利用定量ＰＣＲ方法檢測(cè)鹽、磷對(duì)菌根真菌侵染紫云英的影響

周艷菲 林會(huì) 趙斌

摘要：建立了菌根真菌（ＡＭF）的ＤＮＡ含量和ＴＢ染色所觀察的侵染率之間的相關(guān)性曲線。將熒光定量ＰＣＲ技術(shù)運(yùn)用到ＡＭＦ對(duì)植物紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．）的侵染率檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)了混合侵染條件下對(duì)菌根中ＡＭＦ的種類和侵染率同時(shí)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。在盆栽實(shí)驗(yàn)中，利用所建立的方法檢測(cè)了不同鹽、磷濃度及交互作用對(duì)ＡＭＦ侵染紫云英的影響，結(jié)果表明，不同磷濃度下，鹽濃度的增加對(duì)Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ侵染率的影響不同。Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在混合接種中占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。從ＡＭＦ對(duì)紫云英的促生效果上看，ＡＭＦ侵染率的增加提高了紫云英的抗鹽脅迫能力，促進(jìn)了植物生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：定量ＰＣＲ；菌根真菌（ＡＭF）；紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．）；鹽脅迫；磷

中圖分類號(hào)：Ｑ９３９．５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）15－3193-05

Ｕｓｉｎｇ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ａｎｄ Ｓａｌｔ ｏｎ ｔｈｅ

Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭ Ｆｕｎｇｕｓ ｔｏ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ.

ＺＨＯＵ Ｙａｎ－ｆｅｉ，ＬＩＮ Ｈｕｉ，ＺＨＡＯ Ｂｉｎ

（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍ were established ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ＴＢ ｓｔａｉｎ ｍｅｔｈｏｄ. Tｈｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ was ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ＡＭF ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ mixture ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｌｉａｂｌｙ． Ｉｔ ｃould ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉａｌ ｔａｘａ ｏｆ ＡＭＦ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｓｏｉｌｓ ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ ｂｙ ｓｅｖｅｒａｌ ｔａｘａ． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｓａｌｔ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｏｎ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭ ｆｕｎｇａｌ ｔｏ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ， which was ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｗｉｔｈ ａ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｗａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ， ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓe ｏｆ ｓａｌｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ ａｎｄ Ｇ. ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ ｔｏ ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔｓ． Ｗｈｉｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｘ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ， ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｕｓｕａｌｌｙ ｄｏｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｑＰＣＲ； ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ ｆｕｎｇｉ； Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．； ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ； ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ

目前全世界已有８億ｈｍ２的土地出現(xiàn)鹽漬化［１］，嚴(yán)重影響了土地資源的利用，鹽脅迫造成的低水勢(shì)、Ｎａ＋毒害作用和營養(yǎng)元素分布不均衡，可使植物減產(chǎn)甚至不生長(zhǎng)［２］。菌根真菌（ＡＭＦ）作為一類可以與地球上８０％的陸生植物共生的古老微生物［３］，能促進(jìn)植物對(duì)土壤中Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｐ等礦質(zhì)元素的吸收，調(diào)節(jié)宿主植物的代謝活動(dòng)［４］，提高宿主植物抗重金屬、抗旱和抗鹽脅迫能力。鹽對(duì)菌根的影響主要表現(xiàn)在減少孢子數(shù)量和抑制菌絲生長(zhǎng)［５］，減少其再次侵染宿主的機(jī)會(huì)，降低菌根侵染率。盡管存在這種抑制作用，仍有大量研究結(jié)果表明ＡＭＦ可以提高宿主抗鹽脅迫能力，不同ＡＭＦ抗鹽脅迫的能力不一樣，對(duì)植物生長(zhǎng)的促生效果也不同［６］。

