，使得NF-κB被激活，其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)參與調(diào)節(jié)多種參與凋亡蛋白，如半胱天冬酶(caspase)家族，使癌細(xì)胞凋亡[7-9]。若聯(lián)合使用DAC 和PTX ，除了兩者皆具有的細(xì)胞毒效應(yīng)影響癌細(xì)胞的凋亡外，很可能通過干擾癌細(xì)胞的細(xì)胞黏附分子從而對腫瘤細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生間接影響。本研究即觀察聯(lián)合使用DAC 與PTX對腎患細(xì)胞是否存在協(xié)同作用，并探究其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 地西他濱(DAC；美國 Sigma公司)； Paclitaxel (PTX；美國 Sigma公司)；人腎癌細(xì)胞株(美國 ATCC公司)FACSArill型高速分選流式細(xì)胞儀(美國 BD公司)；Freedom EVO 75 全自動酶聯(lián)免疫吸附分析儀(瑞士 Tecan公司)。

1.2 研究方案

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇：腎透明細(xì)胞癌ACHN細(xì)胞株均置于-80℃保存。復(fù)蘇時置37℃水浴解凍，加RPMI-1640 培養(yǎng)液，1 500 r/min，5 min離心，去上清，加Rpmi-1640 培養(yǎng)基液，置5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)基選用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、RPMI-1640、100 mg/ml鏈霉素，5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育，ACHN腎癌細(xì)胞株為單層粘壁生長類型，將細(xì)胞培養(yǎng)濃度1×107/ml。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組：通過隨機(jī)數(shù)字發(fā)生器將120培養(yǎng)皿隨機(jī)分為4組(n=30)：空白對照組；DAC組，脫甲基化藥物 DAC干預(yù)；PTX組，化療藥物PTX干預(yù)；聯(lián)合組，DAC聯(lián)合PTX干預(yù)。

1.2.4 試驗(yàn)干預(yù)措施：PTX溶于DMSO之中，濃度10 mg/ml，使用無血清 RPMI-1640 配制樣品(1 mg/ml)濃度為 1 000、100、10、1、0.1 μg/ml，500 nmol/L PBS 稀釋，0.22 μm濾膜過濾，置-80℃。DAC 500 μmol/L PBS 稀釋，0.22 μm濾膜過濾，置-80℃。①DAC干預(yù)方案：用DAC 0.5、1、2、4、8 μmol/L處理3 d。 ②PTX干預(yù)方案：用 PTX 1、 2、4、8、16 nmol/L處理 3 d。③DAC聯(lián)合PTX治療方案：用DAC+ PTX處理 3 d。

1.3 觀察指標(biāo) (1)使用高速分選流式細(xì)胞儀觀察T肽協(xié)同樹突狀細(xì)胞對腎癌細(xì)胞的凋亡率；(2)通過酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(lymphoid enhance facter 1，LEF1)和E-cadherin在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)；(3)通過ELISA技術(shù)檢測凋亡蛋白caspass-3在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 腎癌細(xì)胞凋亡率比較 DAC組、PTX組以及聯(lián)合組對腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯，其中聯(lián)合組對腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，而且DAC和PTX對腫瘤細(xì)胞的抑制作用與藥物濃度呈正比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

組別0.5μmol/L1μmol/L2μmol/L4μmol/L8μmol/LP值空白對照組23.89±2.7524.10±2.0124.27±2.2125.09±3.9525.55±3.69>0.05DAC組25.78±4.4935.57±3.0946.87±3.2758.15±4.5561.82±.88<0.05PTX組25.78±4.4935.57±3.0946.87±3.2758.15±4.5575.90±2.88<0.05聯(lián)合組26.02±1.5442.28±2.0258.68±2.2579.30±3.5092.08±2.50<0.05 P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05-

2.2 LEF1在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)比較 聯(lián)合組中LEF1的表達(dá)水平最低，而且DAC和PTX對LEF1表達(dá)的抑制作用與藥物濃度呈正比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別0.5μmol/L1μmol/L2μmol/L4μmol/L8μmol/LP值空白對照組14.39±0.2914.77±0.3214.52±2.2114.09±0.3514.21±0.49>0.05DAC組9.18±0.536.43±0.475.06±0.284.58±0.243.42±0.36<0.05PTX組7.75±0.295.89±0.494.35±0.213.67±0.383.11±0.19<0.05聯(lián)合組6.52±0.355.41±0.234.05±0.163.15±0.252.79±0.34<0.05 P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05-

