黃淮北片主栽小麥品種冬春性與主要春化基因組成的關(guān)系

趙彥坤,張文勝，王秀堂，傅曉藝，賈 丹，高振賢，史占良，何明琦

(1.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北石家莊 050041； 2.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心，河北石家莊 050021)

黃淮北片主栽小麥品種冬春性與主要春化基因組成的關(guān)系

趙彥坤1,張文勝2，王秀堂1，傅曉藝1，賈 丹1，高振賢1，史占良1，何明琦1

(1.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北石家莊 050041； 2.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心，河北石家莊 050021)

為探明我國(guó)黃淮北片麥區(qū)冬小麥的冬春性與春化基因分布的關(guān)系，以該麥區(qū)的48個(gè)主導(dǎo)小麥品種為材料，依據(jù)不同小麥品種的低溫春化需求來(lái)分析品種的冬春特性，同時(shí)分析了主要的春化基因分子標(biāo)記在上述品種中的組成。結(jié)果表明，黃淮北片麥區(qū)以半冬性品種為主，占75.0%，春性品種和冬性品種各占10.4%，弱春性品種占4.2%。春化基因檢測(cè)結(jié)果顯示，黃淮北片麥區(qū)的主栽小麥品種的主要基因型為 vrn-A1/ vrn-B1/ vrn-D1/ vrn-B3，占77.1%，其余品種含有 Vrn-D1基因(22.9%,11個(gè))，未發(fā)現(xiàn)攜帶顯性基因 Vrn-A1、 Vrn-B1及 Vrn-B3的品種。黃淮北片主栽品種調(diào)查結(jié)果顯示，根據(jù) vrn-A1/ vrn-B1/ vrn-B3/ vrn-D1全隱性基因型推測(cè)的品種的冬性和表現(xiàn)型的一致性高達(dá)97.3%，根據(jù)顯性基因 Vrn-D1推測(cè)的春性與表現(xiàn)型的一致性為54.5%?？偟膩?lái)說(shuō)通過(guò)春化基因組成推測(cè)的冬春性與根據(jù)低溫需求鑒定的冬春性的一致性為87.5%，表明可以通過(guò)檢測(cè)春化基因分子標(biāo)記來(lái)對(duì)品種的冬春性進(jìn)行快速推測(cè)，實(shí)際工作中若能利用春化基因分子檢測(cè)與田間觀察相結(jié)合，可以更準(zhǔn)確地反映品種的冬春性。

小麥；黃淮北片；冬春性；春化基因

春化特性是小麥適應(yīng)不同氣候條件決定性的因素，其既影響小麥的種植范圍，也決定了小麥的適宜播期[1]。我國(guó)為小麥生產(chǎn)大國(guó)，氣候類(lèi)型多樣，依據(jù)小麥的冬春類(lèi)型及生長(zhǎng)區(qū)域等特性，小麥生產(chǎn)區(qū)域分為北部春麥區(qū)、北部冬麥區(qū)、黃淮冬麥區(qū)等10個(gè)生態(tài)區(qū)[1]。從20世紀(jì)初前蘇聯(lián)學(xué)者李森科(Lysenko)提出植物春化理論以來(lái)，有關(guān)春化作用一直是植物學(xué)家們研究的熱點(diǎn)，由于小麥春化反應(yīng)的復(fù)雜性和反應(yīng)類(lèi)型的多樣性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從不同角度和層次對(duì)其進(jìn)行了研究[2-5]。目前報(bào)道的主要春化基因有 Vrn1、 Vrn2、 Vrn3和 Vrn-D4，其中， Vrn1編碼一個(gè)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，與擬南芥中頂端分生組織基因 APETALA1同源[6]，該基因調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化，直接控制開(kāi)花和成熟時(shí)間； Vrn2是通過(guò) Vrn3來(lái)控制 Vrn1的表達(dá)，其突變后不需要春化[7]； Vrn3是擬南芥中FT的同源基因，其顯性可以加速開(kāi)花，作為控制春化需求的支路[7]； Vrn-D4通過(guò)和 Vrn-A1、 Vrn-B1、 Vrn-D1、 Vrn-B3互作來(lái)調(diào)控春化過(guò)程[8]。其中， Vrn1是目前認(rèn)為對(duì)春化起最主要作用的基因，該基因在小麥中的3個(gè)等位基因分別位于5AL、5BL和5DL染色體，即Vrn-A1、Vrn-B1和 Vrn-D1，這3個(gè)等位基因中任何一個(gè)或多個(gè)為顯性時(shí)，小麥的春化特性為春性，若這3個(gè)基因全為隱性，小麥的春化特性為冬性，且這3個(gè)顯性等位基因的春化效應(yīng)不同，其中 Vrn-A1作用最強(qiáng)，對(duì) Vrn-B1和 Vrn-D1具有上位效應(yīng)[9]。 Vrn1對(duì) Vrn2具有上位效應(yīng)，當(dāng) Vrn1的三個(gè)等位基因任何一個(gè)為顯性時(shí)，無(wú)論 Vrn2的顯隱性組成如何，小麥的發(fā)育特性為春性；當(dāng) Vrn1的三個(gè)等位基因均為隱性時(shí)， Vrn2為顯性表現(xiàn)為冬性，為隱性則表現(xiàn)為春性[10]。

