水酶法提取大豆油乙醇冷浴破乳工藝及油脂聚集狀態(tài)的研究

李 楊 齊寶坤 隋曉楠 馬文君 王中江 江連洲

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

水酶法提取大豆油乙醇冷浴破乳工藝及油脂聚集狀態(tài)的研究

李 楊 齊寶坤 隋曉楠 馬文君 王中江 江連洲

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

采用乙醇冷浴破乳法對水酶法提取大豆油過程中形成的乳狀液和水解液進(jìn)行破乳研究，確定乙醇冷浴破乳最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，酶解液與乙醇體積比1∶1，冷浴溫度-30 ℃，冷浴時間30 min。對常溫乙醇破乳、冷凍解凍破乳、乙醇冷浴破乳3種方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)采用乙醇冷浴破乳法優(yōu)勢明顯，具有較高破乳率(93.64%)和游離油得率(88.79%)。通過顯微切片觀察可知，對乳狀液進(jìn)行常溫乙醇破乳和冷凍解凍破乳后，仍有一小部分油滴存在于油水界面間剩余的黏稠物中不能被釋放；而采用乙醇冷浴破乳可使起乳化作用的蛋白質(zhì)等物質(zhì)變性沉淀，油水界面已經(jīng)不存在黏稠物，幾乎達(dá)到完全破乳。此外，與乳狀液相比，水解液中的脂肪球暴露的更多，且彼此靠的更近，這說明水解液中脂肪球更易于聚集成油滴而被釋放。

水酶法 大豆油 乙醇冷浴破乳 油脂聚集狀態(tài)

水酶法作為一種新興的植物油脂提取技術(shù)，是在機(jī)械破碎的基礎(chǔ)上，對油料組織以及脂蛋白、脂多糖等復(fù)合體進(jìn)行酶解，從而使油脂游離出來[1]。采用水酶法提取大豆油過程中，降解產(chǎn)物不會與提取物發(fā)生反應(yīng)，酶解條件溫和，可以有效的保護(hù)大豆油品質(zhì)[2]。然而由于大豆中含有蛋白質(zhì)、磷脂等兩性大分子物質(zhì)的存在，使富含油/水的生物酶法提油體系中不可避免的形成乳狀液，這對游離油的提取造成了很大的阻礙。乳狀液中的蛋白質(zhì)、磷脂及多糖均對水酶法提取過程中形成的乳狀液具有穩(wěn)定作用[3]。具有雙親性的水溶性蛋白質(zhì)趨向于吸附在油水界面處形成一層穩(wěn)定的蛋白質(zhì)膜，進(jìn)而阻斷了油脂的聚結(jié)釋放[4]。Bos等[5]研究表明磷脂具有很強(qiáng)的表面活性，同時會顯著地影響乳狀液的穩(wěn)定性，多糖的存在會使乳狀液黏度增大或形成水相凝膠，使油滴之間分離開，降低油脂的聚集釋放。

乳狀液破乳的方法包括化學(xué)破乳、物理破乳和生物破乳[6]。近年來對水酶法乳狀液破乳的研究很多，乙醇破乳法能夠使乳狀液中起乳化作用的蛋白質(zhì)完全變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的乳化能力完全喪失，使得乳狀液完全破乳且油脂充分釋放。冷凍解凍破乳法使乳狀液中油相結(jié)晶，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性下降，從而達(dá)到破乳的目的[7]。劉琪等[8]研究發(fā)現(xiàn)乙醇破乳可以大幅度提高游離油得率，且乙醇體積分?jǐn)?shù)和乙醇添加量對破乳率有很大影響。Lamsal等[9]采用冷凍解凍法對生物酶法提取大豆油乳狀液的破乳進(jìn)行研究，在最佳條件下破乳率達(dá)到80%～90%。

本試驗(yàn)將乙醇破乳法和冷凍解凍破乳法相結(jié)合，對水酶法提油過程中形成的乳狀液和水解液的破乳工藝進(jìn)行研究，確定乙醇冷浴破乳最佳工藝條件，并利用光學(xué)顯微鏡對常溫乙醇破乳、冷凍解凍破乳、乙醇冷浴破乳3種方法中油脂聚集狀態(tài)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆片：哈爾濱市九三油廠；Alcalase 2.4L堿性蛋白酶：丹麥novo公司；乙醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