2.3 E-cadherin在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)比較 聯(lián)合組中E-cadherin的表達(dá)水平最高，而且DAC和PTX對E-cadherin表達(dá)的促進(jìn)作用與藥物濃度呈正比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4 caspass-3在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)的比較：比較DAC組、PTX組以及聯(lián)合組中caspass-3在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)，其中聯(lián)合組中caspass-3的表達(dá)水平最高，而且DAC和PTX對LEF1表達(dá)的促進(jìn)作用與藥物濃度呈正比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

腫瘤發(fā)生的特征是生長失控，癌細(xì)胞基因組中的一種腫瘤發(fā)生誘因是基因組超甲基化，即抑癌基因(tumor suppressor gene)的超甲基化(hyper methylation)，使該基因失活，不能轉(zhuǎn)錄復(fù)制，誘發(fā)腫瘤發(fā)生[10-12]。目前在腎癌中，已發(fā)現(xiàn)多個基因存在超甲基化的變化，例如腫瘤抑制蛋白 RDA32、凋亡相關(guān)蛋白激酶 1、蛋白分化酶 3的抑制因子等。近年，DNA甲基化的作用受到關(guān)注，因?yàn)榧谆酵瑫r影響腫瘤細(xì)胞的凋亡和轉(zhuǎn)移能力，而腫瘤細(xì)胞的絕對數(shù)目以及是否容易從瘤體脫落是決定腫瘤細(xì)胞侵襲能力的關(guān)鍵，尤其是甲基化(methylation)在腫瘤的發(fā)展的影響成為腫瘤研究的熱點(diǎn)[13-15]。

組別0.5μmol/L1μmol/L2μmol/L4μmol/L8μmol/LP值空白對照組1.76±0.311.79±0.291.75±0.321.74±0.261.82±0.39>0.05DAC組1.82±0.221.95±0.352.22±0.282.45±0.333.45±0.36<0.05PTX組1.77±0.321.88±0.332.14±0.202.34±0.163.33±0.24<0.05聯(lián)合組1.76±0.172.24±0.183.15±0.223.94±0.254.21±0.34<0.05 P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05-

組別0.5μmol/L1μmol/L2μmol/L4μmol/L8μmol/LP值空白對照組14.39±0.2914.77±0.3214.52±2.2114.09±0.3514.21±0.49>0.05DAC組9.18±0.536.43±0.475.06±0.284.58±0.243.42±0.36<0.05PTX組7.75±0.295.89±0.494.35±0.213.67±0.383.11±0.19<0.05聯(lián)合組6.52±0.355.41±0.234.05±0.163.15±0.252.79±0.34<0.05 P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05-

淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(lymphoid enhance facter 1，LEF1)在胚胎組織細(xì)胞中多為高表達(dá)，其在出生后迅速下降[16-18]。LEF1通過和β-catenin結(jié)合激活靶基因調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，繼而干預(yù)腫瘤的發(fā)展過程。LEF-1在腎腫瘤中的表達(dá)多增高，其通過β-catenin信號通路抑制 E-cadherin在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，繼而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。E-cadherin屬于鈣依賴性細(xì)胞間黏附分子，其可以維持組織細(xì)胞的完整性。β-catenin的一端與鈣依賴性黏附分子(calcium-dependent cell adhesion molecule，E-cadherin)末端進(jìn)行耦聯(lián)，繼而形成 E-cadherin/β-catenin復(fù)合物，β-catenin的另一端通過與胞內(nèi)肌動蛋白連接，穩(wěn)定細(xì)胞間的連接。E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)可以會誘發(fā)該復(fù)合體功能障礙，使細(xì)胞間形成穩(wěn)定連接失去功能，最終誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。

脫甲基化藥物 DAC可以和 DNA結(jié)合，繼而抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，使甲基化胞嘧啶去甲基，使DNA低甲基化。目前，DAC 已用于臨床造血系統(tǒng)腫瘤、轉(zhuǎn)移性肺癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌的臨床治療。

