β—殼聚糖的制備、降解及膽固醇吸附活性研究

金夢璇+劉慧文+魯青

摘要：目的：制備β-殼聚糖、β-殼寡糖，并探究濃度對β-殼聚糖膽固醇吸附能力的影響。方法：使用魷魚骨制備β-殼聚糖，通過微波輔助過氧化氫法降解β-殼聚糖得到不同分子量的β-殼寡糖，并利用高效液相測定降解時間與所得殼寡糖分子量的關(guān)系，以纖維素為陽性對照，測定濃度對殼寡糖膽固醇吸附能力的影響。結(jié)論：利用魷魚骨制備得到了β-殼聚糖，并降解得到了低分子量的β-殼寡糖。通過實驗得到結(jié)論，與纖維素相比β-殼寡糖對膽固醇具有較高吸附活性，且吸附能力與其濃度有關(guān)。

關(guān)鍵詞：β-殼聚糖β-殼寡糖膽固醇吸附活性研究

一、概述

1.甲殼素和殼聚糖

甲殼素又名甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)等，化學(xué)名β-（1，4）-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡聚糖，廣泛存在于節(jié)肢動物的外殼及某些微生物的細胞壁中，是自然界存在的第二大天然有機化合物，僅次于纖維素。甲殼素經(jīng)強堿處理，脫乙酰形成殼聚糖，殼聚糖的化學(xué)名為β-（1，4）-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖，殼聚糖與纖維素有相似的結(jié)構(gòu)，只是纖維素2位上是羥基，殼聚糖的是氨基。甲殼素與殼聚糖結(jié)構(gòu)式如圖1：

甲殼素與殼聚糖作為天然產(chǎn)物， 具有資源豐富、安全無毒、生物相溶性、生物可降解性、細胞親和性、抗菌性等優(yōu)點， 應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。但因其只溶于酸性介質(zhì)，而不溶于水或一般有機溶劑，使其應(yīng)用方面仍受到一定限制。

2.β-殼聚糖

隨著海洋漁業(yè)發(fā)展，每年都有大量的魷魚骨由于其不可食用性而作為生產(chǎn)垃圾丟棄，這不僅浪費資源，也污染環(huán)境。魷魚骨是重要的海洋資源——β-殼聚糖的主要來源。β-殼聚糖具有不同于α-殼聚糖的平行結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其在制備方法和實際應(yīng)用上，也與α-殼聚糖有著明顯差別。通常β-殼聚糖較α-殼聚糖具有相對弱的分子間作用力，因而溶解性、反應(yīng)活性和對溶劑的親和性更好。作為一種可再生的天然多糖材料，β-殼聚糖已經(jīng)廣泛應(yīng)用于傷口縫合和軟骨損傷等醫(yī)藥領(lǐng)域，能夠促進細胞再生、防止疤痕形成。此外研究發(fā)現(xiàn)，β-殼聚糖具有更好的保水性和保濕性；同樣條件下，β-甲殼素更易脫乙酰基。

當(dāng)下肥胖日益普遍，并帶來一系列健康問題，過多攝入膽固醇是肥胖的起因之一。而目前尚缺乏對β-殼寡糖后對膽固醇吸附能力的研究，通過實驗研究可以為減肥藥物的研發(fā)提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

二、材料與方法

1.實驗材料

魷魚骨（日本槍烏賊，Loligo Japonica）；1%的氫氧化鈉溶液；4%的鹽酸溶液；

過氧化氫；冰乙酸溶液；纖維素；膽固醇；氯化鈉；油醇。

2.實驗儀器

超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)（南京先歐儀器制造有限公司）

電子天平（Electronic Scale）；水浴鍋（IKA HB10 digital）

立式壓力蒸汽滅菌器（BOXUN）；超聲波細胞粉粹機（寧波新芝科器研究所）

震蕩培養(yǎng)箱ZQLY-180F（上海知楚儀器）；膽固醇試劑盒

高效液相色譜分析儀（Agilent Technologies）

3.處理方法

（1）制備β-殼聚糖

將魷魚骨表面的組織殘留物清洗干凈后烘干，稱取20g魷魚骨置于一定濃度鹽酸中室溫下浸泡7h，洗凈至中性后置于1%的氫氧化鈉中90℃，水浴反應(yīng)2h進行脫蛋白，洗凈至中性烘干，即得β-甲殼素。稱取5gβ-甲殼素，用40%的氫氧化鈉95℃反應(yīng)6-8 h脫乙?；幚恚吹忙?殼聚糖。

（2）β-殼聚糖降解及分子量測定

稱取12g自制β-殼聚糖，溶解于400 ml濃度為2%的冰乙酸溶液（v/v），攪拌溶解直至獲得澄清、均質(zhì)的β-殼聚糖。將50ml溶解后的β-殼聚糖倒入100ml微波反應(yīng)器中，加入30%過氧化氫1.5-3mL，600W，70℃條件下500r/min，依次反應(yīng)5 min、10 min、20 min。反應(yīng)結(jié)束后，微波爐內(nèi)放置冷卻5～10 min，取出，加1mol/l氫氧化鈉中和，抽濾除去不溶物。濾液用3～4倍量無水乙醇充分沉淀，抽濾取濾液。最后檢驗產(chǎn)品是否溶于水。

