水稻二化螟和三化螟基因組ddRADseq文庫的構建

楊 瓊，孫 娜，鄭 敏，羅除成，羅光華*，方繼朝*

(1.江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所，南京210014；2.南京農業(yè)大學植物保護學院，南京210095)

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水稻二化螟和三化螟基因組ddRADseq文庫的構建

楊 瓊1*，孫 娜1, 2*，鄭 敏1，羅除成1，羅光華1**，方繼朝1**

(1.江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所，南京210014；2.南京農業(yè)大學植物保護學院，南京210095)

本文介紹了構建水稻二化螟和三化螟“雙酶切限制性酶切位點關聯(lián)DNA測序”(Double digest restriction-site associated DNA sequencing，ddRADseq)文庫的方法。利用安捷倫2100生物分析儀對4種單酶切及2種雙酶切的酶切產物片段大小及分布范圍進行分析，篩選出MluC I和NlaIII兩種限制性內切酶組合對螟蟲基因組DNA進行酶切。酶切后的DNA片段兩端連接上特定的P1、P2接頭后，用Pippin Prep回收大小為285-435 bp的DNA片段。通過PCR擴增進行文庫的富集并引入index序列。構建好的ddRADseq文庫用瓊脂糖凝膠電泳和生物分析儀進行質量檢測。本方法所構建的文庫DNA片段長度、分布和摩爾濃度能夠達到Illumina平臺測序的技術要求。本研究證實了利用MluC I和NlaIII組合酶切構建水稻螟蟲基因組ddRADseq文庫的可行性，為在水稻螟蟲中利用ddRADseq技術開展生物地理學、種群遺傳學和系統(tǒng)發(fā)育重建等方面的研究奠定基礎。

基因組DNA文庫；ddRADseq；生物分析儀；水稻螟蟲

二化螟Chilosuppressalis(Walker) 和三化螟Scirpophagaincertulas(Walker) 是我國水稻上的重要鉆蛀性害蟲，危害范圍廣，可造成重大的經濟損失(盛承發(fā)等，2003)。目前，對二化螟和三化螟的防治主要依賴化學農藥，但化學農藥的長期及大量使用使它們產生了明顯的抗藥性，并且造成農藥殘留和環(huán)境污染(吳孔明等，2009)。因此，迫切需要開發(fā)出更高效環(huán)保的治螟技術與方法。

1.事前管理不到位，造成稅款流失。簡政放權后，有很多稅務事項取消行政審批，不需進行事前調查。同時，對稅務機關進戶執(zhí)法進行了規(guī)范，稅務人員進戶檢查的次數相對減少，這就有可能導致難以第一時間發(fā)現(xiàn)納稅人的違法行為。如納稅人領用10萬元以下增值稅專用發(fā)票，不需要稅務人員做事前實地查驗，有的納稅人趁機虛開發(fā)票后走逃。又如出口退稅無紙化后，則很難對電子數據進行保存和核查取證，企業(yè)出現(xiàn)違規(guī)退稅、騙稅，難以追責，造成稅款流失。

害蟲一般都具有很強的環(huán)境適應性。種群具有高適應性是基于其內在豐富的遺傳多樣性。研究害蟲種群的遺傳多樣性，一方面是探索害蟲種群遺傳分化的機制，另一方面則是尋找治理害蟲新策略的突破口(韓海斌等，2013；周宇等，2013)。種群遺傳多樣性研究是基于各種分子標記開展的，如微衛(wèi)星、線粒體DNA基因(CO I，CO II)、轉座子等(Mengetal.，2008)。隨著科技的進步與技術的發(fā)展，基于二代測序技術的簡化基因組測序技術為種群遺傳學研究提供了更豐富而準確的分析數據(翟正曉，2014；魏書軍等，2016)。在各種簡化基因組測序技術中，發(fā)展最快且應用最廣泛的是限制性酶切位點關聯(lián)DNA測序技術(Restriction-site associated DNA sequencing，RADseq)。該技術體系具有通量較高、成本偏低、試驗周期較短并且無需參考基因組等優(yōu)點(Petersonetal.，2012)。經過不斷發(fā)展，RADseq技術已經有了多種版本，如mbRAD、ddRAD、2bRAD、ezRAD、nextRAD等，能滿足多種不同的試驗設計與要求(Andrewsetal.，2016)。其中，雙酶切限制性酶切位點關聯(lián)DNA測序(Double digest restriction-site associated DNA sequencing，ddRADseq)技術具有成本低、SNPs位點數量多且準確等優(yōu)勢，故很多研究利用該技術方案開展相關的研究(Willingetal.，2011; Petersonetal., 2012)。