單獨(dú)使用DAC 或者PTX治療腎患細(xì)胞的臨床效果并不佳，其總緩解率僅達(dá)到 5%，其原因與腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力沒有得到有效遏制有關(guān)[19]。本研究證實(shí)， DAC和 PTX單獨(dú)使用可以抑制腎癌細(xì)胞的生長，即誘發(fā)caspass-3在腎癌細(xì)胞中的高表達(dá)，使得腎癌細(xì)胞的凋亡率上調(diào)。其具有劑量依賴性。尤為重要的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用 DAC與 PTX，其對腫瘤細(xì)胞的生長抑制顯著高于單獨(dú)使用的效果，也即聯(lián)合治療能夠比較低的濃度達(dá)到較好的療效。

本研究發(fā)現(xiàn)，LEF1的表達(dá)水平在DAC和PTX干預(yù)腎癌癥細(xì)胞之后明顯下調(diào)，而且聯(lián)合作用后 LEF1表達(dá)水平的下降幅度更大，即兩種藥物呈現(xiàn)協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，DAC和PTX聯(lián)合處理腎癌細(xì)胞之后 LEF1的表達(dá)顯著低于單一藥物的作用。本研究結(jié)果表明，LEF1是在DAC和PTX聯(lián)合作用的靶點(diǎn)，即LEF1所在的Wnt信號通路密切參與腎癌的發(fā)展過程，并且其是調(diào)控腎癌細(xì)胞生長的重要通路。

綜上所述，本研究證實(shí)了 DAC與 PTX聯(lián)合干預(yù)腎癌細(xì)胞，具有協(xié)同作用，而且 LEF1是新的腎癌治療靶點(diǎn)，DAC與 PTX合用可以提高腎癌細(xì)胞的凋亡率，并且降低腎癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

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Effects of demethylation drugs combined with paclitaxel on invasion ability of renal carcinoma cells and their action mechanism

YANGKaijun,ZHUBin,PANWeibing,etal.

DepartmentofUrinarySurgery,People’sHospitalofPingshanDistrict,Guangdong,Shenzhen518118,China

Objective To observe whether combination application of deoxidation cytidine (DAC) with paclitaxel (PTX) has a synergistic effect on renal carcinoma cells, and to explore their action mechanism. Methods The renal clear cell carcinoma-ACHN cell line was cultured in vitro. The 120 culture dishes were randomly divided into 4 groups:blank control group,DAC group,PTX group,combination group (DAC+PTX),with 30 dishes in each group. The cells in DAC group were treated by DAC 0.5, 1, 2, 4, 8 μmol/L, respectively for 3 days;the celles in PTX group were treated by PTX 1, 2, 4, 8, 16 nmol/L, respectively for 3 days; the cells in combination group were treated by DAC+PTX for 3 days. The apoptosis rates of renal carcinoma cells induced by T peptide combined with dendritic cells were detected by flow cytometry,and the expression levels of lymphocyte enhancement factor (LEF1),E-cadherin and Caspass-3 in renal carcinoma cells were detected by ELISA. Results The inhibitory effects on tumor cells in DAC group,PTX group and combination group were obvious,in which the inhibitory effects in combination group were the most obvious (P<0.05). Moreover the inhibitory effects on tumor cells in DAC group and PTX group were in direct proportion to the drug concentrations (P<0.05). As compared with those in DAC group and in PTX group,the expression levels of LEF1 in combination group were the lowest (P<0.05), however, the expression levels of E-cadherin and Caspass-3 were the highest. Moreover the inhibitory effects of DAC and PTX on the expressions of LEF1 as well as the promotive effects on the expressions of E-cadherin,Caspass-3 were in opposite proportion to the drug concentrations (P<0.05).Conclusion The combination intervention of DAC and PTX on renal carcinoma cells has a synergistic effect.Moreover LEF1 is an new therapeutic target for renal carcinoma.The combination application of DAC with PTX can increase the apoptosis rate of renal carcinoma cells, and can decrease the abilities of invasion and metastasis of renal carcinoma cells.

demethylation drugs; paclitaxel; renal carcinoma; invasive ability; molecular mechanism

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.24.009

518118 廣東省深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科

R 737.11

A

1002-7386(2016)24-3717-04

2016-06-08)