鯪魚皮膠原肽的制備及其抗氧化活性的檢測

武翠玲，吳日幫，劉丹，楊興昊，張姜，黃嘉豐，何海倫

1 中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點實驗室，湖南 長沙 410013

2 長治醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，山西 長治 046000

鯪魚皮膠原肽的制備及其抗氧化活性的檢測

武翠玲1,2，吳日幫1，劉丹1，楊興昊1，張姜1，黃嘉豐1，何海倫1

1 中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點實驗室，湖南 長沙 410013

2 長治醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，山西 長治 046000

武翠玲, 吳日幫, 劉丹, 等. 鯪魚皮膠原肽的制備及其抗氧化活性的檢測. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(12): 1727-1734.

Wu CL, Wu RB, Liu D, et al. Preparation and antioxidant activity detection of collagen peptide fromCirrhinus molitorellaskin. Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1727-1734.

為了以細菌胞外蛋白酶酶解低值蛋白資源制備抗氧化活性肽以及挖掘新型蛋白酶，采用液體發(fā)酵培養(yǎng)的方法對假交替單胞菌Pseudoalteromonassp. SHK1-2進行發(fā)酵產(chǎn)酶，獲得胞外蛋白酶粗酶液用于酶解熱水法提取的鯪魚膠原蛋白，通過超濾、sephadex LH-20分子篩層析獲得具有DPPH自由基清除能力 (35.6%±7%)、氧自由基清除能力 (Oxygen radical absorbance capacity，ORAC) 及DNA氧化損傷抑制活性的小分子肽，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用鑒定該活性肽分子量為776.2 Da，預(yù)測氨基酸序列為Thr-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Thr-His。ORAC檢測驗證了人工合成的多肽同樣具有抗氧化活性。研究表明細菌胞外蛋白酶在低值資源高值化中具有一定的應(yīng)用前景，對于新型蛋白酶及其應(yīng)用的挖掘具有一定的參考意義。

抗氧化肽，鯪魚，膠原蛋白，DPPH，ORAC，DNA氧化損傷

活性氧簇 (Reactive oxygen species，ROS)是一系列具有高化學(xué)活性的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)物，包括超氧陰離子自由基 (O2?·)、羥自由基(HO·)、氮氧自由基 (NO·)、過氧自由基 (ROO·)、過氧化氫 (H2O2) 等。ROS在宿主抵御外來病原體感染中起著重要的作用，同時也作為信號分子參與到了多種細胞信號通路當中[1-2]。然而，過度累積的活性氧自由基會攻擊損傷膜脂、蛋白、核酸以及其他細胞內(nèi)生物活性大分子，從而引發(fā)細胞的衰老、病變與凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和免疫功能弱化等多種疾病都存在著脂質(zhì)過氧化、自由基形成、蛋白氧化、酪氨酸硝基化和DNA/RNA氧化損傷的特征，因此氧化損傷被認為是誘發(fā)多種慢性疾病的一個重要因素[3-4]。此外，自由基在食品中也會導(dǎo)致脂類氧化酸敗并產(chǎn)生有毒的物質(zhì)，這逐漸成為食品工業(yè)領(lǐng)域一個擔憂的問題[5]。為此，多種人工合成的抗氧化劑也應(yīng)運而生，如二叔丁基對甲酚、叔丁基對苯二酚等，但這些抗氧化劑對人體具有一定的毒性，因此在食品工業(yè)與醫(yī)藥領(lǐng)域都被嚴格限制用量[6-7]。

近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)某些小分子肽段具有自由基清除能力，這為尋找新型抗氧化劑提供了一種新思路。天然存在的抗氧化活性肽種類極少，因此通過水解大分子蛋白質(zhì)獲得新型的抗氧化活性肽成為研究的熱點。目前已證實有多種蛋白質(zhì)資源可用于抗氧化活性肽的制備，如黑鰭鯊皮明膠[8]、黃魚魚皮明膠[9]、黃花魚肉[10]、三文魚下腳料[11-12]等動物源蛋白，以及微藻[13]、豆粕[14]、油料渣[15]等植物源蛋白質(zhì)。