立式植物粉碎機(jī)：上海偉業(yè)儀器廠；雙螺桿擠壓機(jī)MY146×2：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)(自制)；精密電動攪拌機(jī)：江蘇省金壇市醫(yī)療器械廠；電熱恒溫水浴箱：北京市用光明醫(yī)療器械廠；pHS-3C型酸度計：上海雷磁儀器廠；LDZ5-2型臺式低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；光學(xué)顯微鏡：德國Leica公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

大豆片→清理→粉碎→水分調(diào)節(jié)→擠壓膨化→粉碎→膨化產(chǎn)物→加水混合→酶解→滅酶→離心分離→酶解液(乳狀液、水解液)→乙醇冷浴破乳→離心分離→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→游離油 ↓

游離油

1.2.2 乙醇冷浴破乳工藝單因素試驗(yàn)

向酶解液中加入一定體積的乙醇，在一定的冷浴溫度下進(jìn)行冷浴反應(yīng)，然后離心分離得游離油。乙醇冷浴破乳工藝基本條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，乙醇與酶解液體積比1∶1，冷浴溫度-20 ℃，冷浴時間30 min。在其他條件不變的情況下，以破乳率(%)和游離油得率(%)為考察指標(biāo)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%、100%，乙醇與酶解液體積比為1∶0.5、1∶0.75、1∶1、1∶1.25、1∶1.5，冷浴溫度為0、-10、-20、-30、-40 ℃，冷浴時間為10、20、30、40、50 min，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同乙醇冷浴反應(yīng)條件對破乳率和游離油得率的影響，并確定破乳最佳工藝條件。

1.2.3 不同破乳法中油脂聚集狀態(tài)分析

在相同的酶解條件下，分別采用常溫乙醇破乳法、冷凍解凍破乳法及乙醇冷浴破乳法對酶解液(乳狀液、水解液)進(jìn)行破乳處理，利用光學(xué)顯微鏡對破乳前后油脂聚集狀態(tài)進(jìn)行觀察，分析比較3種不同破乳過程中油脂釋放情況。

1.2.4 酶解液基本成分測定

蛋白質(zhì)含量測定參照GB/T 5009.5—2003，油脂含量測定參照AOAC 995.19法[10]，磷脂含量測定參照GB/T 5537—2008 鉬藍(lán)比色法[11]，水分含量測定參照GB/T 5009.3—2003。

1.2.5 破乳率和游離油得率測定

游離油得率=

1.2.6 顯微切片觀察

顯微制片方法參照關(guān)正君等[12]的方法，對酶解液中脂肪球進(jìn)行蘇丹Ⅲ染色，對蛋白質(zhì)進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行顯微切片觀察。

1.2.7 統(tǒng)計分析

每個試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)x±s。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS V17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，采用軟件Origin8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳狀液和水解液成分分析

在研究水酶法提取大豆油乙醇冷浴破乳工藝之前，對乳狀液和水解液的成分進(jìn)行測定，各成分含量見表1。

表1 乳狀液和水解液成分分析/%

由表1可知，乳狀液中油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)54%，水解液中油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，水酶法提取出的油脂大部分存在于乳狀液和水解液中，沒有以游離油形式提取出來，因此有必要進(jìn)行破乳處理。乳狀液和水解液中磷脂對乳狀體系的穩(wěn)定性有影響，從而影響游離油得率。

2.2 乙醇冷浴破乳工藝單因素分析

2.2.1 乙醇濃度對破乳率和游離油得率的影響

圖1為乙醇濃度對破乳率和游離油得率的影響。由圖1可知，隨著乙醇濃度的增大，破乳率和游離油得率逐漸上升，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時，破乳率和游離油得率最大，繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，破乳率和游離油得率反而下降。隨著乙醇濃度的不斷增加，具有乳化作用的蛋白質(zhì)變性程度增大，導(dǎo)致其乳化性減弱或喪失，使乳化體系的穩(wěn)定性被打破，釋放出油脂[13]。選擇最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖1 乙醇濃度對破乳率和游離油得率的影響

2.2.2 乙醇添加量對破乳率和游離油得率的影響

圖2為乙醇添加量對破乳率和游離油得率的影響。由圖2可知，破乳率和游離油得率隨乙醇添加量的增大呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)酶解液體積：乙醇體積為1∶1時，破乳率和游離油得率達(dá)到最大，當(dāng)乙醇體積比例進(jìn)一步增大時，破乳率和游離油得率開始降低。乙醇添加量增加可使乙醇與蛋白質(zhì)接觸面積增大，引起蛋白質(zhì)變性加劇，導(dǎo)致其乳化性減弱，使油脂釋放。選擇最佳酶解液與乙醇體積比為1∶1。

