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    左卡尼汀對大鼠橫紋肌溶解急性腎損傷炎性反應(yīng)因子表達(dá)的影響

    2016-12-30 03:15:50張媛媛張建榮耿燕秋張艷霞
    武警醫(yī)學(xué) 2016年12期
    關(guān)鍵詞:左卡尼汀左卡尼橫紋肌

    張媛媛,張建榮,耿燕秋,張艷霞

    左卡尼汀對大鼠橫紋肌溶解急性腎損傷炎性反應(yīng)因子表達(dá)的影響

    張媛媛,張建榮,耿燕秋,張艷霞

    目的 探討左卡尼汀對大鼠橫紋肌溶解急性腎損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法 48只大鼠,隨機(jī)分為空白組、模型組、鹽水治療組及左卡尼汀治療組。肌內(nèi)注射50%甘油建立橫紋肌溶解急性腎損傷模型,鹽水治療組、左卡尼汀治療組分別腹腔注射生理鹽水和左卡尼汀。測血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)和肌酐(serum creatinine,Scr)水平,光鏡下觀察腎臟病理;RT-PCR和免疫組化分別檢測腎臟TLR4、NF-kB;酶聯(lián)免疫吸附法檢測腎臟IL-6、TNF-α。結(jié)果 與空白組相比,模型組及鹽水治療組CK、BUN、Scr、TLR4、NF-kB、IL-6、TNF-α及急性腎小管壞死(acute tubular necrosis,ATN)評分均明顯升高(F=9.12~211.77,q=5.40~20.3,P<0.05);與模型組相比,左卡尼汀治療組CK、BUN、Scr、TLR4、NF-kB、IL-6、TNF-α及ATN評分水平明顯降低(q=4.37~16.03,P<0.05)。結(jié)論 左卡尼汀緩解橫紋肌溶解急性腎損傷的機(jī)制可能與其抗免疫炎性反應(yīng)通路TLR4/NF-kB有關(guān)。

    左卡尼汀;橫紋肌溶解;急性腎損傷;免疫炎性反應(yīng)

    橫紋肌溶解(rhabdomyolysis,RM)是由于外傷或非外傷所致的橫紋肌被破壞,繼而引起內(nèi)環(huán)境紊亂的一組臨床綜合征,??梢鸺毙阅I損傷(acute kidney injury,AKI),重者可危及生命[1-5]。因此,尋找一種能有效緩解RM致AKI預(yù)后的藥物具有重要的臨床意義。左卡尼汀(L-carnitine)是機(jī)體的一種特殊氨基酸,其基本生理功能是轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞線粒體,進(jìn)行β氧化為機(jī)體提供能量,左卡尼汀可以減輕缺血、炎性反應(yīng)遞質(zhì)等對腎組織細(xì)胞的損傷[6],并且可以抑制炎性反應(yīng)作用,促進(jìn)急性腎損傷的恢復(fù)。本研究主要探討左卡尼汀對RM致AKI的保護(hù)作用及其作用機(jī)制,旨在探討左卡尼汀緩解橫紋肌溶解急性腎損傷的機(jī)制可能與其抗免疫炎性反應(yīng)通路TLR4/NF-kB有關(guān)。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物分組及處理 將48只成年雄性大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、鹽水治療組及左卡尼汀治療組,每組12只??瞻捉M:不予特殊處理;模型組:雙側(cè)后肢肌內(nèi)注射50%甘油(10 ml/kg),余無特殊;鹽水治療組:雙側(cè)后肢肌內(nèi)注射50%甘油(10 ml/kg)同時(shí)及24 h后分別腹腔注射生理鹽水(10 ml/kg);左卡尼汀治療組:雙側(cè)后肢肌注50%甘油(10 ml/kg)同時(shí)及24 h后分別腹腔注射左卡尼汀(200 mg/kg)。每組在第48、72、96 h處死各4只大鼠,心內(nèi)采血并留取腎臟組織,1/4腎組織置于甲醛液固定行腎臟病理檢查,其余組織置于-80 ℃冰箱保存行RT-PCR、免疫組化、ELISA測TLR4、NF-kB、IL-6和TNF-α。

    1.2 方法

    1.2.1 血清指標(biāo)檢測 采用美國BeckmancoulterAU5400自動(dòng)生化儀檢測CK、Cr和BUN。

    1.2.2 光鏡下觀察腎臟結(jié)構(gòu) 嚴(yán)格按照石蠟切片一般步驟制作石蠟切片,將切片進(jìn)行HE染色,采用奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司BX51型)讀片并采集圖像。就光鏡下HE染色標(biāo)本,對腎小管損傷進(jìn)行評分,ATN評分標(biāo)準(zhǔn):每張切片×200倍鏡下取10個(gè)視野,0=正常,1=輕微損傷(受損腎小管<5%),2=輕度損傷(受損腎小管5%~25%),3=中度損傷(受損腎小管25%~75%),4=重度損傷(受損腎小管>75%),半定量計(jì)算平均值,作為腎小管損傷的評分指數(shù)。