將降解后的β-殼寡糖透析，冷凍干燥得到粉末狀殼寡糖樣品，分別將反應(yīng)5 min、10 min、20 min的樣品進行高相液相色譜分析。

（3）膽固醇吸附活性研究

①配制膽固醇膠束（PH=7.4，15mmol/L）

②用超聲波細胞粉碎機粉碎細胞。

③實驗設(shè)置實驗組和對照組，對照組分別是空白組和纖維素組，實驗組有5組，分別加入10、20、40、60、80mg的β-殼寡糖（分子量約為5000）。所有組均加入5ml膽固醇膠束。

④用振蕩培養(yǎng)箱恒溫振蕩（37℃）培養(yǎng)兩個小時，離心上清液，用膽固醇試劑盒測膽固醇吸附率。

三、結(jié)果

1.制備β-殼聚糖成品（圖2）

2.殼聚糖濃度與其膽固醇吸附能力的關(guān)系（表1）

四、結(jié)果分析

1.β-殼聚糖處理時間與分子量結(jié)果分析

隨著處理時間增長，波峰向右移動，根據(jù)公式，推算出分子量逐漸減小，得到結(jié)論：微波輔助過氧化氫降解時間越長，所得寡糖分子量越?。ū?）。

2.膽固醇吸附率結(jié)果分析（圖3）

不同劑量殼寡糖（分子量約為5000）對膽固醇的結(jié)合能力如圖所示，當(dāng)殼寡糖加入量小于40mg時，增大殼寡糖劑量，結(jié)合能力顯著提高。但當(dāng)殼寡糖加入量為40mg時，即使再增大殼寡糖劑量，結(jié)合能力也無顯著性差異，說明結(jié)合已達飽和。

同等濃度時，β-殼寡糖對膽固醇的結(jié)合能力遠大于纖維素，即使纖維素濃度為β-殼寡糖數(shù)倍，結(jié)合能力仍明顯不足。

五、實驗結(jié)論

結(jié)合上述分析及文獻資料，可以發(fā)現(xiàn)：

①微波輔助過氧化氫可降解β-殼聚糖，得到分子量小的β-殼寡糖。

②降解時間與所得β-殼寡糖分子量成反比。

③在一定濃度范圍內(nèi)，β-殼寡糖對膽固醇的吸附能力與濃度成正比。

④與纖維素相比，β-殼聚糖具有良好的膽固醇吸附能力。

六、前景及創(chuàng)新點

1.前景

本實驗研究了β-殼聚糖的降解與降解后的β-殼寡糖對膽固醇的吸附能力，為進一步研究提供了數(shù)據(jù)及方向。

魷魚骨是一種一直未被利用的生物資源，具有產(chǎn)量大，成本低的優(yōu)勢，因此具有廣闊的研究與利用前景。本實驗中只測定了分子量約5000的β-殼寡糖對膽固醇的吸附率，在進一步研究中，可以測定不同分子量的β-殼寡糖的吸附能力，找出最佳吸附分子量，并進行動物活體實驗，測定其具體的減肥功效及副作用，如條件允許，可以研發(fā)相關(guān)減肥藥物，在肥胖率居高的今天，健康的減肥藥物市場前景光明。同時，β-殼聚糖目前尚無工業(yè)化生產(chǎn)方法，只能人力清洗魷魚骨并在實驗室內(nèi)處理，進一步研究也可以探索β-殼聚糖的工業(yè)制備方法，為實際應(yīng)用時的大規(guī)模生產(chǎn)奠基。

2.創(chuàng)新點

（1）使用β-殼聚糖

目前國際研究以α-殼聚糖為主，而對β-殼聚糖的研究較少，因此研究β-殼聚糖得出的成果更具有創(chuàng)新性。

（2）研究膽固醇吸附率

過多攝入膽固醇可引起肥胖，通過研究β-殼寡糖對膽固醇的吸附，為進一步研究其對減肥的作用奠定基礎(chǔ)，開辟β-殼聚糖及β-殼寡糖的新應(yīng)用領(lǐng)域。

參考文獻：

[1]張萬瑞，丁純梅，李芳等.不同脫乙酰度殼聚糖對活性fm黑的吸附性能研究[J].安徽工程大學(xué)學(xué)報，2011，（03）：7-9.

[2]李巧霞，宋寶珍，仰振球.微波間歇法快速制備高粘均分子量和高脫乙酰度的殼聚糖[J].過程工程學(xué)報，2006，（05）：789-793.

[3]Jingna Liu，Jiali Zhang，Wenshui Xia.Hypocholesterolaemic effects of different chitosan samples in vitro and in vivo[J].Food Chemistry，2008，（107）：419-425.

[4]黃凱豐，時政，饒慶琳，楊永菊.辣椒籽吸附油脂和膽固醇的研究[J].北方園藝，2011，（11）：42-44.