ddRADseq的技術特點是利用2種限制性內切酶組合對基因組DNA進行雙酶切構建基因組DNA測序文庫。該技術能夠大幅度降低基因組復雜度，快速獲得每個樣本的基因型，在整個基因組范圍內鑒定出高密度的SNP位點，可以用于構建未知基因組序列生物的高密度遺傳連鎖圖譜，QTL定位、尋找DNA多態(tài)性和群體進化研究(王冠杰等，2012；王瑩，2014)。該技術策略可以高效、準確、低成本的確定生物的基因型，是一種非常實用的研究方法，在復雜基因組研究領域具有廣泛地應用前景(王洋坤等，2014)。

事業(yè)漸漸做得大了起來，忙忙碌碌的、馬不停，張雪松總是覺得，在潛意識中還有那么一件事情沒有做，但是是什么呢？有一年，初秋將至，老張忽然想吃媽媽親手做的美食。而那些幼時的玩伴，是否和他一樣，總是能想起兒時記憶中的香氣。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

從安徽和縣水稻田采集的二化螟和從江西瑞昌水稻田采集三化螟，經饑餓處理后單頭蟲體浸泡在95%乙醇中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

課程對指標點達成度=權重系數×樣本中與該畢業(yè)要求指標點對應課程的相關試題平均分/樣本中與該畢業(yè)要求指標點對應課程的相關試題滿分。

1.2.6 PCR富集和index序列引入

今年以來，我國經濟運行總體平穩(wěn)，穩(wěn)中有進，國民經濟長期向好的態(tài)勢沒有改變。但影響全球經濟穩(wěn)定的不確定因素仍然較多，出口仍面臨不少挑戰(zhàn)和壓力。要致力于提高產品質量，不斷推出創(chuàng)新款式，在抓出口機遇的同時，培育和搶占新興市場。

構建ddRADseq文庫的主要步驟：①基因組DNA的提??；②限制性內切酶的篩選；③基因組DNA雙酶切反應；④酶切后的DNA片段兩端連接含barcode的P1和P2接頭；⑤Pippin Prep全自動核酸片段回收儀回收目的DNA片段；⑥PCR擴增對文庫進行富集。

1.2.1 基因組DNA的提取

2.3 DNA文庫的瓊脂糖凝膠電泳和Bioanalyzer檢測分析

1.2.2 限制性內切酶的篩選

大都市區(qū)進行綜合交通體系規(guī)劃建設，包括核心層級和輔助層級，區(qū)域通過打造三個交通核心點、十一條交通主道次級中心的布局結構，形成多樣式、多層次的混合聯(lián)運交通運輸體系。其中十一條主道次級中心就有奉新交通次級樞紐，在即將并網形成的高速公路網格局中，有重要的東鄉(xiāng)-昌傅-奉新高速。后期將新建奉新基地通用機場。

選擇合適的限制性內切酶是構建文庫的關鍵步驟。不僅要保證產生的RAD標記能夠在基因組上均勻分布，同時所獲得的RAD標記數量能夠覆蓋一定比例的基因組，這樣才可以用于后續(xù)的SNP檢測和個體及種群的遺傳分化分析。RAD位點即一段相鄰于某一個或者一組限制性內切酶酶切位點的DNA片段(Petersonetal.，2012)。本研究用安捷倫Bioanalyzer 2100芯片分析系統(tǒng)(Agilent公司，美國)分析不同限制性內切酶組合產生的DNA片段的數量、摩爾濃度以及在整個基因組的分布。本研究選用了MluC I(4 bp site, 0% G/C)、NlaIII(4 bp site, 50% G/C)、EcoR I(6 bp site, 33% G/C)、SphI(6 bp site, 66% G/C)(NEB公司，美國)4種內切酶，他們都能在NEB Buffer中保持完全的活性，并且可以組合進行雙酶切。使用50 μL的酶切體系，反應體系配制如下：10×CutSmart Buffer 5 μL，限制性內切酶 1 μL(單酶切)/2 μL(雙酶切)，gDNA 120 ng，最后ddH2O補齊至50 μL(表1)。按照表1配制酶切反應體系，充分混勻后，短暫離心，于37℃孵育3 h。酶切反應結束后，用1.5×AMPure XP beads濃縮、純化，最終用40 μL ddH2O溶解DNA于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 限制性內切酶酶切反應體系