    1.2.3 免疫組化法測腎臟組織TLR4、NF-κB 嚴(yán)格按照SABC法免疫組化染色,采用奧林巴斯光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像,DAB顯色顯示陽性顆粒呈棕黃色。用積分綜合計(jì)量法計(jì)算結(jié)果評價(jià)免疫組化結(jié)果。即每張切片×200倍鏡下取10個(gè)視野,對染色強(qiáng)度進(jìn)行評分:不著色記為0分,淺黃色記為1分,黃色記為2分,棕黃色記為3分。每種陽性強(qiáng)度對應(yīng)的值×該強(qiáng)度細(xì)胞的百分比,求和(1×弱陽性百分比+2×中等陽性百分比+3×強(qiáng)陽性百分比),0為陰性,0~1.0為弱陽性,1.0~1.5為中等陽性,大于1.5為強(qiáng)陽性。

    1.2.4 RT-PCR法測大鼠腎臟組織TLR4、NF-κB 嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書步驟提取總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,再進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),將PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳(北京六一儀器廠,DYY-6D型),采用凝膠圖像分析系統(tǒng)(君意,JY04S-3C型)進(jìn)行半定量分析。TLR4上游引物序列 TGGCATCATCTT-CATTGTCC,下游引物序列CAGAGCATTGTCCTCCCACT,退火溫度57.8 ℃,產(chǎn)物長度115 bp;NF-κB上游引物序列CCCCCTGAGAAAGAAACACT,下游引物序列TATCCTGAAACCCCACATCC,退火溫度57.8 ℃,產(chǎn)物長度121 bp;內(nèi)參選用β-actin,上游引物序列CCACACCCGCCACCAGTTCG,下游引物序列CTAGGGCGGCCCACGATGGA,退火溫度66 ℃,產(chǎn)物長度140 bp。

    1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測腎臟組織TNF-α、IL-6 嚴(yán)格按照試劑盒步驟操作,利用紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器公司,T6新世紀(jì)190-1100NM型)及酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司,1550型)等儀器測出標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,再依據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出其相對應(yīng)的TNF-α、IL-6樣品濃度。

    2 結(jié) 果

    2.1 血清指標(biāo) (1) 橫紋肌溶解指標(biāo):與空白組比較,模型組及鹽水治療組CK均明顯升高(P<0.05),給予左卡尼汀后,CK則明顯下降(P<0.05,表1)。(2)腎功能指標(biāo):與空白組比較,模型組及鹽水治療組BUN、Cr均明顯升高(P<0.05),給予左卡尼汀后,BUN、Cr則明顯下降(P<0.05,表1)。

    2.2 腎臟組織

    2.2.1 光鏡觀察 光鏡下觀察腎臟組織HE染色石蠟切片發(fā)現(xiàn),空白組:腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞形態(tài)正常;模型組及鹽水治療組:腎小球變大腫脹,腎小管上皮細(xì)胞變性壞死,管腔內(nèi)有大量管型及細(xì)胞碎片,間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤;左卡尼汀治療組:腎小球結(jié)構(gòu)基本完整,腎小管結(jié)構(gòu)尚完整,細(xì)胞輕度變性、腫脹,管腔內(nèi)偶見滲出物(圖1)。

    圖1 光鏡下觀察大鼠腎臟(HE,×200)

    表1 4組大鼠血清CK、BUN、Cr比較 (n=4;

    注:與空白組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05

    2.2.2 急性腎小管損傷(ATN)評分 與空白組比較,模型組及鹽水治療組ATN評分均明顯升高(P<0.05),給予左卡尼汀治療后,ATN評分明顯下降(P<0.05,表2)。

    表2 4組大鼠ATN評分統(tǒng)計(jì) (n=4;

    注:與空白組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05

    圖2 4組大鼠腎組織TLR4 mRNA含量比較

    圖3 四組大鼠腎組織NF-κB mRNA含量比較

    2.2.3RT-PCR法測腎臟組織TLR4、NF-κB與空白組相比,模型組和鹽水治療組TLR4、NF-κB的mRNA含量明顯升高(P<0.05);給予左卡尼汀治后,TLR4、NF-κB的mRNA含量明顯降低(P<0.05,圖2、3)。