Yan等[11-12]、Fu等[13]及Chen等[14]通過(guò)比較冬春性材料間春化基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn) Vrn-A1、 Vrn-B1、 Vrn-D1和 Vrn-B3基因在A基因組啟動(dòng)子區(qū)及A、B、D三個(gè)基因組內(nèi)含子區(qū)存在插入或缺失的變異，開(kāi)發(fā)出10對(duì)引物作為區(qū)分冬春性基因型的分子標(biāo)記[11-14]。利用上述標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、不同麥區(qū)小麥的春化基因組成都有差異，加拿大西部的40個(gè)春性小麥中90%的品種含有 Vrn-A1基因，另外10%的品種含有 Vrn-B1基因[15]；姜 瑩等[11]調(diào)查中國(guó)10個(gè)麥區(qū)的153份小麥地方品種，4個(gè)顯性春化基因的分布頻率依次為60.78%( Vrn-D1)、5.88%( Vrn-A1)、5.23%( Vrn-B1)和0( Vrn-B3)；Zhang等[14]對(duì)中國(guó)8個(gè)麥區(qū)的298個(gè)品種的春化基因顯隱性分析發(fā)現(xiàn)， Vrn-D1顯性等位基因占的比例最高，占鑒定品種的37.8%， Vrn-A1基因主要分布于長(zhǎng)城以北的春播麥區(qū)、新疆冬春麥區(qū)和西南冬麥區(qū)，北方冬麥區(qū)春化基因都為隱性，黃淮麥區(qū)是春化基因由隱性向顯性的過(guò)渡地帶；趙 虹等[17]分析1950-2007年黃淮南片冬麥區(qū)的127個(gè)主導(dǎo)小麥品種的春化基因分布，4個(gè)顯性春化基因的分布頻率依次為44.1%( Vrn-D1)、5.5%( Vrn-B1)和1.6%( Vrn-B1+ Vrn-D1)，沒(méi)有品種攜帶顯性基因 Vrn-A1。

關(guān)于品種的春化基因型與品種冬春性的一致性分析，姜 瑩等[11]發(fā)現(xiàn)，春麥區(qū)的一致性較高，冬麥區(qū)的一致性較低，由于對(duì)低溫春化的敏感性 Vrn-A1> Vrn-B1> Vrn-D1，所以 Vrn-B1及 Vrn-D1基因型對(duì)小麥春化發(fā)育特性決定較弱，硬性地將其劃分為春性從而導(dǎo)致 Vrn-D1分布頻率較高的黃淮冬麥區(qū)、長(zhǎng)江中下游麥區(qū)和西南冬麥區(qū)基因推測(cè)的一致性較低，其研究認(rèn)為 Vrn-D1基因型決定的小麥品種應(yīng)為弱春性或弱冬性較為合適[11]。趙 虹等[17]研究發(fā)現(xiàn)，含有 Vrn-B1的品種基本上為春性或弱春性，普遍抗寒性較差，3個(gè)位點(diǎn)都為隱性的品種大部分是冬性或半冬性品種，普遍抗寒性好，含有 Vrn-D1的品種總體處于中間類(lèi)型。袁秀云等[18]報(bào)道含有 Vrn-B1及 Vrn-D1基因的品種春性不強(qiáng)，發(fā)育特性表現(xiàn)為弱春性或半冬性， Vrn1三個(gè)位點(diǎn)全部為隱性的小麥發(fā)育特性表現(xiàn)為冬性、半冬性或弱春性，表明黃淮麥區(qū)的發(fā)育特性與 Vrn1基因組成密切相關(guān)，但可能還有其他的調(diào)控因子參與。眾多學(xué)者研究了不同地區(qū)的小麥所含春化基因的分布情況，以及小麥春化基因和冬春性的關(guān)系，多數(shù)研究結(jié)果證明春化基因類(lèi)型與品種冬春特性基本相符，春化基因控制著小麥品種的冬春特性，但也有研究人員發(fā)現(xiàn)僅用春化基因來(lái)預(yù)測(cè)品種的冬春性還不完善，分子檢測(cè)與田間觀察相結(jié)合能夠更準(zhǔn)確地反映品種的冬春性[8,17]。

黃淮北片冬麥區(qū)是中國(guó)小麥的重要主產(chǎn)區(qū)，播種面積600萬(wàn)hm2左右，占整個(gè)小麥產(chǎn)區(qū)面積的近1/4，關(guān)于黃淮北片麥區(qū)主栽品種冬春性和春化基因關(guān)系的研究還比較少。本研究旨在通過(guò)分析黃淮北片麥區(qū)主栽小麥品種的由低溫春化效應(yīng)推導(dǎo)的冬春性和春化基因分布的關(guān)系，初步得出該麥區(qū)小麥的主要冬春特性及春化基因的分布情況，分析以春化基因指導(dǎo)黃淮北片小麥的冬春特性分類(lèi)的可行性，為指導(dǎo)小麥品種選育提供便捷有效的信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以黃淮北片麥區(qū)的48個(gè)主導(dǎo)小麥品種為材料，品種名稱(chēng)見(jiàn)表2。

1.2 低溫春化處理試驗(yàn)