Table 1 Reaction system of restriction enzyme

酶切類型TypesBuffer種類Typesofbuffer內切酶Enzyme反應體系(50μL)Reactionsystem單酶切CutSmartbufferMluCIDNA+H2O：35μLCutSmartbufferNlaIII Buffer：5μLEcoRIbufferEcoRI 酶：1μL21SphI H2O：9μL雙酶切21EcoRI&SphIDNA+H2O：35μLCutSmartbufferMluCI&NlaIII Buffer：5μL 酶：2μL H2O：8μL

用Qubit測定酶切純化產物的DNA濃度后用安捷倫2100生物分析儀進行檢測。芯片的使用參照High Sensitivity DNA Chips試劑盒說明進行。酶切產物用生物分析儀檢測后，經計算分析，最終確定選擇MluC I和NlaIII進行基因組DNA的酶切。

1.2.3 基因組DNA的雙酶切反應

隨著信息技術的發(fā)展，企業(yè)在經濟生產活動中產生了大量的數據，會計信息化管理能夠節(jié)約會計人員工作時間，提高會計工作效率。面對日益激烈的市場競爭環(huán)境，建立會計信息化管理模式成為企業(yè)發(fā)展的必然選擇。企業(yè)要不斷完善會計管理制度，優(yōu)化部門分工結構，提升會計工作水平。

直接選用NlaIII和MluC I雙酶切組合進行后續(xù)試驗。提取好的gDNA，用Qubit測定各樣本gDNA的濃度，隨后計算每個樣本酶切反應所需的gDNA量。利用限制性內切酶NlaIII和MluC I對每個樣本gDNA進行雙酶切，反應體系及酶切方法同上。酶切后的DNA利用1.5×AMPure XP Beads進行純化并于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 酶切產物的接頭連接

酶切純化后的DNA經Qubit測定濃度后，用T4 DNA連接酶(NEB)連接P1、P2接頭。連接反應體系如下：DNA(35 ng)+ ddH2O 35 μL，T4 DNA Ligase Buffer 4.5 μL，T4 DNA Ligase 0.55 μL，P1接頭2 μL，P2接頭2 μL，最后用ddH2O補齊至45 μL。將以上反應體系置于16℃ PCR儀中過夜孵育。過夜孵育結束后，65℃孵育10 min，再以每90 s退火2℃的速度循環(huán)22次，最后的連接產物用1.5×AMPure XP Beads純化，再用Qubit檢測連接反應后DNA的濃度。純化后的連接產物于于4℃保存?zhèn)溆谩＿B接反應后，每個樣本都連接上可以用于區(qū)分個體的獨一無二的Barcode組合，將一定數量個體的酶切DNA合并至一個文庫。

11 劉譯：...and that their understanding of the Way is similar.[4]38

利用限制性內切酶MluC I和NlaIII對二化螟和三化螟個體的基因組DNA進行雙酶切后，用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切后的基因組DNA呈現(xiàn)為一條彌散的條帶，大部分片段集中于200-400 bp之間(圖1)。

1.2.5 目標DNA片段的收集

利用Pippin Prep全自動核酸電泳和片段回收系統(tǒng)(sage science公司，美國)收集目標片段?；厥障到y(tǒng)的使用參照說明書進行。本文庫需要收集大小在285-435 bp(含85 bp接頭)的DNA片段，收集后的DNA產物再用Qubit測定濃度。