圖2 乙醇添加量對破乳率和游離油得率的影響

2.2.3 冷浴溫度對破乳率和游離油得率的影響

圖3為冷浴溫度對破乳率和游離油得率的影響。由圖3可知，冷浴溫度在0～-30 ℃時，破乳率和游離油得率呈上升趨勢，在-30 ℃時達(dá)到最大，冷浴溫度低于-30 ℃后，破乳率和游離油得基本不變。溫度降低時引起乳化體系中起到乳化作用的蛋白質(zhì)變性[14]，導(dǎo)致其乳化性減弱，使得油脂聚集并釋放；當(dāng)溫度繼續(xù)降低，使蛋白質(zhì)完全變性，已完全變性的蛋白質(zhì)不受溫度的影響，破乳率和游離油得率幾乎不變。選擇最佳冷浴溫度為-30 ℃。

圖3 冷浴溫度對破乳率和游離油得率的影響

2.2.4 冷浴時間對破乳率和游離油得率的影響

圖4為冷浴時間對破乳率和游離油得率的影響。由圖4可知，隨著冷浴時間的延長，破乳率和游離油得率逐漸增大后趨于平緩，當(dāng)冷浴時間為30 min時，破乳率和游離油得率達(dá)到最大，再繼續(xù)延長冷浴時間，破乳率和游離油得率也沒有明顯變化。冷凍時間延長到一定值時，蛋白質(zhì)變性程度不再發(fā)生變化，導(dǎo)致破乳率和游離油得率不再增加。選擇最佳冷浴時間為30 min。

圖4 冷浴時間對破乳率和游離油得率的影響

通過單因素試驗(yàn)分析可知，乙醇冷浴破乳最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，酶解液與乙醇體積比1∶1，冷浴溫度-30 ℃，冷浴時間30 min。

2.3 不同破乳方法的比較

在相同的酶解條件下，分別采用常溫乙醇破乳法、冷凍解凍破乳法及乙醇冷浴破乳法對酶解液(乳狀液、水解液)進(jìn)行破乳處理，不同破乳方法的游離油得率見表2。由表2可以看出，采用乙醇冷浴破乳法比以往常用的破乳法優(yōu)勢明顯，具有較高的破乳率和游離油得率，分別為93.64%和88.79%。乙醇冷浴破乳法比常溫乙醇破乳法的游離油得率提高了近17%，比冷凍解凍破乳法的游離油得率提高了12%，這說明乙醇冷浴破乳法破乳效果好，能夠使油脂最大程度的釋放出來，進(jìn)而提高提油率，有必要對破乳前后的油脂聚集狀態(tài)進(jìn)行觀察，分析其油脂釋放機(jī)理。

表2 不同破乳方法的破乳率和游離油得率/%

2.4 破乳過程中油脂聚集狀態(tài)分析

利用光學(xué)顯微鏡對破乳前后乳狀液和水解液油脂聚集狀態(tài)進(jìn)行觀察，采用蘇丹Ⅲ對脂肪球進(jìn)行染色，觀察脂肪球在破乳前后的變化狀態(tài)，并進(jìn)行理論分析。

圖5為乳狀液破乳過程中油脂聚集狀態(tài)。由圖5a可以看出，采用水酶法工藝離心后得到的游離油較少且形成的乳狀液較多；通過微觀結(jié)構(gòu)觀察可知，水酶法得到的未破乳的乳狀液中脂肪球粒徑較小，且被蛋白等其他物質(zhì)包裹，同時呈分散狀態(tài)，不能以游離油的形式提取出來。由圖5b可以看出，將乳狀液進(jìn)行常溫乙醇破乳，離心后還存在部分乳狀液未破乳；通過微觀結(jié)構(gòu)觀察可知，油滴脂肪球粒徑有所增大，另一部分脂肪球粒徑依然較小，且脂肪球沒有形成較大油滴，少部分油脂被釋放出來。由圖5c可以看出，將乳狀液進(jìn)行冷凍解凍破乳，離心后乳狀液中大部分油脂被釋放；通過微觀結(jié)構(gòu)觀察可知，乳狀液中脂肪球粒徑進(jìn)一步增大且發(fā)生聚集形成較大油滴被釋放，但一小部分油滴存在于油水界面間剩余的黏稠物中不能被釋放[15]。由圖5d可以看出，將乳狀液進(jìn)行乙醇冷浴破乳，離心后乳狀液中油脂幾乎全部被釋放；通過微觀結(jié)構(gòu)觀察可知，乳狀液中脂肪球粒徑急劇增加，并且聚集形成肉眼可見的大油滴，同時，起乳化作用的蛋白質(zhì)等物質(zhì)變性沉淀，油水界面已經(jīng)不存在黏稠物，幾乎達(dá)到完全破乳。