在生態(tài)系統(tǒng)中，同一宿主植物能被多種ＡＭＦ同時(shí)侵染，利用傳統(tǒng)的ＴＢ染色和形態(tài)學(xué)觀察方法難以對(duì)菌根中不同的ＡＭＦ進(jìn)行區(qū)分［７，８］。而分子生物學(xué)方法可用于檢測(cè)混合侵染的菌根中ＡＭＦ的組成［９］。實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ技術(shù)可以準(zhǔn)確測(cè)定樣品中特定基因的拷貝數(shù)。Ａｌｋａｎ等［１０，11］對(duì)Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ設(shè)計(jì)特異性引物，使用熒光定量ＰＣＲ方法第一次對(duì)單接種條件下菌根中ｒＤＮＡ進(jìn)行了絕對(duì)定量，研究表明菌根總侵染率（包含菌絲、叢枝、泡囊）和熒光定量ＰＣＲ測(cè)得的結(jié)果之間具有相關(guān)性，相關(guān)性程度大小與宿主植物聯(lián)系緊密。隨后，進(jìn)一步將該方法應(yīng)用在雙接種研究中，分別檢測(cè)Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在不同處理時(shí)的侵染率變化，發(fā)現(xiàn)不同處理下Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在苜蓿中都占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。Ｇａｍｐｅｒ等［１2］運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量的方法對(duì)５種ＡＭＦ進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)孢子數(shù)量和定量ＰＣＲ檢測(cè)的結(jié)果之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，定量ＰＣＲ方法的可行性取決于具體的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，這種方法是研究生態(tài)系統(tǒng)中特定的ＡＭＦ總核酸量的有效方法。

本研究探討單接種條件下Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ用定量ＰＣＲ方法檢測(cè)的結(jié)果與ＴＢ染色觀察結(jié)果之間的相關(guān)性，建立了定量ＰＣＲ方法檢測(cè)混合接種條件下各種ＡＭＦ侵染率的方法。在此基礎(chǔ)上以紫云英為宿主植物，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ為試驗(yàn)菌種，設(shè)置鹽和磷交互作用的盆栽實(shí)驗(yàn)，定量ＰＣＲ方法檢測(cè)了鹽、磷交互作用下兩種ＡＭＦ侵染紫云英的變化，比較單接種和雙接種條件下每種ＡＭＦ侵染的變化。

１材料與方法

１．１實(shí)驗(yàn)材料

供試植物：紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．），種子消毒、催芽方法參考Ｐｅｎｇ等［８］的實(shí)驗(yàn)方法。

供試真菌：Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ。原始菌種由北京農(nóng)林科學(xué)院提供，以此進(jìn)行擴(kuò)繁，將ＡＭＦ侵染紫云英６個(gè)月的混合物作為接種劑，其中含有被感染的植物根段、ＡＭＦ菌絲、孢子和盆栽土壤混合物。

供試土壤：采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)田，土壤經(jīng)自然風(fēng)干后磨碎并過２ ｍｍ的篩網(wǎng)，將河沙洗凈曬干后與土２∶１（Ｖ／Ｖ）混合均勻，１２１ ℃間歇滅菌３次。土壤理化性質(zhì)：ｐＨ ６．５９，電導(dǎo)率為７３．６ μＳ／ｃｍ，速效磷含量為１１．８３ ｍｇ／ｋｇ。

１．２實(shí)驗(yàn)方法

１．２．１定量ＰＣＲ方法的應(yīng)用用粗提法提取紫云英ＤＮＡ［８］，利用嵌套ＰＣＲ方法獲取紫云英ＬＲ１－ＮＤＬ２２區(qū)段間的序列［４］。將獲得的序列在ＮＣＢＩ上進(jìn)行比對(duì)（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ），分別設(shè)計(jì)上述３個(gè)物種的特異性引物并用普通ＰＣＲ進(jìn)行驗(yàn)證，ＰＣＲ反應(yīng)程序參考Ｐｅｎｇ等［8］的方法。

分別提?。牵?ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅ、Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ和紫云英的ＤＮＡ，測(cè)定濃度后，利用熒光定量ＰＣＲ技術(shù)分別建立兩種ＡＭＦ孢子、紫云英ＤＮＡ濃度和ＣＴ值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)ＡＭＦ引物的特異性和敏感性，將ＡＭＦ的孢子ＤＮＡ做梯度稀釋，分別與一定量的紫云英ＤＮＡ混合，建立混合體系中ＡＭＦ孢子ＤＮＡ的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在此基礎(chǔ)上，制備一系列不同侵染率根樣［１０］，提取ＤＮＡ，用熒光定量ＰＣＲ進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算不同侵染率下ＣＤＮＡ（ＡＭＦ）／ＣＤＮＡ（plant）與ＴＢ染色顯微觀察的侵染率之間的相關(guān)性。