采用人工模擬低溫春化處理供試的48個(gè)小麥品種，每個(gè)品種取完整飽滿(mǎn)種子400粒，每100粒為1份，低溫春化時(shí)間共設(shè)置4個(gè)處理，春化時(shí)間分別為0、10、20和30 d，每個(gè)處理均選取準(zhǔn)備好的種子100粒，擺放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，加去離子水，于25 ℃培養(yǎng)箱催芽12 h，待小麥萌動(dòng)后放入2～4 ℃低溫光照植物培養(yǎng)箱進(jìn)行春化處理，每隔2～3 d加1次去離子水。為保證不同春化處理小麥播種后感受外界環(huán)境溫度一致性，從2015年2月17日起每10 d處理一批小麥種子，3月18日將不同時(shí)間處理的種子同時(shí)播種在溫室大棚。為避免生長(zhǎng)過(guò)程中低溫導(dǎo)致自然春化和其他因素影響，模擬小麥的生長(zhǎng)環(huán)境設(shè)定控制溫度在20±2 ℃，光周期為16 h(晝)/8 h(夜)，到最低溫度穩(wěn)定達(dá)到16 ℃以上，打開(kāi)大棚，在6月20日麥?zhǔn)战Y(jié)束后檢測(cè)各品種是否正常抽穗成熟。

大棚設(shè)計(jì)是每個(gè)處理播種時(shí)均設(shè)計(jì)2次重復(fù)，采取裂區(qū)設(shè)計(jì)，隨機(jī)排列，每個(gè)品種1行，每行播50粒萌動(dòng)種子，最終觀察抽穗率及籽粒是否成熟。

1.3 DNA提取及春化基因擴(kuò)增

采用CTAB法[19]提取小麥葉片的基因組DNA。序列特異性PCR擴(kuò)增所用引物參考Yan等[11]、Fu等[13]以及Chen等[14]的方法合成(表1)。采用常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增使用寶生物公司的LATaq酶，擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，52～61 ℃退火40 s，72 ℃延伸1～2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同小麥品種低溫春化效應(yīng)的比較

參試品種為黃淮北片麥區(qū)的主栽品種，在田間栽培滿(mǎn)足春化需求條件下的成熟期和石4185相比相差±2 d，屬于熟期相當(dāng)?shù)钠贩N。本研究主要對(duì)黃淮北片麥區(qū)的48個(gè)主栽小麥品種進(jìn)行不同時(shí)間的春化處理，滿(mǎn)足低溫春化需求的小麥品種可以順利的抽穗成熟，沒(méi)有滿(mǎn)足低溫春化需求的小麥品種不能抽穗或抽穗成熟顯著延遲[20]。春化處理時(shí)間分別為0、10、20和30 d，調(diào)查不同品種的抽穗及結(jié)實(shí)情況。依據(jù)不同品種的春化需求，一般將小麥分為3種類(lèi)型，春性、半冬性及冬性，其滿(mǎn)足春化的臨界天數(shù)依次為:春性0～5 d，半冬性20～30 d，冬性>30 d[20]。

由于品種較多，所以其春化臨界點(diǎn)呈現(xiàn)漸變連續(xù)趨勢(shì)。調(diào)查小麥各品種正常成熟所需的低溫春化時(shí)間，并按照春化需求進(jìn)行冬春性分類(lèi)。各品種在不同低溫春化時(shí)間處理下的抽穗結(jié)實(shí)情況及冬春性分類(lèi)記錄如表2所示，石08-6617、滄麥028、衡5229、衡觀35及濟(jì)麥20為春性品種，占參試品種的10.5%，在沒(méi)有進(jìn)行春化處理的條件下依然正常的抽穗，除去濟(jì)麥20成熟較晚外，其他4個(gè)正常成熟，即濟(jì)麥20的春性較其余4個(gè)弱；泰山5366和冀5265需要的春化時(shí)間比春性品種長(zhǎng)，比半冬性品種短，其冬春性介于春性和半冬性之間，暫時(shí)歸為弱春性品種，占參試品種的4.2%；剩下的大多數(shù)品種還是以半冬性為主(36個(gè))，占參試品種的75.0%，冬性品種為5個(gè)，分別為泰山21、泰山22、郯麥98、長(zhǎng)6878和衡136，占參試品種的10.5%，這5個(gè)品種在30 d低溫春化處理下沒(méi)有正常成熟。

由于半冬性品種所占的比例較高，進(jìn)一步對(duì)該類(lèi)品種的春化特性進(jìn)行劃分，低溫春化處理10 d時(shí)該品種存在一定比例的抽穗結(jié)實(shí)現(xiàn)象，低溫春化處理20 d時(shí)完全抽穗結(jié)實(shí)成熟，劃為半冬偏春性；低溫春化處理10 d時(shí)該品種僅有部分抽穗但沒(méi)有結(jié)實(shí)，或者未抽穗，低溫春化處理20 d時(shí)完全抽穗結(jié)實(shí)成熟，劃為半冬中間性；低溫春化處理10 d時(shí)該品種未抽穗結(jié)實(shí)，低溫春化處理20 d時(shí)存在一定比例的抽穗結(jié)實(shí)或抽穗現(xiàn)象，低溫春化30 d時(shí)完全抽穗結(jié)實(shí)成熟，劃為半冬偏冬性。具體各品種冬春性如表2所示，半冬偏春性品種、半冬中間性品種及半冬偏冬性品種數(shù)目基本相當(dāng)，說(shuō)明半冬性的廣泛類(lèi)型都較適宜黃淮北片的生長(zhǎng)環(huán)境。