1.2 雙酶切方法構建水稻螟蟲基因組ddRADseq文庫

經過片段大小選擇、回收后的DNA作為模板，利用含Illumina測序平臺對應的引物(10uM)Primer F(5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA CACTCTTTCCCTACACGACG 3′)和Primer R(5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGG ACGTGTGC3′)進行PCR擴增，將兩端連有P1和P2接頭的目的片段進行富集，同時引入index序列(下劃線部分所示)。如研究需要構建多個文庫，可以設計多條含有不同6 bp 長度的index序列的反向引物進行PCR擴增，測序完成后根據每個文庫特定的index序列來區(qū)分不同的文庫。Index和Barcode的使用增加了每個測序孔中樣本的數量，降低了試驗成本。10 μL PCR擴增體系為：PCR phusion 2X master mix 5 μL，PCR Illumina primer F(10 uM)2 μL， PCR Illumina primer R(10 uM)2 μL，DNA 1 μL。反應條件為：98℃預變性30 s；98℃ 10 s，65℃ 30 s，98℃ 45 s，12個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。最終用于Illumina平臺測序的gDNA文庫使用Qubit和生物分析儀進行檢測分析。

靈隱寺主要以天王殿、大雄寶殿、藥師殿、直指堂（法堂）、華嚴殿為中軸線，兩邊附以五百羅漢堂、濟公殿、聯(lián)燈閣、華嚴閣、大悲樓、方丈樓等建筑所構成，共占地130畝，殿宇恢宏，建構有序。靈隱寺自創(chuàng)建以來，高僧云集，文人薈萃，儒釋交融，談禪論道，一吟一詠早已蔚為大觀。此外，寺內還存有不少年代久遠的佛像、法器、經幢、石塔、御碑、字畫等歷史文物，為靈隱寺珍貴的佛教文化遺產。

2 結果與分析

2.1 酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測

4.1.3 全面業(yè)務分析、跨條線數據整合分析、統(tǒng)一平臺、升華管理及業(yè)務效率和質量，全面展現(xiàn)智慧水務效用

圖1 二化螟基因組DNA雙酶切后電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of gDNA double digestion products of Chilo suppressalisM,DNA Ladder；L,gDNA酶切產物。M, DNA Ladder; L, gDNA digestion products of C.suppressalis.

2.2 限制性內切酶選擇的Bioanalyzer分析

躁狂是情感障礙疾病中較為常見的一種,該病的臨床主要表現(xiàn)為思維奔逸、情感高漲和意志行為增強。利培酮是治療精神性疾病的一種非典型性藥物,其可作為一種受體阻斷劑作用于多種腦神經傳遞質,遵循躁狂癥的發(fā)病機理原則治療躁狂癥。利培酮具有依從性較好、服用方便、起效快等特點。

分別使用MluC I、NlaIII、EcoR I、SphI單酶切及MluC I-NlaIII、EcoR I-SphI的雙酶切酶切組合對二化螟和三化螟的gDNA進行酶切，酶切產物安捷倫2100生物分析儀進行檢測，結果分析如圖2。MluC I(50-3000 bp)、NlaIII(500-3000 bp)、EcoR I(1000-7000 bp)、SphI(2000-7000 bp)4種酶的單酶切和EcoR I-SphI(2000-8000 bp)雙酶切組合產生的DNA片段大小及分布均不符合Illumina測序平臺(PE125)和后續(xù)實驗目的要求。MluC I和NlaIII均為4堿基內切酶，切割底物的頻率更快，MluC I-NlaIII組合酶切產生的DNA片段大小主要分布在100-300 bp，完全滿足后續(xù)實驗對RAD tag的要求。將MluC I和NlaIII單酶切、雙酶切的Bioanalyzer數據結合二化螟和三化螟基因組大小進行計算，得到MluC I和NlaIII雙酶切產生的DNA片段在各種大小范圍內的數量(表2)。因Illumina測序平臺(PE125)的讀長是125 bp，所以選擇的DNA片段大小原則上應≥ 250 bp，但計算后發(fā)現(xiàn)，如全部舍棄250 bp以下的片段，將會導致丟失大部分RAD位點。因此決定選擇200-350 bp的范圍，在這個范圍內，二化螟共有397060個DNA片段，三化螟有344973個DNA片段(表2)。

表2MluC I和NlaIII雙酶切產物的Bioanayzer分析

Table 2 Bioanalyzer analysis of bothMluC I andNlaIII digestion products

片段范圍(bp)Sizeregion二化螟DNA片段數CsuppressalisfragmentNo三化螟DNA片段數SincertulasfragmentNo50-100668652504066100-150603697527641150-200368637326780200-250203037183091250-300123934103540300-3507008958342350-4005057833681

