快速線掃描拉曼成像技術(shù)在研究CaSki細(xì)胞凋亡過程中的應(yīng)用

張金亮, 馬 鑫, 徐夢(mèng)溪, 宗 鋮, 任 斌

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 固體表面物理化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廈門 361005)

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快速線掃描拉曼成像技術(shù)在研究CaSki細(xì)胞凋亡過程中的應(yīng)用

張金亮, 馬 鑫, 徐夢(mèng)溪, 宗 鋮, 任 斌

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 固體表面物理化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廈門 361005)

應(yīng)用快速線掃描拉曼成像技術(shù)研究了在抗腫瘤藥物順鉑誘導(dǎo)下宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞色素c、 蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等的時(shí)空變化規(guī)律. 結(jié)果表明, 細(xì)胞色素c與蛋白質(zhì)的相對(duì)拉曼峰強(qiáng)可以反映細(xì)胞凋亡程度. 與常用的表征細(xì)胞活性的噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法相比, 利用拉曼成像技術(shù)可以更靈敏地觀察到細(xì)胞凋亡早期生物活性分子的變化, 從而在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞凋亡過程, 為解析藥物與細(xì)胞的作用機(jī)制提供分子水平信息.

宮頸癌; 細(xì)胞色素c; 凋亡; 拉曼光譜; 拉曼成像; 噻唑藍(lán)法

癌細(xì)胞的凋亡是大量胞內(nèi)分子同時(shí)參與的復(fù)雜過程. 從單細(xì)胞水平上研究癌細(xì)胞在藥物作用下的凋亡過程將有助于認(rèn)識(shí)藥物與癌細(xì)胞作用機(jī)理, 對(duì)高效治療癌癥具有重要的科學(xué)意義. 但目前從單個(gè)活細(xì)胞和單分子水平上探究生命問題對(duì)于傳統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)手段仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn), 對(duì)癌細(xì)胞凋亡過程的分子動(dòng)態(tài)時(shí)空演變信息仍然了解甚少.

近年來(lái), 流式細(xì)胞術(shù)、 掃描探針顯微技術(shù)和熒光顯微術(shù)等單細(xì)胞技術(shù)發(fā)展較快, 其中流式細(xì)胞術(shù)可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞快速高通量的生物學(xué)分析, 獲得細(xì)胞的物理化學(xué)特性, 但缺乏空間分辨的信息[1～3]. 掃描探針顯微技術(shù)不僅可以研究單個(gè)細(xì)胞膜表面微結(jié)構(gòu)的形貌信息, 還可以對(duì)胞內(nèi)相關(guān)細(xì)胞器進(jìn)行分子水平上的操作, 但是會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)力, 影響細(xì)胞的正常生理功能[4]. 熒光顯微技術(shù)為在單細(xì)胞水平上研究細(xì)胞生物學(xué)過程提供了豐富的信息, 也是目前單細(xì)胞研究的主要方法, 但熒光技術(shù)需要借助外來(lái)標(biāo)記分子, 會(huì)對(duì)細(xì)胞的微環(huán)境以及被標(biāo)記分子的功能產(chǎn)生一定的干擾, 難以如實(shí)反映生物分子的本征信息, 特別是對(duì)一些重要的生物活性分子, 如小分子和脂類等尚難以進(jìn)行熒光標(biāo)記而不影響其生物學(xué)活性; 此外, 熒光峰通常較寬, 難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)多組分檢測(cè)[5～7]. 拉曼光譜技術(shù)不會(huì)發(fā)生生物分子光漂白, 適合長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活體樣品進(jìn)行檢測(cè); 無(wú)需標(biāo)記即可獲得體系的指紋特征, 排除了標(biāo)記分子對(duì)生物體系的干擾甚至破壞; 其光譜特征由分子自身振動(dòng)特征決定, 不易受外界干擾; 譜峰窄, 可以進(jìn)行多組分同時(shí)檢測(cè). 因此, 拉曼光譜能夠同時(shí)獲得整個(gè)細(xì)胞的光譜信息, 對(duì)研究細(xì)胞內(nèi)多種分子同時(shí)參與的凋亡過程具有顯著優(yōu)勢(shì).