鯪魚Cirrhinus molitorella是一種在我國華南地區(qū)廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟魚類，魚皮在加工過程中往往被丟棄，而動物皮膚中含有豐富的膠原蛋白，而且魚皮中膠原蛋白含量比陸地生動物皮膚中膠原蛋白含量要高，膠原結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性更低，因此可作為一種生物活性肽制備的低值蛋白資源加以利用，但目前國內(nèi)外利用鯪魚皮制備活性肽的研究仍十分缺乏。本研究擬采用微生物胞外蛋白酶酶解鯪魚皮中的膠原蛋白，通過一系列的分離純化手段制備出具有抗氧化活性的寡肽，為鯪魚下腳料的綜合高值化利用提供參考。

1 材料

1.1 實驗材料

假交替單胞菌Pseudoalteromonassp. SHK1-2 (實驗室保存菌株)，新鮮鯪魚皮 (水產(chǎn)市場)；酵母浸出粉、胰蛋白胨 (OXOID)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH，Sigma)；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

液相色譜儀 (上海青浦滬西儀器廠)；高速冷凍離心機 (Thermo)；EnSpire酶標儀(PerkinElmer)；Sephadex LH-20凝膠色譜柱(16 mm×600 mm，GE Healthcare)。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基

人工海水：NaCl 2.815 g，MgSO4·7H2O 0.692 g，KCl 0.067 g，MgCl2·6H2O 0.551 g，CaCl20.145 g，ddH2O 100 mL。

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，酵母浸出粉0.1 g，F(xiàn)e2(PO4)30.001 g，人工海水100 mL，pH 7.8。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：玉米粉2 g，麩皮1 g，豆粕2 g，Na2HPO40.1 g，KH2PO40.03 g，CaCl20.1 g，Na2CO30.1 g，人工海水100 mL，pH 7.8。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)酶

將產(chǎn)胞外蛋白酶菌株P(guān)seudoalteromonassp. SHK1-2接種于2216E液體培養(yǎng)基，17 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，將活化的菌種按照2%接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，17 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 d，將發(fā)酵液10 000×g、4 ℃離心20 min，取上清并用20 mmol/L的Tris-HCl (pH 7.8) 透析4 h，重復(fù)3次，獲得粗酶液。

2.3 鯪魚皮膠原蛋白的制備

使用熱水法提取鯪魚膠原蛋白：取洗凈的魚皮置于燒杯中，加入超純水，然后放置在80 ℃水浴鍋中靜置水浴30 min，用4層紗布過濾，取濾液，12 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液，用雙蒸水透析4 h，重復(fù)3次，然后放置在預(yù)冷的真空冷凍干燥機中，進行冷凍干燥，獲得魚皮膠原蛋白。

2.4 制備抗氧化活性肽

2.4.1 酶解膠原蛋白

根據(jù)酶與底物比例1∶10 (mL/mg) 將粗酶液與魚皮膠原蛋白混合，置于37 ℃、100 r/min恒溫水平搖床中酶解5 h；將酶解液置于95 ℃水浴鍋中加熱10 min使酶失活，冷卻至室溫后，10 000×g、4 ℃離心5 min去除變性大分子蛋白，收集上清，加入到截留分子量為3 kDa的超濾管中，3 000×g離心45 min，收集超濾管下層濾液。

2.4.2 分離純化

使用Sephadex LH-20凝膠色譜柱對酶解產(chǎn)物進行層析：以兩倍體積超純水作為流動相平衡色譜柱，按柱床體積3%-5%上樣，用超純水洗脫3-4倍體積，流速為1 mL/min，檢測波長為220 nm，收集各組分峰，冷凍干燥，然后用超純水重溶。

2.5 抗氧化能力檢測

2.5.1 DPPH自由基清除率

參照劉平懷等[16]的方法進行改進優(yōu)化。取20 μL濃度為100 μg/mL的分離樣品，加入60 μmol/L的DPPH溶液 (以95%乙醇為溶劑) 100 μL，在室溫下密封避光反應(yīng)60 min，然后檢測517 nm下的吸光度，清除率計算公式如下：

DPPH清除率=[1-(As-Ab)/Ac]×100%

其中As代表實驗組吸光度，Ab代表用95%乙醇代替DPPH后的吸光度，Ac代表用雙蒸水代替樣品后的吸光度，每組做3次重復(fù)實驗，以維生素C (VC) 作為陽性對照。

2.5.2 對DNA氧化損傷的抑制作用

參照Sheih等[17]的方法進行改進優(yōu)化。取6 μL pET-22b質(zhì)粒DNA，加入4 μL 2 mmol/L FeSO4與6 μL待測組分，輕輕混勻后，加入4 μL0.06 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，37 ℃水浴5 min，然后加入5 μL 5×DNA電泳上樣緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳緩沖液為TAE緩沖液，電泳條件為120 V恒壓電泳25 min，以雙蒸水代替樣品作為損傷組。