利用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒(Qiagen公司，德國)單頭提取試蟲的gDNA，提取方法參照試劑盒說明書。取單頭蟲體置于吸水紙上，使其表面徹底晾干，經液氮速凍后迅速研磨蟲體，然后按照試劑盒的使用說明進行操作。gDNA經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和Qubit?3.0型熒光計(Invitrogen公司，美國)測定濃度和純度后保存于-20℃冰箱。

利用Qubit檢測構建的ddRAD文庫的濃度，然后用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳和生物分析儀進行檢測分析(圖3)。從圖3中可以看出，2.5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜和生物分析儀電泳圖譜較為一致，DNA片段均集中在330-480 bp，表明成功構建了二化螟和三化螟的目標基因組DNA文庫，可以在Illumina測序儀上進行測序。

訪山東倍豐鹽湖農業(yè)科技有限公司董事長焦坤告訴記者，這次合作是資源與網絡的完美結合，是品牌與渠道的雙向聯(lián)合，是貿易與實體的相互補充，是廠商合作的典范，更是山東倍豐轉型升級的全新力作。

圖2 各種酶切產物的Bioanalyzer分析Fig.2 Bioanalyzer analysis of various combinations of restriction enzymesA，DNA Ladder；B，二化螟gDNA酶切；C，三化螟gDNA酶切。A, DNA Ladder; B, digestion of C. suppressalis gDNA; C, digestion of S. incertulas gDNA.

圖3 基因組DNA文庫的瓊脂糖凝膠電泳和Bioanalyzer分析Fig.3 Analysis of agarose gel electrophoresis and Bioanalyzer for gDNA libraryA，基因組ddRADseq文庫瓊脂糖凝膠電泳分析；B，基因組DNA文庫Bioanalyzer分析。M為DNA Ladder，L1為二化螟基因組ddRADseq文庫，L2為三化螟基因組ddRADseq文庫。A, Electrophoresis analysis of ddRADseq library; B, Bioanalyzer analysis of ddRADseq library. M, DNA Ladder; L1, ddRADseq library of C. suppressalis; L2, ddRADseq library of S. incertulas.

3 結論與討論

二化螟和三化螟作為水稻上的重要害蟲，一直受到關注，其遺傳多樣性研究也是害蟲綜合治理的重要研究內容之一。本研究利用篩選出2種高頻率限制性內切酶并對二化螟和三化螟基因組DNA進行酶切，成功構建ddRADseq文庫，為深入開展其種群遺傳學研究奠定了重要基礎。

隨著二代測序技術的發(fā)展，各類簡化基因組測序技術迅速發(fā)展起來，這為種群遺傳學帶來了極大的便利。RADseq技術是基于全基因組酶切位點的簡化基因組測序技術，最早應用于三刺魚的生態(tài)特性遺傳學研究(Daveyetal.，2010)。早期的RAD文庫制備過程通常包含酶切、連接P1接頭、物理打斷、末端修復、連接P2接頭、片段選擇等幾個步驟，物理打斷和瓊脂糖凝膠電泳進行片段選擇的過程可能會造成DNA的損傷及損失。而ddRADseq技術(Petersonetal.，2012)中2種限制性內切酶的目的性更強，免去了隨機打斷的過程，結合Pippin Prep全自動核酸電泳和片段回收系統(tǒng)精確的片段選擇技術，從而對DNA文庫的篩選更嚴格。兩種限制性內切酶的組合使用和嚴格的片段選擇不僅降低了基因組的復雜度，而且簡化了文庫的制備過程(Busetal.，2012; Pukketal.，2015)。

生物分析儀是基于生物芯片技術的核酸分析系統(tǒng)，在基因差異表達研究中具有重要的應用價值。與傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳相比，生物分析儀可以更簡便、精確、直觀地對DNA片段的大小、分布范圍以及摩爾濃度進行定量分析，可以清晰地顯示短至50 bp的DNA條帶和低至0.02 ng的DNA片段，靈敏度更高。檢測僅需1 μL的實驗樣本，克服了傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳的局限性。在DNA、RNA、蛋白質和細胞樣品的分析中都發(fā)揮了重要的作用(劉翠華等，2002)。該核酸分析系統(tǒng)在制備本研究所涉及的基因組ddRADseq文庫過程中起到重要的作用。