宮頸癌是全球女性的第二大癌癥殺手, 根據(jù)其攜帶的人類乳頭瘤病毒的型號(hào), 宮頸癌細(xì)胞可分為HeLa, SiHa, C33A和CaSki等幾種[8～11]. 順鉑是常見的抗腫瘤藥物, 具有很好的抗腫瘤功效[12～15]. 目前認(rèn)為順鉑與癌細(xì)胞的作用機(jī)理主要有2種: 一種認(rèn)為順鉑與細(xì)胞核內(nèi)DNA的堿基形成絡(luò)合物, 阻止DNA的解旋、 復(fù)制等過程, 從而抑制癌細(xì)胞的增長(zhǎng)[16～18]; 另一種認(rèn)為順鉑可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧, 從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19～22].

本文選擇宮頸癌CaSki細(xì)胞作為研究的細(xì)胞系, 運(yùn)用快速線掃描拉曼成像技術(shù)對(duì)順鉑作用后的CaSki細(xì)胞的凋亡過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè). 通過拉曼成像分析對(duì)活細(xì)胞內(nèi)生物分子如細(xì)胞色素c、 蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)等的含量和分布進(jìn)行了分析, 從而獲得細(xì)胞凋亡過程的分子信息, 為順鉑抗腫瘤機(jī)理的研究提供分子水平信息.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gbcio公司); 鏈霉素、 青霉素、 噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(廈門鷺隆生物科技有限公司); 胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司); 胰蛋白酶(Trypsin, 美國(guó)Amersco公司)、 磷酸鹽緩沖溶(PBS, pH=7.2～7.4, 每升含NaCl 8.0 g, KCl 0.2 g, Na3HPO41.15 g, KH3PO40.2 g); 順鉑(上海阿拉丁試劑有限公司). 順鉑藥物采用DMEM培養(yǎng)基配制, 現(xiàn)配現(xiàn)用.

AE20型倒置顯微鏡(廈門MOTIC公司); DK-S22型電熱恒溫水槽(上海精宏設(shè)備有限公司); Sterilgard Ⅲ型生物安全柜(美國(guó)Baker公司), SCO6AD型氣套式CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Shellab公司); Raman-11快速共聚焦拉曼成像光譜儀(日本Nanophoton公司); EnSpire酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer公司).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞活性MTT實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系為宮頸癌CaSki細(xì)胞. 細(xì)胞培養(yǎng)基為含1%(體積分?jǐn)?shù))鏈霉素, 1%(體積分?jǐn)?shù))青霉素和10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基. 培養(yǎng)環(huán)境為含5%(體積分?jǐn)?shù))CO2和95%(體積分?jǐn)?shù))空氣的混合氣環(huán)境, 培養(yǎng)溫度為37 ℃.

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板將CaSki細(xì)胞的密度控制在105Cell/mL左右, 然后將細(xì)胞懸浮液種在96孔板中, 每孔種100 μL, 并設(shè)置調(diào)零孔和空白組. 種片24 h后, 分別加入0, 2, 4, 8, 10 mmol/L的順鉑溶液, 并作用24 h, 獲得順鉑對(duì)CaSki細(xì)胞的半抑制濃度(IC50).

將IC50濃度的順鉑溶液加入到96孔板中, 每孔加150 μL, 分別和細(xì)胞作用4, 8, 12, 16, 24, 48 h后加入5 mg/mL的MTT溶液各10 μL, 孵育4 h. 小心吸去上層溶液, 每孔加入150 μL DMSO溶液, 作用0.5 h后搖勻, 用酶標(biāo)儀測(cè)量孔板的吸光度, 激光波長(zhǎng)為490 nm.