2.2 黃淮北片麥區(qū)小麥品種春化基因的等位變異

對(duì)于春化基因在不同小麥品種中的分布情況，國(guó)內(nèi)外學(xué)者都有廣泛的研究，本試驗(yàn)用已有的10對(duì)春化基因分子標(biāo)記對(duì)48個(gè)品種的 Vrn-A1、 Vrn-B1、 Vrn-D1及 Vrn-B3 四個(gè)位點(diǎn)上的等位基因進(jìn)行檢測(cè)。

在A基因組中， Vrn-A1位點(diǎn)的顯性和隱性等位變異可用引物Vrn-A1F/Vrn-A1R、Vrn-A1cF/Vrn-A1cR和vrn-A1F/vrn-A1R進(jìn)行檢測(cè)，其中，Vrn-A1F/Vrn-A1R檢測(cè)基因的啟動(dòng)子區(qū)有無(wú)插入或缺失，若擴(kuò)增結(jié)果為650 bp和750 bp，其基因型為 Vrn-A1a，若擴(kuò)增結(jié)果為480 bp，其基因型為 Vrn-A1b，若擴(kuò)增結(jié)果為500 bp，其基因型為 vrn-A1；Vrn-A1cF/Vrn-A1cR和vrn-A1F/vrn-A1R檢測(cè)第一內(nèi)含子區(qū)域有無(wú)缺失，若擴(kuò)增結(jié)果為1 170 bp，其基因型為 Vrn-A1c，若擴(kuò)增結(jié)果為1 068 bp，其基因型為 vrn-A1c。特異性擴(kuò)增結(jié)果(圖1、表3)顯示，Vrn-A1F/Vrn-A1R擴(kuò)增到的結(jié)果為500 bp的片段，推斷這些品種不是 Vrn-A1a和 Vrn-A1b基因型，可能為 vrn-A1，用Vrn-A1cF/Vrn-A1cR沒(méi)有擴(kuò)增到1 170 bp的片段，vrn-A1F/vrn-A1R擴(kuò)增到1 068 bp的片段，說(shuō)明沒(méi)有顯性 Vrn-A1c基因型，即所檢測(cè)的小麥品種均為 vrn-A1基因型。

表1 小麥中已知的Vrn基因各等位類(lèi)型的PCR引物[ 11,13-14]

Table 1 PCR primers for determining the allelic types ofVrngene in wheat[ 11,13-14]

引物名稱(chēng)Primername引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')等位基因Allele擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Expectedproductsize/bp退火溫度Annealingtemperature/℃Vrn-A1FGAAAGGAAAAATTCTGCTCGVrn-A1a650和750Vrn-A1RTGCACCTTCCC(C/G)CGCCCCATVrn-A1bvrn-A148050055.0Vrn-A1cFAGCCTCCACGGTTTGAAAGTAAVrn-A1c117058.9Vrn-A1cRAAGTAAGACAACACGAATGTGAGAvrn-A1FGCACTCCTAACCCACTAACCvrn-A1c106856.0vrn-A1RTCATCCATCATCAAGGCAAAVrn-B1FCAAGTGGAACGGTTAGGACAVrn-B170958.0Vrn-B1RCTCATGCCAAAAATTGAAGATGAvrn-B1FCAAGTGGAACGGTTAGGACAvrn-B1114956.4vrn-B1RCAAATGAAAAGGAATGAGAGCAVrn-D1FGTTGTCTGCCTCATCAAATCCVrn-D1167161.0Vrn-D1RGGTCACTGGTGGTCTGTGCvrn-D1FGTTGTCTGCCTCATCAAATCCvrn-D199761.0vrn-D1RAAATGAAAAGGAACGAGAGCGvrn-B3FATGCTTTCGCTTGCCATCCvrn-B31140/203056.0vrn-B3RCTATCCCTACCGGCCATTAGVrn-B3aFCATAATGCCAAGCCGGTGAGTACVrn-B3a120059.0Vrn-B3aRATGTCTGCCAATTAGCTAGCVrn-B3cFGCTTTGAACTCCAAGGAGAAVrn-B3c140152.0Vrn-B3cRATAATCAGCAGGTGAACCAG

表2 不同春化時(shí)間處理后各小麥品種的抽穗結(jié)實(shí)情況及由春化需求鑒定的品種冬春性

Table 2 The heading and seeding number of tested wheat cultivars under different vernalization and the winterness-springness type detected by the vernalization requirement