目前，尚無關于構建二化螟和三化螟基因組文庫的報道。本研究證實了用雙酶切方法構建水稻螟蟲基因組ddRADseq文庫的可行性。由于RADseq數據的分析不需要參考基因組序列就可以產生大量的SNP標記，結合傳統(tǒng)的形態(tài)學、生理學、生態(tài)學等方法，該技術可以廣泛地應用于模式生物和非模式生物的種群遺傳學、系統(tǒng)發(fā)生生物地理學、系統(tǒng)發(fā)育、物種界定、遺傳圖譜構建等諸多領域的研究，也將在昆蟲學研究中發(fā)揮重要的作用(Houstonetal.，2012; 魏書軍等，2016)。相比RADseq技術，ddRADseq技術大大簡化了實驗流程，但同時也存在著多次選酶、使用儀器復雜等缺點，Pukk等(2015)人開發(fā)出一種被子植物通用的雙酶切簡化基因組(Modified ddRAD，MiddRAD)二代測序文庫構建方法，免去了多次選酶、定量、純化產物等步驟，優(yōu)化了復雜的建庫儀器，降低了實驗成本。隨著技術的不斷優(yōu)化，ddRADseq技術將成為昆蟲遺傳學研究的重要手段，也將在其它研究領域中發(fā)揮更大的應用價值。

在進一步深化大學英語教學改革的熱潮下，面對本科辦學歷史較短、辦學經驗不足、辦學條件也較有限的辦學實情，新升格本科院校的藝體類本科大學英語教學改革所面臨的壓力和挑戰(zhàn)可想而知。但是，只要切實結合自身的辦學實情，嚴格遵循“分類指導、因材施教”、“動態(tài)分層”、“課程教學漸進性、持續(xù)性和靈活性”等原則，將分類分層教學模式與課程階段遞進式教學模式、必修課程和選修課程有機結合，勇于實踐和創(chuàng)新，新升格本科院校就一定能開辟出一條獨特的藝體類本科大學英語教學之路，培養(yǎng)出新時期國家和社會所需要的藝體類復合型人才。

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式中SOC儲為某一深度下的土壤有機碳儲量，t/hm2；Ti為第i層的土壤有機碳含量，g/kg；ri為第i層的土壤容重，g/cm3；Hi為第i層的土壤厚度，cm；n為土壤層次。

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Construction of genomic ddRADseq libraries ofChilosuppressalisandScirpophagaincertulas(Lepidoptera: Pyralidae)

YANG Qiong1*, SUN Na1, 2*, ZHENG Min1, LUO Chu-Cheng1, LUO Guang-Hua1**, FANG Ji-Chao1**

(1. Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 2100140, China; 2. College of Plant Protection, Nanjing Agriculture University, Nanjing 2100950, China)

We introduce a method of using two frequent cutter enzymes to construct restriction-site associated DNA sequencing (ddRADseq) libraries forChilosuppressalisandScirpophagaincertulas(Lepidoptera: Pyralidae). The fragment size distribution generated by a given pair of restriction endonucleases was estimated using Agilent 2100 Bioanalyzer. Based on Bioanalyzer analysis, we chose two frequent cutter enzymes (MluC I andNlaIII) for genomic DNA digestion. Each individual of stem borers was labelled with a unique combination of P1 and P2 barcodes. Size selection of adapter-ligated DNA fragments between 285-435 bp was performed using a Pippin Prep. Finally, size selected DNA was used as a template in PCR amplification. PCR primers will add a unique index sequence to all DNA fragments in the PCR reaction. Evaluation of the final libraries was performed using both routine agarose gel electrophoresis and Bioanalyzer. Both assessments showed that the molarity and fragment size distribution were appropriate for Illumina sequencing. This method confirms the feasibility of using a combination of restriction enzymes (MluC I andNlaIII) to construct the genomic ddRADseq libraries for the stem borers, which lays an important foundation for investigation into biogeography, population genetics and phylogenetics on rice stem borers.

gDNA library；ddRADseq；bioanalyzer；rice stem borer

國家水稻產業(yè)技術體系項目(CARS-01-25)；江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(16)1001)；江蘇省農業(yè)科學院院基金項目(6111606)

Received：2016-10-24；接受日期 Accepted：2016-11-08

Q963; S433

A

1674-0858(2016)06-1114-07

*共同第一作者簡介：楊瓊，博士，副研究員，研究方向為水稻蟲害綜合治理；孫娜，碩士研究生，研究方向為水稻蟲害防控。