    2.2.4 免疫組化法測腎臟組織TLR4、NF-κB與空白組相比,模型組和鹽水治療組的TLR4、NF-κB水平明顯升高(P<0.05);給予左卡尼汀治后,TLR4、NF-κB的含量明顯降低(P<0.05,表3,圖4、5)。

    2.2.5ELISA法測腎臟組織TNF-α、IL-6 與空白組相比,模型組及鹽水治療組IL-6、TNF-α均明顯升高(P<0.05),給予左卡尼汀治療后,IL-6、TNF-α水平則明顯下降(P<0.05,表3)。

    圖4 TLR4在大鼠腎臟的表達(dá)(免疫組化,×200)

    圖5 NF-kB在大鼠腎臟的表達(dá)(免疫組化,×200)

    組別時(shí)間48h72h96hTLR4 空白組0.41±0.040.46±0.040.39±0.03 模型組2.41±0.24①2.56±0.25①2.39±0.21① 鹽水組2.42±0.21①2.58±0.24①2.43±0.23① 左卡組1.49±0.10①②1.60±0.13①②1.51±0.12①②NF?κB 空白組0.54±0.040.56±0.040.50±0.03 模型組2.39±0.22①2.59±0.14①2.36±0.23① 鹽水組2.40±0.23①2.57±0.25①2.39±0.24① 左卡組1.50±0.12①②1.59±0.11①②1.48±0.12①②IL?6(pg/mg) 空白組25.01±4.34 24.37±3.4424.12±4.16 模型組367.13±16.27①450.17±18.25①373.23±15.54① 鹽水組378.21±14.29①449.36±20.34①370.31±16.26① 左卡組145.99±11.11①②182.33±13.13①②146.12±12.99①②TNF?α(pg/mg) 空白組26.01±2.34 27.37±3.0427.12±3.16 模型組1080.13±22.27① 1297.17±31.25①1088.23±24.54① 鹽水組1081.21±24.29① 1297.36±28.34①1085.31±23.26① 左卡組483.99±1.11①②590.33±2.13①②486.32±2.12①②

    注:與空白組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05

    3 討 論

    創(chuàng)傷或非創(chuàng)傷等因素造成的橫紋肌溶解,引起缺血后肌肉組織中的白三烯、血小板活化因子及補(bǔ)體因子炎性遞質(zhì)增高,激活中性粒細(xì)胞,引起肌肉損傷[2]。創(chuàng)傷可使機(jī)體生成大量炎性因子;并進(jìn)入血循環(huán)后引起瀑布樣連鎖反應(yīng),導(dǎo)致全身炎性反應(yīng),如毛細(xì)血管滲出、內(nèi)皮細(xì)胞損害、微血管血栓,最終導(dǎo)致微循環(huán)障礙,加重腎臟等重要臟器的損害。

    Toll樣受體(Tolllikereceptors,TLRs)是和微生物識(shí)別相關(guān)的一個(gè)天然免疫受體家族,是介導(dǎo)炎性反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)者[3]。Toll樣受體4(TLR4)是發(fā)現(xiàn)最早及研究最多的TLRs相關(guān)蛋白,其廣泛分布于人體各組織臟器。TLR4是一種模式識(shí)別受體,可通過識(shí)別并結(jié)合病原相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatters,PAMPs)及損害相關(guān)分子(damaged-associatedmolecularpatterns,DAMPs),從而啟動(dòng)激活下游傳導(dǎo)途徑,繼而誘導(dǎo)免疫效應(yīng)分子的表達(dá),包括誘導(dǎo)炎性遞質(zhì)的表達(dá)。TLR4/NF-κB通路已被證實(shí)與多種炎性反應(yīng)疾病相關(guān)[7]。文獻(xiàn)[7]研究顯示,在TLR4被激活后,PAMPs及DAMPs刺激信號(hào)可以經(jīng)過不同的途徑傳導(dǎo)激活下游信號(hào)NF-κB,NF-κB是由p50亞基及p65亞基(兩個(gè)關(guān)鍵活性亞基)構(gòu)成的異源二聚體,是調(diào)控免疫炎性反應(yīng)過程的核心轉(zhuǎn)錄因子[8]。正常生理狀態(tài)下,NF-κB及其抑制蛋白在胞漿中結(jié)合以抑制自身的核轉(zhuǎn)位,從而使自身處于失活狀態(tài),當(dāng)發(fā)生細(xì)胞應(yīng)激時(shí),NF-κB可結(jié)合至炎性反應(yīng)相關(guān)基因序列來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄,繼而引起包括IL-6、TNF-α等炎性遞質(zhì)水平的增加[3,4]。