圖5 乳狀液破乳前后油脂聚集狀態(tài)

圖6為水解液破乳前后油脂聚集狀態(tài)。由圖6a可以看出，水酶法得到的未破乳的水解液中仍存在很多粒徑較小且呈現(xiàn)分散狀態(tài)的脂肪球，不能以游離油的形成提取出來。由圖6b和圖6c可以看出，對水解液分別進(jìn)行常溫乙醇破乳和冷凍解凍破乳后，水解液中部分脂肪球粒徑變大，但仍有很多脂肪球被包裹，不能聚集形成較大油滴，難以被釋放出來。由圖6d可以看出，對水解液進(jìn)行乙醇冷浴破乳后，水解液中大多數(shù)脂肪球粒徑急劇增大，并以較大油滴的形式存在，通過離心能夠得到游離油，游離油得率大大提高，此時破乳率最高。與乳狀液中脂肪球分布狀態(tài)(圖5)相比，水解液中的脂肪球暴露的更多，且彼此靠的更近，這說明水解液中脂肪球更易于聚集成油滴而被釋放。

圖6 水解液破乳前后油脂聚集狀態(tài)

3 結(jié)論

對水酶法提取大豆油過程中形成的酶解液(乳狀液和水解液)進(jìn)行乙醇冷浴破乳，通過單因素試驗(yàn)分析，確定乙醇冷浴破乳最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，酶解液與乙醇體積比1∶1，冷浴溫度-30 ℃，冷浴時間30 min。通過常溫乙醇破乳、冷凍解凍破乳、乙醇冷浴破乳3種方法對乳狀液和水解液進(jìn)行破乳，發(fā)現(xiàn)采用乙醇冷浴破乳法優(yōu)勢明顯，具有較高的破乳率和游離油得率，在最佳破乳工藝條件下，破乳率為93.64%，游離油得率為88.79%。通過顯微切片觀察可知，未破乳的乳狀液中脂肪球粒徑較小且呈現(xiàn)分散狀態(tài)，常溫乙醇破乳和冷凍解凍破乳可以使乳狀液中大部分脂肪球粒徑增大，且發(fā)生聚集形成較大油滴被釋放，但一小部分油滴存在于油水界面間剩余的黏稠物中不能被釋放。采用乙醇冷浴破乳可使乳狀液中脂肪球形成肉眼可見的大油滴，同時，起乳化作用的蛋白質(zhì)等物質(zhì)變性沉淀，油水界面已經(jīng)不存在黏稠物，此時破乳率最高。此外，與乳狀液相比，水解液中的脂肪球暴露的更多，且彼此靠的更近，這說明水解液中脂肪球更易于聚集成油滴而被釋放。

[1]Towam L T, Kapchie V N, Guang W, et al. Quantity and quality of free oil recovered from enzymatically disrupted soybean oleosomes[J]. Journal of the American Chemistry Society, 2011, 88(4): 1581-1591

[2]Jung S, Maurer D. Factors affecting emulsion stability and quality of oil recovered from enzyme-assisted aqueous extraction of soybeans[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(5): 5340-5347

[3]Morales C. Destabilization of the emulsion formed during aqueous extraction of soybean oil[J].Journal of the American Chemistry Society, 2008, 85: 383-390

[4]Ramon M C, Charles E G. Destabilization of the emulsion formed during aqueous extraction of soybean oil[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2009, 78: 8-11

[5]Bos M, Nylander T，Amebrant T. In Hasenhuette hartel rweditor[J]. Food Emulsions and Their Applications, 1997, 95: 18-21