2.5.3 氧自由基吸收能力評價 (ORAC)

2.6 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用鑒定活性肽

使用Agilent 6200 Series TOF/6500 Series Q-TOF LC/MS系統(tǒng)對活性組分峰進行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 鯪魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物的分離純化

如圖1所示，通過3 kDa截留分子量超濾分離后的鯪魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物，經(jīng)過Sephadex LH-20分子篩層析后獲得8個主要的組分，根據(jù)洗脫時間分別命名為F1-F8。

圖1 酶解產(chǎn)物下層超濾組分的Sephadex LH-20分子篩色譜圖Fig. 1 Sephadex LH-20 size exclusion chromatography of small fraction from hydrolysate after ultrafiltration.

3.2 檢測DPPH自由基清除能力

如圖2所示，同一質(zhì)量濃度下各分離組分均有一定的DPPH自由基清除能力，其中組分F8的自由基清除能力最強，為35.6%±7%，該結(jié)果符合抗氧化肽分子量較小的特點。

圖2 Sephadex LH-20分離組分的DPPH自由基清除能力Fig. 2 DPPH scavenging activity of fractions purified by Sephadex LH-20.

3.3 檢測活性組分對氧化誘導(dǎo)DNA損傷的抑制作用

如圖3所示，無損傷組超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒DNA含量最高，說明質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)完好，損傷組超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒DNA基本消失，DNA含量也明顯降低，說明質(zhì)粒DNA受到嚴重的氧化損傷，加入酶解樣品和分離樣品的實驗組DNA均有一定程度的損傷，但損傷程度小于損傷組，說明酶解產(chǎn)物和分離組分具有一定的抗氧化性。DNA損傷是生物體內(nèi)由氧化應(yīng)激引起的細胞病變的典型現(xiàn)象之一。目前已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)部分抗氧化活性肽具有該能力。Sheih等[17]研究表明酶解藻蛋白制備的抗氧化肽具有DNA保護功能以及提高AGS細胞在氧化損傷后存活率的功能。Karawita等[19]發(fā)現(xiàn)微藻蛋白酶解物具有抑制DNA氧化損傷以及修復(fù)過氧化氫損傷小鼠L5178淋巴細胞的作用。具有抑制DNA氧化損傷功能的多肽可作為一種潛在藥物或功能補充劑用于預(yù)防與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生，如腫瘤[20]、心血管疾病[21]以及阿爾茲海默[22]。

圖3 分離組分F8抑制氧化誘導(dǎo)損傷DNA的能力Fig. 3 Inhibition activity of isolated fraction F8 in DNA oxidation-induced damage test.

3.4 檢測活性組分的氧自由基吸收能力

由熒光衰減曲線圖4可見，PBS緩沖液對照組熒光強度衰減非常迅速，而高濃度的VC能夠抑制熒光強度的衰減，當分離組分F8存在時，也可以抑制由自由基引起的熒光變化，且抑制程度隨濃度增加而增加，由此可知分離組分F8具有一定的氧自由基吸收能力?？寡趸耐ㄟ^提供氫原子與氧自由基反應(yīng)而阻斷過氧自由基的持續(xù)損傷，供氫能力與特定的氨基酸殘基有密切聯(lián)系[23]，如半胱氨酸殘基、酪氨酸殘基、組氨酸殘基等，可分別從其側(cè)鏈基團上的巰基、酚羥基以及咪唑環(huán)上提供氫原子，并且通過形成二硫鍵或以電子共軛的方式穩(wěn)定自身結(jié)構(gòu)，從而阻斷自由基鏈式反應(yīng)[24]。

圖4 分離組分F8氧自由基清除活性Fig. 4 Peroxyl radical scavenging activity assay of isolated fraction F8.