熒光定量ＰＣＲ采用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ公司）試劑，反應(yīng)體系：２０ μＬ體系中含有１０ μＬ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｋｉｔ， ０．５ μｍｏｌ上、下游引物，２．０ μＬ ＤＮＡ模板，補(bǔ)水至２０ μＬ。反應(yīng)在ＡＢＩ７３００熒光定量ＰＣＲ儀進(jìn)行，ＰＣＲ反應(yīng)程序：９５ ℃（２０ ｓ）、９５ ℃（２０ ｓ）、６０ ℃（２０ ｓ）、７２ ℃（３０ ｓ），進(jìn)行４０個(gè)循環(huán)；然后進(jìn)行溶解曲線分析。

１．２．２盆栽實(shí)驗(yàn)以ＫＨ２ＰＯ４的方式加入磷，鹽脅迫處理使用ＮａＣｌ。實(shí)驗(yàn)設(shè)置３個(gè)磷水平（０、３０、６０ ｍｇ／ｋｇ）和３個(gè)鹽水平（０、０．３５、１．０５ ｇ／ｋｇ），共９種處理，每種處理設(shè)置不接種、單接種Ｇ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅ、單接種Ｇ ｍｏｓｓｅａｅ和雙接種（１∶１，Ｖ／Ｖ）４種接種方式，共３６個(gè)處理，每個(gè)處理３次重復(fù)，共計(jì)１０８盆。每盆裝土５００ ｇ，接種處理每盆加１３％接種劑，對(duì)照組加等量滅菌的接種劑。參照“１．１”的方法進(jìn)行種子滅菌和催芽。

１．２．３侵染率測(cè)定第７周收獲時(shí)將植株取出、洗凈后，取新鮮根０．２ ｇ用于抽提ＤＮＡ，用熒光定量ＰＣＲ方法檢測(cè)ＡＭＦ侵染率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ＳＰＳＳ １６．０進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

２結(jié)果與分析

２．１定量ＰＣＲ方法中特異性引物的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

分別以植物、Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ孢子、Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ孢子的ＤＮＡ為模板，用各自的特異性引物對(duì)上述３種模板行進(jìn)行驗(yàn)證（圖１，從左往右膠圖順序分別是Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ， Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和紫云英特異性引物驗(yàn)證結(jié)果，１－５泳道的模板分別為負(fù)對(duì)照，紫云英，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ，５０ ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ）。ＡＭＦ及植物的引物都具有特異性，通過在熒光定量ＰＣＲ儀器上進(jìn)行驗(yàn)證，各自的溶解曲線為單峰，說明這３對(duì)引物可以用于熒光定量ＰＣＲ方法中，引物序列及名稱：ＬＲ１－ＮＤＬ２２［８］，Ｇｉ－Ｒ／ＲＴ－Ｆ：ＡＡＴＣＡＧＣＣＴＴＴＣ

ＧＧＧＴ，ＴＡＣＣＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＴＧ；Ｍｏｓ－Ｆ／Ｍｏｓ－Ｒ［１１］，ＡＳＦ６／ＡＳＲ６［１３］。

２．２ＡＭＦ和紫云英ＤＮＡ標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

分別用Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ、Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ、紫云英的特異性引物進(jìn)行ＰＣＲ，得到熒光定量ＰＣＲ的ＣＴ值與各自ＤＮＡ濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖２）。Ｇｉ－Ｒ／ＲＴ－Ｆ擴(kuò)增的ＤＮＡ濃度范圍為３．２×１０－３～３２.0 ｎｇ，線性方程為ｙ＝－３．１９１ｘ＋２７．２５０，Ｒ２＝０．９９９ ０（圖２ａ）；Ｍｏｓ－Ｆ／ Ｍｏｓ－Ｒ擴(kuò)增的ＤＮＡ濃度范圍在１．６×１０－３～２５.0 ｎｇ， 線性方程為ｙ＝－３．２１９ｘ＋２４．１６７，Ｒ２＝０．９９８ ９（圖２ｂ）；ＡＳＦ６／ＡＳＲ６擴(kuò)增的ＤＮＡ濃度范圍為３．５×１０－４～３５.0 ｎｇ，線性方程為ｙ＝－３．４０３ｘ＋２１．２７０，Ｒ２＝０．９９９ ６（圖２ｃ）。擴(kuò)增效率分別是１０５．４％、１０５．５％、９８．８％。