[6]陳和平. 破乳方法的研究與應(yīng)用新進(jìn)展[J]. 精細(xì)石油化工, 2012, 29(5): 71-76

Chen Heping. The latest progress in the research and application of the demulsification methods[J]. Speciality Petrochemicals,2012, 29(5): 71-76

[7]Thanasukarn P, Pongsawatmanit R, Mcclements D J. Impact of fat and water crystallization on the stability of hydrogenated palm oil-in-water emulsions stabilized by whey protein isolate colloids and surfaces[J]. Physicochemical and Engineering Aspects, 2004, 246(3): 49-59

[8]劉琪, 江連洲, 李楊，等. 乙醇冷浴輔助酶法提取大豆油工藝研究[J]. 中國油脂, 2012, 37(11): 4-7

Liu Qi, Jiang Lianzhou, Li Yang, et al. Aqueous enzymatic extraction of soybean oil assisted with ethanol in cold bath[J]. China Oils and Fats, 2012, 37(11): 4-7

[9]Lamsal B P, Johnson L A. Separating oil from aqueous extraction fractions of soybean[J]. Journal of the American oil Chemist’s Society, 2007, 84(8): 785-792

[10]Chabrand R M, Glatz C E. Destabilization of the emulsion formed during the enzyme-assisted aqueous extraction of oil from soybean flour[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2009, 45(1): 28-35

[11]中華人民共和國國家技術(shù)監(jiān)督局. GB5537-2008植物油脂檢驗(yàn)磷脂檢驗(yàn)法測定法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008

National bureau of technical supervision of the People’s Republic of China.GB5537-2008 Phospholipids test measurement in the inspection of plant oils[S]. Beijing: China Standards Press, 2008

[12]關(guān)正君, 霍艷林. 常見生物顯微制片方法的比較研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 34(11): 2395-2396

Guan Zhengjun, Huo Yanlin. Studies on comparison of the common biological micro movie-making method[J]. Journal of Anhui Agriculture Science, 2006, 34(11): 2395-2396

[13]Johnson L A, Jung S. Demulsification of oil-rich emulsion from enzyme-assisted aqueous extraction of extruded soybean flakes[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(2): 527-533

[14]Hillgren A, Alden M. Differential scanning calorimetry investigation of formation of ethyleneglycol hydrate with controlled freeze thawing of aqueous protein solution[J]. Journal of Applied Polymer Science, 2004, 91(3): 1626-1634

[15]林暢. 冷凍解凍法破除油包水型乳狀液的研究[D]. 大連: 大連理工大學(xué), 2007

Lin Chang. Study on freeze/thaw induced demulsification of water-in-oil emulsions[D]. Dalian: Dalian University of Technology Doctoral Dissertation, 2007.

Research on Demulsification Process by Ethanol Cold Bath for Aqueous Enzymatic Extraction of Soybean Oil and State of Oil Aggregation

Li Yang Qi Baokun Sui Xiaonan Ma Wenjun Wang Zhongjiang Jiang Lianzhou

(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Haerbin 150030)

Demulsification of emulsion and hydrolysate in the process of enzymatic extraction of soybean oil by the method of ethanol cold bath was researched. The optimum technological conditions of ethanol cold bath demulsification were determined as follows: Ethanol concentration was 80%, volume ratio of enzymatic hydrolysate and ethanol was 1∶1, cold bath temperature was-30 ℃, and cold bath time was 30 min. It was found that ethanol cold

bath demulsification with higher demulsification rate (93.64%) and free oil yield (88.79%) had obvious advantage by comparison between normal temperature ethanol demulsification, freeze thawing demulsification and ethanol cold bath demulsification. A small part of the oil droplets still existed in the remaining sticky between oil-water interface using the method of normal temperature ethanol demulsification and froze thawing demulsification by microscopy. While using ethanol cold bath demulsification could make the protein substances with emulsification denaturation and form precipitation, as a result, there was no sticky between oil-water interface, which achieved almost completely demulsification. Moreover, compared with emulsion, more fat globules in the hydrolysate exposed and got closer to each other, which showed that fat globule in the hydrolysate was easier to gather to form oil drops and to be released.

aqueous enzymatic method, soybean oil, ethanol cold bath demulsification, state of oil aggregation

TS224

A

1003-0174(2016)12-0079-06

黑龍江省教育廳自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(12531049)

2015-05-05

李楊，男，1981年出生，副教授，糧食油脂及植物蛋白工程

江連洲，男，1960年出生，教授，糧食油脂及植物蛋白工程