1.3 細(xì)胞拉曼成像實(shí)驗(yàn)

將Caski細(xì)胞種片24 h后, 加入IC50濃度的順鉑溶液分別作用4, 8, 12, 16, 24, 48 h, 然后將細(xì)胞放到經(jīng)除菌處理過的蓋玻片上, 滴加PBS對(duì)細(xì)胞封片處理, 然后進(jìn)行拉曼成像. 該處理方法可以避免細(xì)胞暴露在外界環(huán)境下發(fā)生不可控變化, 保持細(xì)胞的正常生命活動(dòng), 從而在成像時(shí)間內(nèi)可以固定細(xì)胞的形貌, 避免發(fā)生顯著變化, 使檢測(cè)到的細(xì)胞信號(hào)變化可以如實(shí)反映順鉑與細(xì)胞的作用.

將532 nm激光束通過柱面鏡轉(zhuǎn)換為橢形光斑, 并經(jīng)過動(dòng)鏡掃描形成均勻的線光源, 再通過100倍油鏡[數(shù)值孔徑(NA)=1.4, Nikon公司, Type A型浸潤(rùn)油]照射在細(xì)胞上, 對(duì)應(yīng)成像寬度為80 μm. 結(jié)合動(dòng)鏡掃描, 獲得80 μm×20 μm細(xì)胞拉曼成像圖, 拉曼圖像中每個(gè)像素大小約為200 nm×200 nm. 每條線的曝光時(shí)間為10 s, 線激光功率為6 mW/像素. 選擇600 道光柵進(jìn)行分光, 對(duì)應(yīng)采譜范圍為580～3025 cm-1.

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞活性MTT實(shí)驗(yàn)分析

首先采用生物醫(yī)學(xué)中常用的MTT法來(lái)測(cè)算順鉑對(duì)CaSki細(xì)胞作用的IC50. 與不同濃度順鉑作用24 h后細(xì)胞的存活率如圖1所示. 可見, 細(xì)胞凋亡比例與順鉑藥物濃度呈良好的正相關(guān)性. 當(dāng)順鉑濃度為4 mmol/L時(shí), 細(xì)胞24 h的存活率降到50%左右, 該濃度即為順鉑作用于CaSki細(xì)胞的IC50值. 選擇4 mmol/L這一藥物濃度研究了順鉑對(duì)細(xì)胞作用不同時(shí)間后細(xì)胞的凋亡情況, 結(jié)果如圖2所示. 可見, 4 mmol/L的順鉑與CaSki細(xì)胞作用4 h和8 h后, 細(xì)胞存活率和無(wú)藥物的對(duì)照組基本一致, 說(shuō)明該時(shí)間范圍內(nèi)順鉑并沒有導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡. 而當(dāng)藥物作用12 h后, 細(xì)胞存活率降低到70%. 作用時(shí)間延長(zhǎng)到48 h后, 細(xì)胞的存活率低于20%. 采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性時(shí), 需要作用較長(zhǎng)時(shí)間才能反映出細(xì)胞的凋亡信息, 而且無(wú)法獲得細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)分子動(dòng)態(tài)變化信息.

Fig.1 Viability of CaSki cells after being treated with different concentrations of cisplatin for 24 h

Fig.2 Time-depended viability of CaSki cells after being treated with 4 mmol/L cisplatin

2.2 拉曼成像分析

Fig.3 Time depended bright field images(A1—F1) and Raman images using raman peaks of cytochrome c(750 cm-1)(A2—F2), protein(1660 cm-1)(A3—F3), and lipid(2852 cm-1)(A4—F4) of cells after being treated with 4 mmol/L cisplatin for 0 h(A1—A4), 4 h(B1—B4), 8 h(C1—C4), 12 h(D1—D4), 24 h(E1—E4) and 48 h(F1—F4)