品種Cultivar春化天數(shù)Daysofvernalization/d0102030冬春性Winterness-springnesstype石08-6617 Shi08-661750505050S滄麥028 Cangmai02850505050S衡5229 Heng522950505050S衡觀35 Hengguan3550505050S濟(jì)麥20號(hào) Jimai2050M505050S泰山5366 Taishan53660(24)505050WS冀5265 Ji52650(21)50M5050WS舜麥1718 Shunmai17180(20)405050SWPS邯6172 Han6172-30(10)5050SWPS邯08-6012 Han08-60120(20)25(8)5050SWPS科農(nóng)199 Kenong1990(20)25(15)5050SWPS石4185 Shi41850(20)24(11)5050SWPS衡4399 Heng4399-20(7)5050SWPS金禾9123 Jinhe91230(10)20(10)5050SWPS邯麥13號(hào) Hanmai13-20(10)5050SWPS堯麥16 Yaomai16-10(10)5050SWPS衡06-6632 Heng06-6632-10(10)5050SWPS邢麥6號(hào) Xingmai6-20M5050SWPS濟(jì)麥22 Jimai22-0(30)5050SW良星66 Lingxing66-0(25)5050SW良星99 Lingxing99-0(25)5050SW邢麥7號(hào) Xingmai7-0(15)5050SW濟(jì)麥21 Jimai21-0(10)5050SW石麥15號(hào) Shimai15-0(5)5050SW魯墾麥9號(hào) Lukenmai9-0(2)5050SW煙農(nóng)0428 Yannong0428--5050SW濟(jì)麥19 Jimai19--5050SW煙農(nóng)21 Yannong21--5050SW魯原502 Luyuan502--5050SW汶農(nóng)14號(hào) Wennong14--5050SW衡0628 Heng0628--40(10)50SWPW滄麥6005 Cangmai6005--40(10)50SWPW石家莊8號(hào) Shijiahzuang8--40(10)50SWPW冀麥585 Jimai585--40(10)50SWPW邯00-7086 Han00-7086--4050SWPW石優(yōu)20號(hào) Shiyou20--4050SWPW晉麥47 Jinmai47--3550SWPW河農(nóng)6049 Henong6049--3550SWPW河農(nóng)825 Henong825--30(20)50SWPW邢麥4號(hào) Xingmai4--3050SWPW石麥22號(hào) Shimai22--2550SWPW邯4564 Han4564--0(15)50SWPW師欒02-1 Shiluan02-1--0(20)50SWPW泰山21號(hào) Taishan21--40(10)50MW泰山22 Taishan22--40(10)50MW郯麥98 Tanmai98--10(30)50MW長(zhǎng)6878 Chang6878--0(25)50MW衡136 Heng136--1050MW

表中數(shù)據(jù)均表示抽穗品種數(shù)，其中，括號(hào)外數(shù)據(jù)表示抽穗并正常結(jié)實(shí)的品種數(shù)，括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)表示抽穗但未能結(jié)實(shí)的品種數(shù)，正常結(jié)實(shí)但未能正常成熟標(biāo)注“M”；“-”表示未抽穗；S：春性；WS：弱春性；SWPS：半冬偏春性；SW：半冬性；SWPW：半冬偏冬性；W：冬性。下表中同。

The data in the table indicated the number of varieties which headed, but the data outside brackets indicated the number of varieties which headed and seeded, and the data in brackets indicated the number of varieties which headed but did not seed,and the ‘M’ represented the variety seeded but did not mature normally; ‘-’ represented the variety which did not seed; S:Springness; WS:Weak springness; SWPS:Semi-winterness with partial springness; SW:Semi-winterness; SWPW:Semi-winterness with partial winterness; W:Winterneess. The same in the following table.

在B和D基因組中，對(duì)春性品種來(lái)說(shuō)， Vrn1基因的第一內(nèi)含子區(qū)域往往有大片段缺失，其等位類(lèi)型分別為 Vrn-B1 和 Vrn-D1[11]。本文使用Fu等[13]根據(jù)不同等位變異序列差異開(kāi)發(fā)的用于檢測(cè)顯性和隱性的等位變異分子標(biāo)記，其中B基因組引物Vrn-B1F/Vrn-B1R當(dāng)其有大片段的缺失時(shí)，可以擴(kuò)增到709 bp的片段，其基因型為 Vrn-B1，不存在大片段的缺失，引物vrn-B1F/vrn-B1R的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物為1 149 bp，其基因型為 vrn-B1。特異擴(kuò)增結(jié)果(圖1、表3)顯示，沒(méi)有709 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，所有品種都擴(kuò)增到1 149 bp的片段，這些品種都為隱性 vrn-B1。D基因組引物Vrn-D1F/Vrn-D1R當(dāng)其有大片段的缺失時(shí)，可以擴(kuò)增到1 671 bp的片段，其基因型為 Vrn-D1，不存在大片段的缺失，引物vrn-D1F/vrn-D1R的擴(kuò)增產(chǎn)物為997 bp，其基因型為 vrn-D1。特異性擴(kuò)增結(jié)果(圖1、表3)顯示，冀5265、石4185、石麥19、堯麥16和滄麥028等含有1 671 bp 的片段，為 Vrn-D1，其余沒(méi)有此片段的品種可以用引物vrn-D1F/vrn-D1R擴(kuò)增出997 bp的片段，為 vrn-D1。 Vrn-B3位點(diǎn)的顯性和隱性等位變異可用引物Vrn-B3aF/Vrn-B3aR、Vrn-B3cF/Vrn-B3cR以及vrn-B3F/vrn-B3R進(jìn)行檢測(cè)[14]，Vrn-B3aF/Vrn-B3a的檢測(cè)結(jié)果是1 200 bp，基因型為 Vrn-B3a，Vrn-B3cF/Vrn-B3cR檢測(cè)結(jié)果為1 401 bp，基因型為 Vrn-B3c，vrn-B3F/vrn-B3R擴(kuò)增條帶為1 140 bp或2 030 bp時(shí)，為 vrn-B3。特異性擴(kuò)增結(jié)果(圖1、表3)顯示，所有品種都擴(kuò)增到1 140 bp的片段，即這些品種基因型均為 vrn-B3。