２．３定量ＰＣＲ檢測(cè)ＡＭＦ特異引物的靈敏性

在模擬實(shí)驗(yàn)條件下，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ ＤＮＡ （０．０１６，０．０８０，０．４００，２．０００，１０．０００，５０．０００ ｎｇ）分別與３５．０、１１．７和３．５ ｎｇ（圖３a）紫云英ＤＮＡ混合，擴(kuò)增的ｌｏｇＣＤＮＡ與ＣＴ值之間的線性方程分別為，ｙ＝

－３．３０３ｘ＋２８．２３７，Ｒ２＝０．９９６ ８；ｙ＝－３．５２６ｘ＋２８．７３１， Ｒ２＝０．９９４ ０；ｙ＝－３．２５６ｘ＋２８．５３４，Ｒ２＝０．９９０ ９；擴(kuò)增效率分別為１００．７７％，９６．３１％，９７．６5％。Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ ＤＮＡ（０．０８０，０．４００，２．０００，１０．０００，５０．０００ ｎｇ） 分別與１５．０、５．０和１．０ ｎｇ（圖３b）紫云英ＤＮＡ混合，擴(kuò)增的ｌｏｇＣＤＮＡ與ＣＴ值之間的線性方程分別為ｙ＝－３．３９６ｘ＋２５．５５５，Ｒ２＝０．９９７ ５；ｙ＝－３．４２９ １ｘ＋２５．６０２，Ｒ２＝０．９９７ ８；ｙ＝－３．３０８ｘ＋２５．２１６，Ｒ２＝０．９９５ ８，擴(kuò)增效率分別為９９．３３0％，９７．９９６％，９７．６４８％，１０６．８０８％。當(dāng)ＡＭＦ的ＤＮＡ模板濃度在０．０１６～５０．００0 ｎｇ范圍內(nèi)都能得到良好的擴(kuò)增，這說明ＡＭＦ的特異引物可以在混雜ＤＮＡ存在時(shí)準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)出目的基因。

２．４根樣侵染率與ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ）線性關(guān)系模擬

在模擬實(shí)驗(yàn)下確定了ＡＭＦ引物在熒光定量ＰＣＲ運(yùn)用于ＡＭＦ ＤＮＡ檢測(cè)具有特異性及靈敏性的基礎(chǔ)上，用盆栽實(shí)驗(yàn)的根樣，建立ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ） 與ＴＢ染色顯微觀察結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ）與侵染率有明顯的相關(guān)性（Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，ｙ＝０．１０６ ７ｘ－０．００４ ９，Ｒ２＝０．９６７ ６）； Ｇ． ｉｎｔｒａｄｉｃｅｓ，ｙ＝０．１２１ ２ｘ＋０．００２ ３，Ｒ２＝０．９６１ ８）（圖４）。利用ｑＰＣＲ方法檢測(cè)出實(shí)際根樣中的ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ）值隨著侵染率的變化而呈現(xiàn)出相應(yīng)的變化，表明本方法可以用于直接檢測(cè)實(shí)際侵染根樣中各種ＡＭＦ的侵染率。

２．５不同處理對(duì)ＡＭＦ侵染紫云英的影響

定量ＰＣＲ檢測(cè)的結(jié)果得到不同ＡＭＦ對(duì)植物的侵染率如圖５。在低磷時(shí)，鹽濃度增加，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ侵染率逐漸降低；中磷和高磷條件下隨著鹽濃度的增加，其侵染率先升高后降低。高鹽濃度處理時(shí)，其ＤＮＡ含量分別減少了６１．５８％、２８．０７％、１５．４６％，說明Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ的侵染率隨著鹽濃度的增加而降低，在高鹽濃度時(shí)，與正常鹽濃度下相比，其相對(duì)ＤＮＡ含量分別減少了５１．５４％、６６．２０％、６７．７１％，磷含量的增加進(jìn)一步降低了Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ的侵染率，說明磷進(jìn)一步抑制其侵染。而雙接種條件下，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的侵染率都要高于Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ的侵染率，同樣處理下Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ侵染率有時(shí)僅為Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的５８．６７％，表明混合接種促進(jìn)了Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ侵染紫云英。