2.2.1 細(xì)胞內(nèi)生物分子成像分析 根據(jù)上述MTT實(shí)驗(yàn), 選擇用4 mmol/L順鉑溶液來(lái)誘導(dǎo)CaSki細(xì)胞的凋亡. 待藥物和細(xì)胞作用不同時(shí)間后, 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察和拉曼成像, 結(jié)果如圖3所示. 可見, 當(dāng)順鉑與細(xì)胞作用時(shí)間短于12 h時(shí), 從細(xì)胞白光顯微圖像上觀察不到細(xì)胞形貌的明顯變化; 當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)到24 h后, 細(xì)胞發(fā)生皺縮, 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)消失, 表明細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生明顯凋亡, 如圖3(A1～F1)所示. 在顯微觀察時(shí)用拉曼光譜對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像, 圖3(A2～F2), (A3～F3), (A4～F4)分別是用代表細(xì)胞色素c(750 cm-1)、 蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶(1660 cm-1)和細(xì)胞內(nèi)飽和脂質(zhì)(2852 cm-1)[16,18,23,24]的特征拉曼峰強(qiáng)度作的拉曼顯微圖像. 可見, 在沒有順鉑作用下, 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞色素c含量較多, 呈顆粒狀分布, 表明細(xì)胞色素c分布在線粒體內(nèi), 而且細(xì)胞內(nèi)含有少量脂滴. 當(dāng)用順鉑作用4 h和8 h后, 細(xì)胞色素c的含量減少, 并呈云霧狀彌散分布, 表明細(xì)胞色素c開始從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)中. 作用時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng), 細(xì)胞色素c繼續(xù)減少, 48 h后完全消失. 脂質(zhì)的含量隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加, 脂滴逐漸增多. 拉曼光譜中1660 cm-1處的信號(hào)峰可歸屬于蛋白質(zhì)和脂質(zhì). 由于蛋白質(zhì)分布在整個(gè)細(xì)胞中, 而飽和脂類主要出現(xiàn)在脂滴部分, 因此觀察到1660和2852 cm-1處的峰在脂滴部分重合, 而在細(xì)胞其它部位沒有明顯重合的現(xiàn)象. 此外, 隨著順鉑作用時(shí)間的延長(zhǎng), 細(xì)胞內(nèi)非脂滴區(qū)域蛋白質(zhì)的成像結(jié)果沒有發(fā)生明顯變化, 說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量和分布基本穩(wěn)定. 因此在后面數(shù)據(jù)處理中皆以細(xì)胞內(nèi)非脂滴區(qū)域1660 cm-1處的峰強(qiáng)度作為內(nèi)標(biāo). 拉曼成像結(jié)果表明, 細(xì)胞在凋亡過程中, 細(xì)胞色素c會(huì)從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中, 被細(xì)胞內(nèi)活性氧氧化而信號(hào)強(qiáng)度減弱, 并逐漸消失. 細(xì)胞中的脂質(zhì)會(huì)在細(xì)胞凋亡過程中顯著增多, 這可能是由細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞中的脂質(zhì)受到活性氧作用發(fā)生團(tuán)聚所致[19].

Fig.4 Intensity of 750 and 1660 cm-1 peaks and ratio of I750/I1660 of the cells after being treated with 4 mmol/L cisplatin for different time

2.2.2 細(xì)胞色素c與蛋白質(zhì)拉曼信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度分析 在藥物與細(xì)胞作用不同時(shí)間的拉曼成像數(shù)據(jù)中, 蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶(1660 cm-1)的強(qiáng)度隨時(shí)間變化不大(圖4), 表明細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總量與個(gè)體差異不明顯, 而且在細(xì)胞凋亡過程中也不會(huì)發(fā)生明顯變化; 而歸屬于細(xì)胞色素c的750 cm-1處的峰則變化顯著. 因此選擇1660 cm-1處的峰作為內(nèi)標(biāo), 研究細(xì)胞與藥物作用后細(xì)胞色素c的含量變化. 實(shí)驗(yàn)中, 每個(gè)作用時(shí)間隨機(jī)選擇3個(gè)細(xì)胞作為平行樣品. 每個(gè)細(xì)胞隨機(jī)選取細(xì)胞質(zhì)中5個(gè)12×12像素的拉曼信號(hào)進(jìn)行分析. 數(shù)據(jù)選擇過程中注意避開脂滴聚集區(qū)域. 由圖4可見, 在沒有藥物作用條件下, 細(xì)胞中I750/I1660的比值較高, 說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞中的細(xì)胞色素c含量較高. 當(dāng)加入順鉑作用4 h 和8 h后,I750/I1660的比值顯著降低, 說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞色素c含量降低; 繼續(xù)延長(zhǎng)作用時(shí)間,I750/I1660的比值繼續(xù)減小; 作用48 h后該比值趨于零, 表明細(xì)胞色素c基本消失. 因此, 通過拉曼成像研究, 可以根據(jù)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素c的含量和分布, 靈敏地判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡, 以及凋亡的程度, 并且可以同時(shí)觀察細(xì)胞在凋亡過程中蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)等的動(dòng)態(tài)變化, 這對(duì)研究細(xì)胞的早期凋亡機(jī)制具有重要意義. 而常規(guī)MTT實(shí)驗(yàn)由于只能宏觀地評(píng)估細(xì)胞活性, 因此在藥物作用的短時(shí)間內(nèi), 無(wú)法通過MTT實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明藥物是否開始誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 因此, 拉曼成像法對(duì)研究單細(xì)胞凋亡過程具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì).