總結(jié)這48個(gè)品種的春化基因分子標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果(表3)，參試品種中沒(méi)有攜帶顯性基因 Vrn-A1、 Vrn-B1及 Vrn-B3，有11個(gè)品種含有顯性基因 Vrn-D1，占檢測(cè)品種的22.9%。

2.3 小麥春化基因組成與冬春性的相關(guān)性分析

黃淮北片冬麥區(qū)以半冬性品種為主，主要的春化基因組成為 vrn-A1/ vrn-B1/ vrn-B3/ vrn-D1全隱性，或者 Vrn-D1顯性。根據(jù)本試驗(yàn)用春化基因分子標(biāo)記檢測(cè)的基因型來(lái)預(yù)測(cè)其冬春性，將預(yù)測(cè)的冬春性和本試驗(yàn)通過(guò)低溫春化需求檢測(cè)的冬春性進(jìn)行一致性比較分析，發(fā)現(xiàn)含有顯性春化基因 Vrn-D1的這11個(gè)品種，根據(jù)春化基因組成推測(cè)其為春性，而低溫春化需求鑒定表明其中有4個(gè)春性品種，2個(gè)弱春性品種，5個(gè)半冬偏春性品種，春化基因推測(cè)的冬春性和實(shí)際鑒定的冬春性的一致性為54.5%；不含顯性春化基因 Vrn-D1(即基因型為 vrn-A1/ vrn-B1/ vrn-B3/ vrn-D1)的37個(gè)品種，根據(jù)春化基因組成推測(cè)其為冬性，低溫春化需求鑒定出1個(gè)春性品種，31個(gè)半冬性品種，5個(gè)冬性品種，春化基因推測(cè)的冬春性和實(shí)際鑒定的冬春性的一致性為97.3%。總計(jì)這48個(gè)品種通過(guò)春化基因推測(cè)的冬春性和低溫春化需求鑒定的冬春性的一致性為87.5%。

1：石優(yōu)20；2：邢麥6號(hào)；3：邢麥7號(hào)；4：煙農(nóng)0428；5：堯麥16；6：河農(nóng)6049；7：河農(nóng)825；8：衡5229；9：衡觀35；10：金禾9123；11：科農(nóng)199；12：師欒02-1；13：濟(jì)麥19；14：濟(jì)麥20；15：濟(jì)麥22；16：良星99; M:D2000 plus DNA ladder。

1:Shiyou 20; 2:Xingmai 6; 3:Xingmai 7; 4:Yannong 0428; 5:Yaomai 16; 6:Henong 6049; 7:Henong 825; 8:Heng 5229; 9:Hengguan 35; 10:Jinhe 9123; 11:Kenong 199; 12:Shiluan 02-1; 13:Jimai 19; 14:Jimai 20; 15:Jimai 22; 16:Liangxing 99; M:D2000 plus DNA ladder.

圖1 部分品種不同春化基因分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果

Fig.1 Detection results using different vernalization gene markers in part of the wheat cultivars

表3 供試小麥品種春化基因的等位變異以及由春化基因推導(dǎo)的冬春性

Table 3 The allelic composition of vernalization gene and the comparison of winterness-springness type deduced by vernalization genes in 48 wheat cultivars

品種CultivarVrn-A1位點(diǎn)Vrn-A1locusVrn-B1位點(diǎn)Vrn-B1locusVrn-B3位點(diǎn)Vrn-B3locusVrn-D1位點(diǎn)Vrn-D1locus冬春性Winterness-springnesstype石08-6617 Shi08-6617vrn-A1vrn-B1vrn-B3Vrn-D1S滄麥028 Cangmai028vrn-A1vrn-B1vrn-B3Vrn-D1S衡5229 Heng5229vrn-A1vrn-B1vrn-B3Vrn-D1S衡觀35 Hengguan35vrn-A1vrn-B1vrn-B3Vrn-D1S濟(jì)麥20號(hào) Jimai20vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W泰山5366 Taishan5366vrn-A1vrn-B1vrn-B3Vrn-D1S冀5265 Ji5265vrn-A1vrn-B1vrn-B3Vrn-D1S舜麥1718 Shunmai1718vrn-A1vrn-B1vrn-B3Vrn-D1S邯6172 Han6172vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W邯08-6012 Han08-6012vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W科農(nóng)199 Kenong199vrn-A1vrn-B1vrn-B3Vrn-D1S石4185 Shi4185vrn-A1vrn-B1vrn-B3Vrn-D1S衡4399 Heng4399vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W金禾9123 Jinhe9123vrn-A1vrn-B1vrn-B3Vrn-D1S邯麥13號(hào) Hanmai13vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W堯麥16 Yaomai16vrn-A1vrn-B1vrn-B3Vrn-D1S衡06-6632 Heng06-6632vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W邢麥6號(hào) Xingmai6vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W濟(jì)麥22 Jimai22vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W良星66 Lingxing66vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W良星99 Lingxing99vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W邢麥7號(hào) Xingmai7vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W濟(jì)麥21 Jimai21vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W石麥15號(hào) Shimai15vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W魯墾麥9號(hào) Lukenmai9vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W煙農(nóng)0428 Yannong0428vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W濟(jì)麥19 Jimai19vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W煙農(nóng)21 Yannong21vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W魯原502 Luyuan502vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W汶農(nóng)14號(hào) Wennong14vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W衡0628 Heng0628vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W滄麥6005 Cangmai6005vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W石家莊8號(hào) Shijiahzuang8vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W冀麥585 Jimai585vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W邯00-7086 Han00-7086vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W石優(yōu)20號(hào) Shiyou20vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W晉麥47 Jinmai47vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W河農(nóng)6049 Henong6049vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W河農(nóng)825 Henong825vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W邢麥4號(hào) Xingmai4vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W石麥22號(hào) Shimai22vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W邯4564 Han4564vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W師欒02-1 Shiluan02-1vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W泰山21號(hào) Taishan21vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W泰山22 Taishan22vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W郯麥98 Tanmai98vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W長(zhǎng)6878 Chang6878vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W衡136 Heng136vrn-A1vrn-B1vrn-B3vrn-D1W