3.5 活性組分F8的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用鑒定結(jié)果

如圖5所示，組分F8在高效液相色譜中有一主要的成分，通過質(zhì)譜鑒定該組分分子量約為776.2 Da，通過比對預(yù)測該活性肽序列為Thr-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Thr-His，具有典型的膠原蛋白Gly-X-Y序列特征，理論分子量為776.4 Da，與檢測值接近。根據(jù)質(zhì)譜檢測所獲得的多肽氨基酸序列進行固相合成 (由上海強耀生物科技有限公司合成)，并使用氧自由基吸收能力檢測方法驗證該合成多肽的抗氧化活性。從圖6可見，與PBS緩沖液對照組的熒光曲線相比，加入濃度為100 μg/mL的合成多肽后，熒光素鈉衰減明顯減慢，證明該多肽具有一定清除氧自由基的能力。

4 結(jié)論

Pseudoalteromonassp. SHK1-2發(fā)酵所產(chǎn)胞外蛋白酶對熱水法提取的鯪魚膠原蛋白進行酶解，通過超濾分離、Sephadex LH-20分子篩層析純化后可獲得具有DPPH自由基清除能力和氧自由基吸收能力的抗氧化活性肽，并且對氧化誘導(dǎo)損傷的DNA具有一定的保護作用，通過液質(zhì)聯(lián)用結(jié)果預(yù)測以及人工合成多肽驗證，抗氧化活性肽的序列為Thr-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Thr-His，是一種新型抗氧化肽。目前市售蛋白酶面臨的主要問題為成本高，酶活性不高，對溫度、鹽度、pH值的適應(yīng)性較低，這限制了市售蛋白酶在低值蛋白酶解制備生物活性肽中的應(yīng)用。本研究利用細菌發(fā)酵所產(chǎn)胞外蛋白酶代替市售蛋白酶，可大大減少酶制劑采購成本，同時可促進自主性新型膠原蛋白酶的挖掘與利用，對于彌補蛋白酶制備活性肽領(lǐng)域的空白具有重要的意義。此工藝成本較低，使用熱水法提取膠原蛋白不僅有效縮短膠原提取工藝時間，減少化學(xué)試劑的使用，提高蛋白提取率，還能適當破壞膠原蛋白的緊密結(jié)構(gòu)，有利于蛋白酶的結(jié)合與作用，從而提高活性肽的產(chǎn)量。下一步將對酶解工藝進行優(yōu)化，獲得最優(yōu)酶解條件，同時對鑒定獲得的多肽的氨基酸進行增加、減少、替換和多肽修飾等處理，探究氨基酸種類、關(guān)鍵氨基酸位置、多肽結(jié)構(gòu)對抗氧化活性的影響，為抗氧化肽的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，指導(dǎo)新型抗氧化肽制備與發(fā)掘。

圖5 分離組分F8的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果Fig. 5 Liquid chromatography mass spectrum analysis of isolated fraction F8.

圖6 合成多肽的氧自由基清除活性Fig. 6 Peroxyl radical scavenging activity assay of synthesized peptide.

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(本文責編 郝麗芳)

Preparation and antioxidant activity detection of collagen peptide from Cirrhinus molitorella skin

Cuiling Wu1,2, Ribang Wu1, Dan Liu1, Xinghao Yang1, Jiang Zhang1, Jiafeng Huang1, and Hailun He1
1 State Key Laboratory of Medical Genetics, School of Life Sciences, Central South University, Changsha 410013, Hunan, China 2 Department of Biochemistry, Changzhi Medical College, Changzhi 046000, Shanxi, China

In order to prepare antioxidant peptide through hydrolyzing low-value protein resources with bacterial extracellular proteases and to discover novel proteases, crude extracellular protease fromPseudoalteromonassp. SHK1-2 was obtained through fermentation which was used to hydrolyze collagen extracted fromCirrhinus molitorellaskin. Small peptide fraction was isolated from hydrolysate by ultrafiltration and Sephadex LH-20 size exclusion chromatography and showed 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activity (35.6%±7%), oxygen radical absorbance capacity and inhibition of DNA oxidation damage. The molecule weight was 776.2 Da, and amino acid sequence was Thr-Ala-Gly-His-Pro- Gly-Thr-His through liquid chromatography mass spectrum. Our findings suggest that peptide obtained from low-value protein of fish waste by hydrolysis with bacterial protease has antioxidant activity.

antioxidant peptide,Corrhinus molitorella, collagen, DPPH, ORAC, DNA oxidation damage

Hailun He. Tel: +86-181-63676344; E-mail: helenhe@csu.edu.cn

Received:April 21, 2016;Accepted:October 8, 2016

Supportedby: National Natural Science Foundation of China (No. 31370104), National Sparking Plan Project (No. 2013GA770009), Scientific Research Foundation of Changzhi Medical College (No. QDZ201517).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31370104)，國家星火計劃面上項目 (No. 2013GA770009)，長治醫(yī)學(xué)院科研啟動基金項目 (No. QDZ201517) 資助。

時間：2016-10-24

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20161024.1059.001.html