3 結(jié) 論

通過拉曼成像技術(shù)研究了順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中, 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)生物分子的含量變化與分布形態(tài). 拉曼成像結(jié)果表明, 宮頸癌CaSki細(xì)胞與順鉑作用后, 細(xì)胞色素c會(huì)從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中, 且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng), 細(xì)胞色素c的含量逐漸減少, 脂質(zhì)發(fā)生氧化和聚集, 驗(yàn)證了順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的藥物機(jī)制. 在順鉑與宮頸癌Caski細(xì)胞作用短時(shí)間后, 細(xì)胞色素c與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的拉曼信號(hào)強(qiáng)度比會(huì)減小, 因此將細(xì)胞色素c作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)記分子, 可以獲得細(xì)胞凋亡早期的分子變化信息. 傳統(tǒng)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)(MTT法)結(jié)果表明, 順鉑作用CaSki細(xì)胞24 h后的IC50值為4 mmol/L, 但順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡早期(8 h內(nèi)), 作用時(shí)間與存活率時(shí)間相關(guān)性較差. 與MTT法的結(jié)果相比, 拉曼成像在研究藥物與細(xì)胞作用過程中具有更高的時(shí)空分辨率, 可以更靈敏地反映細(xì)胞凋亡早期生物分子的變化規(guī)律, 為研究藥物與細(xì)胞的作用機(jī)制提供了分子水平上的信息.

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[24] Zheng J. W., Gu R. A., Lu T. H.,Chem.J.ChineseUniversities, 2002, 23(1), 42—45(鄭軍偉, 顧仁敖, 陸天虹. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2002, 23(1), 42—45

(Ed.: S, Z, M)

Study on Apoptosis Process of CaSkiviaFast Line-scanning Raman Imaging?

? Supported by the National Basic Research Program of China(No.2013CB933703).

ZHANG Jinliang, MA Xin, XU Mengxi, ZONG Cheng*, REN Bin*

(StateKeyLaboratoryofPhysicalChemistryofSolidSurfaces,CollegeofChemistryandChemicalEngineering,XiamenUniversity,Xiamen361005,China)

Cisplatin-induced apoptosis of CaSki cell was studiedviaRaman imaging technique. Fast line-scanning Raman imaging method could reveal the high temporal and spatial information of biomolecules including cytochrome c, protein and lipid during the apoptosis process. The results indicate that the relative intensity of cytochrome c to protein(I750/I1660) could reflect the stage of apoptosis. Compared with the traditional methylthiazoletetrazolium(MTT) method, Raman imaging could investigate the apoptosis of single living cell at a much higher temporal resolution and provide the molecular fingerprint information for revealing the cell-drug interaction.

Cervical cancer; Cytochrome c; Apoptosis; Raman spectroscopy; Raman imaging; Methylthiazoletetrazolium(MTT) method

2016-04-20.

日期: 2016-06-27.

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 2013CB933703)資助.

10.7503/cjcu20160265

O657.37; O644

A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 任 斌, 男, 博士, 教授, 主要從事拉曼光譜、 電化學(xué)和單細(xì)胞研究. E-mail: bren@xmu.edu.cn

宗 鋮, 男, 博士, 主要從事拉曼光譜、 電化學(xué)和單細(xì)胞研究. E-mail: czong@xmu.edu.cn