3 討 論

選擇適應(yīng)性好的小麥推廣品種是高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的前提，廣適的小麥品種可以有效的減少干旱及凍害等災(zāi)難氣候?qū)Ξa(chǎn)量的損失[21-22]。掌握品種的冬春性特點(diǎn)，是小麥育種、品種審定推廣及溫室加代等工作的重要內(nèi)容[22]。傳統(tǒng)的冬春性鑒定方法對(duì)栽培及氣候條件要求嚴(yán)格，春化基因 Vrn-1及 Vrn-B3已作為輔助手段廣泛地用于鑒定品種的冬春性[11,17-18,20]。孫果忠等[20]以黃淮麥區(qū)15個(gè)品種為材料，發(fā)現(xiàn)春化基因 Vrn-1不同的等位基因具有累加效應(yīng)， Vrn-1等位基因組成、春化臨界點(diǎn)和發(fā)育進(jìn)程之間的密切相關(guān)。姜 瑩等[11]調(diào)查了中國(guó)10大麥區(qū)的153個(gè)小麥品種，發(fā)現(xiàn)基因型與表現(xiàn)型一致性在春麥區(qū)較高，在黃淮冬麥區(qū)、長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)和西南冬麥區(qū)較低，主要是與 Vrn-D1位點(diǎn)的顯性變異有關(guān)，建議該位點(diǎn)決定的基因型應(yīng)為弱冬性或弱春性。

春化基因的出現(xiàn)頻率與小麥品種的分布地域有很大的關(guān)系。 Vrn-A1和 Vrn-B1顯性突變主要出現(xiàn)在東北春麥區(qū)、新疆春冬麥區(qū)和北部春麥區(qū)，而 Vrn-D1顯性突變?cè)谥袊?guó)各大麥區(qū)都有分布，在北部冬麥區(qū)分布最少[11]。參與調(diào)查的黃淮北片的48個(gè)小麥品種中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯性基因 Vrn-A1、 Vrn-B1和 Vrn-B3，有22.9%的品種含有顯性基因 Vrn-D1。而春化基因和冬春性的一致性分析中，前人鑒定的春化基因型和表現(xiàn)型一致性較低的麥區(qū)主要是黃淮冬麥區(qū)、長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)和西南冬麥區(qū)，主要與 Vrn-D1的顯性變異有關(guān)。而黃淮北片作為小麥的主產(chǎn)區(qū)同時(shí)是基因型與表現(xiàn)型一致性較差的區(qū)域，分析基因型對(duì)表現(xiàn)型的指導(dǎo)作用尤為重要。黃淮北片麥區(qū)出現(xiàn)頻率最高(77.1%)的 vrn-A1/ vrn-B1/ vrn-B3/ vrn-D1等位基因，其檢測(cè)的品種絕大多數(shù)屬于半冬性及冬性品種，僅有一個(gè)品種例外，濟(jì)麥20不含任何已知的 Vrn-1等位基因的顯性基因，不經(jīng)歷春化也可以正常結(jié)實(shí)[23]，表明其中含有其他影響小麥春化需求的遺傳因素，首先推測(cè)其中還有其他未檢測(cè)的春化基因效應(yīng)，如 Vrn2、 Vrn-D4，但其作用機(jī)制還不是很清楚[9-10,24]，其次這些STS分子標(biāo)記只檢測(cè)引物所在區(qū)域內(nèi)序列大小的差異，也可能是這些檢測(cè)區(qū)域內(nèi)部發(fā)生影響蛋白功能的序列突變，或者該基因的未檢測(cè)區(qū)段存在變異。其余的品種含有 Vrn-D1(22.9%)，分析其在春化過(guò)程中的效應(yīng)發(fā)現(xiàn)， Vrn-D1基因型的小麥品種以春性品種最多(54.5%)，其次為半冬性(45.5%)，前人的研究表明， Vrn-D1對(duì)春化作用較為敏感，其基因型決定的小麥品種以弱春性或者半冬性較為合適。本研究也發(fā)現(xiàn) Vrn-D1在不同品種中都表現(xiàn)一定程度的春性，即含有 Vrn-D1的品種屬于春性、弱春性以及半冬偏春性類(lèi)型，由于本試驗(yàn)使用的 Vrn-D1位點(diǎn)的分子標(biāo)記是用于檢測(cè)顯性等位變異的分子標(biāo)記，而近期研究表明， Vrn-D1啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)單核苷酸變異(C/A)使得攜帶該基因的小麥品種從春性變?yōu)榘攵裕瑢⒋盒云贩N的 Vrn-D1命名為 Vrn-D1a，半冬性品種的 Vrn-D1命名為 Vrn-D1b[25]。進(jìn)一步對(duì) Vrn-D1的兩個(gè)顯性等位變異進(jìn)行細(xì)分，可能更有助于分析 Vrn-D1在不同品種中的春化需求的差異。