    Lee等[9]發(fā)現(xiàn),TLR4及NF-κB在小鼠缺血再灌注致AKI中表達(dá)明顯升高,證實(shí)了TLR4/NF-κB通路參與缺血再灌注致AKI的發(fā)生發(fā)展。免疫炎性反應(yīng)是缺血再灌注發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制,同時(shí)免疫炎性反應(yīng)也是AKI的病理機(jī)制之一[10],提示TLR4參與了RM致AKI的發(fā)生發(fā)展。ZHENGXiaoyong等[11]證實(shí),TLR4參與缺血再灌注致AKI的發(fā)生發(fā)展。IL-6是一種急性期的炎性遞質(zhì),其在血清及組織中的含量與RM所致AKI嚴(yán)重程度相關(guān)[12]。文獻(xiàn)[13]研究亦發(fā)現(xiàn),在肌注甘油引起AKI的模型中,腎臟組織中的炎性反應(yīng)遞質(zhì)表達(dá)均明顯增加,阻斷或者抑制這些炎性遞質(zhì)的表達(dá)對RM致AKI具有保護(hù)作用。

    左卡尼汀是脂肪代謝必不可少的輔助因子,其主要作用是轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸到線粒體基質(zhì)中進(jìn)行β氧化以ATP的形式供應(yīng)能量。有研究發(fā)現(xiàn),左卡尼汀能夠通過減輕腎臟缺血再灌注損傷進(jìn)而保護(hù)腎功能[14]。Aydogdu等[15]證明,左卡尼汀可以從功能、形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)方面對RM致AKI具有保護(hù)作用。本研究通過腹腔注射左卡尼汀觀察大鼠RM致AKI腎臟組織的TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α變化水平,結(jié)果顯示,肌注甘油后,模型組大鼠腎臟組織中的TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α水平明顯上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),證實(shí)了免疫炎性反應(yīng)通路TLR4 /NF-κB參與了RM所致AKI的發(fā)生及發(fā)展;給予左卡尼汀治療后,TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α水平則明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),進(jìn)一步證實(shí)了左卡尼汀可能是通過抑制免疫炎性反應(yīng)通路TLR4/NF-κB從而實(shí)現(xiàn)對橫紋肌溶解急性腎損傷的保護(hù)作用。

    綜上所述,本研究證實(shí)免疫炎性反應(yīng)通路TLR4/NF-κB參與了RM致AKI發(fā)生發(fā)展,左卡尼汀對RM致AKI具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與其抑制免疫炎性反應(yīng)通路TLR4/NF-κB繼而減少下游炎性反應(yīng)遞質(zhì)IL-6、TNF-α水平有關(guān)。

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    (2016-07-01收稿 2016-09-20修回)

    (責(zé)任編輯 郭 青)

    Protective effect of L-carnitine on rhabdomyolysis induced acute kidney injury via inflammation

    ZHANG Yuanyuan,ZHANG Jianrong,GENG Yanqiu,and ZHANG Yanxia.Department of Nephrology, General Hospital of Chinese Poeple’s Armed Police Force,Beijing 100039,China

    Objective To observe the renal function and the effect of L-carnitine on rhabdomyolysis-induced acute kidney injury(AKI) in rats.Methods Forty-eight adult rats were randomly divided into control group,model group, normal saline treatment group,and L-carnitine treatment group.50% glycerol was intramuscularly injected into double hind limbs of rats to prepare the rhabdomyolysis-induced AKI model.Normal saline treatment group and L-carnitine treatment group were intraperitoneally injected with saline and L-carnitine.An automatic biochemical analyzer was used to test levels of serum creatine kinase(CK),urea nitrogen(BUN) and creatinine(Scr) whileRT-PCR method and immunohistochemical method were employed respectively to detect the expression of TLR4、NF-kB in the kidney. Biotin method of enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect the expression of IL-6 and TNF-α in the kidney.Results In model group, levels of CK、BUN、Scr、TLR4、NF-kB、IL-6 and TNF-α were significantly elevated compared with control group(F=9.12-211.77,q=5.40-20.3,P<0.05).Compared with model group, levels of CK,BUN,Scr,TLR4,NF-kB,IL-6 and TNF-α were reduced significantly in L-carnitine group(q=4.37-16.03,P<0.05).Conclusions L-carnitine can ameliorate rhabdomyolysis-induced acute kidney injury, which may be related to its anti-inflammatory effect.

    L-carnitine;rhabdomyolysis;acute kidney injury;immune inflammation

    重大災(zāi)害醫(yī)學(xué)救援衛(wèi)星綜合應(yīng)用服務(wù)示范項(xiàng)目,資助編號(hào):發(fā)改辦高技(2013)2140號(hào)

    張媛媛,在讀碩士。

    100039 北京,武警總醫(yī)院腎內(nèi)科

    張建榮,E-mail:zhangjr0317@126.com

    R59

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