２．６不同磷水平和鹽水平下接種ＡＭＦ對(duì)紫云英生物量的影響

從表１可以看出，在各種處理下，接種ＡＭＦ的紫云英干重要高于未接種的紫云英，說明了ＡＭＦ可以提高紫云英的抗鹽性。其中在中磷條件下顯示出最佳促生效果，而低磷條件下次之，高磷條件最差。中磷濃度（３０ ｍｇ／ｋｇ）下，在低鹽時(shí)，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果介于Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和混合接種之間，在高鹽條件時(shí)單接種Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的促生效果最好，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果最差。

３小結(jié)與討論

ＴＢ染色觀察Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ這兩種ＡＭＦ對(duì)紫云英的侵染率和定量ＰＣＲ檢測(cè)的相關(guān)系數(shù)分別為０．９８０ ７和 ０．９５１ ３，說明直接用定量ＰＣＲ方法檢測(cè)ＡＭＦ的侵染率與ＴＢ染色檢測(cè)的浸染率之間的線性關(guān)系良好。定量ＰＣＲ方法檢測(cè)ＡＭＦ的侵染率可以用來研究不同ＡＭＦ對(duì)不同宿主的偏好性、在宿主植物中的分布狀態(tài)，還可以運(yùn)用于分子生態(tài)學(xué)研究中，通過檢測(cè)土樣中ＡＭＦ的ＤＮＡ含量，篩選出抗環(huán)境脅迫的高效菌種，可以加大這類ＡＭＦ的利用。本研究利用定量ＰＣＲ方法檢測(cè)ＡＭＦ的侵染率的研究結(jié)果與Ａｌｋａｎ等［１１］的研究結(jié)果相似，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在混合接種中對(duì)宿主植物的侵染率最高。而Ｊａｎｓａ等［１４］在運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ技術(shù)研究Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ，Ｇｌｏｍｕｓ ｃｌａｒｏｉｄｅｕｍ單接種或者混合接種侵染苜蓿時(shí)，發(fā)現(xiàn)Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ對(duì)宿主植物的侵染率最高，說明ＡＭＦ對(duì)宿主植物具有一定的偏好性。目前對(duì)利用實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)不同ＡＭＦ侵染率的可行性還存在爭(zhēng)議。

在不同磷濃度下，隨著鹽濃度的增加，紫云英的生物量都減少，但接種ＡＭＦ的紫云英生物量都要高于未接種的紫云英，表明ＡＭＦ促進(jìn)了紫云英在鹽漬環(huán)境中的生長(zhǎng)。高磷（６０ ｍｇ／ｋｇ）濃度下，隨著鹽濃度的增加，菌根紫云英生物量變化不大，可能是紫云英吸收了大量磷減少了對(duì)鹽的吸收，這與之前利用施加營養(yǎng)元素緩解鹽脅迫的結(jié)論是一致的［１５］?？赡苁侵参镂樟滓种屏藢?duì)鹽的吸收，植物對(duì)鹽和磷的吸收存在競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系［１６］。在中磷（３０ ｍｇ／ｋｇ）濃度下，低鹽時(shí)Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果介于Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和混合接種之間；高鹽時(shí)單接種Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的促生效果最好，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果最差，不同的接種方式促生效應(yīng)不一樣，而鹽和磷對(duì)ＡＭＦ間的相互作用關(guān)系也產(chǎn)生影響。

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［４］ ＨＥＩＪＤＥＮ Ｍ Ｇ Ａ， ＫＬＩＲＯＮＯＭＯＳ Ｊ Ｎ， ＵＲＳＩＣ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｐｌａｎｔ ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］． Ｇｅｏｌ Ｓｏｃ Ａｍ Ｂｕｌｌ，１９８８， １００：９１２－９２７．