小麥春化效應(yīng)的研究是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不同品種的春化需求除了和春化基因的顯隱性有關(guān)，和不同春化基因的等位變異及拷貝數(shù)都有關(guān)系，研究報(bào)道 Vrn-A1的拷貝數(shù)和春化需求緊密相關(guān)，隨著 Vrn-A1位點(diǎn)拷貝數(shù)增加，對(duì)低溫春化處理需求增加，即冬性增加[26]。文中未檢測(cè)到顯性 Vrn-A1的存在，所以未對(duì)拷貝數(shù)進(jìn)行分析。文中對(duì) Vrn-B1、 Vrn-D1檢測(cè)的引物主要用于檢測(cè)顯性變異，但并未對(duì)哪一個(gè)類(lèi)型的顯性等位變異進(jìn)行細(xì)分，沒(méi)有檢測(cè)到 Vrn-B1顯性等位變異，對(duì) Vrn-D1顯性等位變異的細(xì)分將有助于進(jìn)一步分析該基因在不同品種中的春化需求差異，有望進(jìn)一步提高黃淮北片麥區(qū)春化基因的基因型和表現(xiàn)型的一致性。

4 結(jié) 論

眾多科研人員分析了不同麥區(qū)春化基因型和冬春性的一致性指數(shù)，不同麥區(qū)的指數(shù)有一定差異，前人鑒定的黃淮冬麥區(qū)的基因型和表現(xiàn)型的一致性較低，本研究鑒定黃淮北片的基因型和表現(xiàn)型的一致性為87.5%，可以用來(lái)快速檢測(cè)本麥區(qū)品種的冬春性，采用春化基因分子標(biāo)記與傳統(tǒng)的冬春性鑒定方法相結(jié)合來(lái)認(rèn)識(shí)品種冬春性、預(yù)測(cè)品種的抗寒性對(duì)黃淮北片小麥品種利用更具有指導(dǎo)意義[19]。

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Analysis of Winterness-Springness Type and Vernalization Genes in the Main Wheat Cultivars from the North of Yellow and Huai Valley of China

ZHAO Yankun1,ZHANG Wensheng2,WANG Xiutang1,FU Xiaoyi1,JIA Dan1,GAO Zhenxian1,SHI Zhanliang1,HE Mingqi1

(1.Shijiazhuang Academy of Agricultural and Forestry Sciences,Shijiazhuang,Hebei 050041,China; 2.Center for Agricultural Resources Research,Institute of Genetics and Developmental Biology,the Chinese Academy of Science,Shijiazhuang,Hebei 050021,China)

To analyze the relationship between the winterness-springness type and the vernalization genes in wheat from the North of Yellow and Huai Valley of China,48 wheat cultivars were selected. The winterness-springness type of wheat cultivars was analyzed by the vernalization requirement,and the distribution of vernalization genes in wheat varieties was also analyzed. We found that 36 wheat varieties(accounting for 75%) were semi-winterness type,and five(taking up to 10.4%) and two wheat varieties(taking up to 4.2%) were springness type and weak springness type,respectively,and five wheat varieties were winterness type.In this study,the main gene type was vrn-A1/ vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3 in 37 wheat varieties,accounting for 77.1%,and the Vrn-D1 dominant vernalization allele was detected in the other eleven wheat cultivars,taking up to 22.9%,but Vrn-A1a, Vrn-B1,and Vrn-B3 dominant alleles were not detected. Our research showed that the winterness-springness habit deduced by the gene type vrn-A1/ vrn-B1/ vrn-D1/ vrn-B3 showed 97.3% identity with the vernalization requirement,and the winterness-springness habit deduced by the gene type Vrn-D1 showed 54.5% identity with the vernalization requirement.In a word,the winterness-springness habit detected by molecular marker analysis of vernalization genes showed 87.5% identity with the vernalization requirement,so that we could deduced the winterness-springness habit quickly by the molecular marker analysis of vernalization genes in the North of Yellow and Huai Valley of China. We should combine the molecular marker analysis of vernalization genes and the winterness-springness habit observation in the field to learn more about the winterness-springness habit. The research would provide some useful information for the genetic improvement of the winter wheat in the North of Yellow and Huai Valley of China.

Wheat; The North of Yellow and Huai Valley; Winterness-springness type; Vernalization genes

時(shí)間：2016-11-04

2016-04-19

2016-10-17

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201203033-06)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(小麥)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(nycytx-03) 第一作者E-mail:kun262004@163.com 通訊作者：何明琦(E-mail:hemingqi@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)11-1440-09

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