［５］ ＭＣＭＩＬＬＥＮ Ｂ Ｇ， ＪＵＮＩＰＥＲ Ｓ， ＡＢＢＯＴＴ Ｌ Ｋ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｈａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ａ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ－ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｕｓ ｉｎ ｓｏｉｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｌｉｍｉｔｓ ｔｈｅ ｓｐｒｅａｄ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｐｏｒｅｓ［Ｊ］． Ｓｏｉｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，３０（１３）：１６３９－１６４６．

［６］ ＤＡＥＩ Ｇ，ＡＲＤＥＫＡＮＩ Ｍ Ｒ，ＲＥＪＡＬＩ Ｆ， ｅｔ ａl． Ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｎｉｔｙ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｗｈｅａｔ ｙｉｅｌｄ， ｙｉｅｌｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ， ａｎｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｕｐｔａｋｅ ｕｓｉｎｇ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｕｎｄｅｒ ｆｉｅｌｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００９，１６６（６）：６１７－６２５．

［７］ ＲＥＤＤＹ Ｓ Ｒ， ＰＩＮＤＩ Ｐ Ｋ， ＲＥＤＤＹ Ｓ Ｍ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｉｎ Ｉｎｄｉａ： ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ［Ｊ］． Ｃｕｒｒ Ｓｃｉ，２００５，８９（１０）：１６９９－１７０９．

［８］ ＰＥＮＧ Ｊ，ＬＩ Ｙ，ＳＨＩ Ｐ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ． ｕｎｄｅｒ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］． Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ，２０１１，２１（１）：２3－２7．

［９］ ＩＳＡＹＥＮＫＯＶ Ｓ， ＦＥＳＴＥＲ Ｔ， ＨＡＵＳＥ Ｂ． Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｒｂｕｓｃｕｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ（ＲＴ）ＰＣＲ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４，１６１（１２）：１３７９－１３８３．

［１０］ ＡＬＫＡＮ Ｎ， ＧＡＤＫＡＲ Ｖ， ＣＯＢＵＲＮ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｕｓ Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ ｉｎ ｈｏｓｔ ｔｉｓｓｕｅ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，２００４，１６１（３）：８７７－８８５．

［１１］ ＡＬＫＡＮ Ｎ， ＧＡＤＫＡＲ Ｖ，ＹＡＲＤＥＮ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ， Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ ａｎｄ Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ， ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００６，７２（６）：４１９２．

［１２］ ＧＡＭＰＥＲ Ｈ Ａ， ＹＯＵＮＧ Ｊ Ｐ Ｗ． Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ： Ａｒｅ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｕｎｉｔ ｏｆ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇａｌ ａｂｕｎｄａｎｃｅ？［Ｊ］． Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００８，４５（５）： ５８１－５９６．

［１３］ ＬＩ Ｙ Ｘ， ＺＨＯＵ Ｌ， ＬＩ Ｙ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｄｕｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｌａｎｔ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ， ＡｓＮＯＤＦ３２， ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｎｏｄｕｌｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｍａｎｕｒｅ ｌｅｇｕｍｅ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ， ２００８，１８０（１）：１８５－１９２．

［１４］ ＪＡＮＳＡ Ｊ， ＳＭＩＴＨ Ｆ Ａ， ＳＭＩＴＨ Ｓ Ｅ． Ａｒｅ ｔｈｅｒｅ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｏｆ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｒｏｏｔ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ？［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，２００８，１７７（３）：７７９－７８９．

［１５］ 段德玉，劉小京，李存楨． Ｎ素營養(yǎng)對(duì)ＮａＣｌ脅迫下鹽地堿蓬幼苗生長(zhǎng)及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化的影響［Ｊ］．草業(yè)學(xué)報(bào)，２００５，１４（１）：６３－６８．

［１６］ ＰＦＥＩＦＦＥＲ Ｃ Ｍ， ＢＬＯＳＳ Ｈ Ｅ. Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕａｙｕｌｅ （Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ） ｉｎ ａ ｓａｌｉｎｅ ｓｏｉｌ ａｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ－ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，１９８８，１０８（３）：３１５－３２１．