• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    體外震波對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞間黏附因子-1表達(dá)的影響

    2016-12-26 12:38:00馬一銘李麗蔡紅雁胡釗郭濤
    中國循環(huán)雜志 2016年10期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞周期內(nèi)皮細(xì)胞新生

    馬一銘,李麗,蔡紅雁,胡釗,郭濤

    基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

    體外震波對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞間黏附因子-1表達(dá)的影響

    馬一銘,李麗,蔡紅雁,胡釗,郭濤

    目的:觀察體外震波治療對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達(dá)的影響。

    方法:將體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分組,實(shí)驗(yàn)部分分別給予0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/mm2能量震波500擊處理(分別設(shè)定為0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/mm2能量組),對照組不給予震波處理。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)比色法檢測細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及蛋白質(zhì)印跡方法(Westen blot)分別檢測低能量震波處理后ICAM-1信使核糖核酸( mRNA) 和蛋白的表達(dá)水平。

    結(jié)果:CCK 比色法檢測結(jié)果顯示:只有0.09 mJ /mm2能量組與對照組比能促進(jìn)HUVECs增殖,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而其他能量組與對照組比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同能量組與對照組比較,0.09 mJ/mm2能量組G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05),S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05),0.03 mJ/mm2能量組僅增加G2/M期細(xì)胞比例(P<0.05),而其他能量組與對照組比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示:0.09 mJ/mm2能量組ICAM-1 mRNA表達(dá)均較對照組明顯增高(9.27±0.95 vs 1.02±0.27,P<0.001),0.03 mJ/mm2能量組ICAM-1 mRNA表達(dá)均較對照組亦增高(7.08±0.60 vs 1.02±0.27,P<0.01)。Westen blot檢測顯示:0.09 mJ/mm2能量組ICAM-1蛋白表達(dá)較對照組明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    結(jié)論:體外震波治療,特別是0.09 mJ/mm2能量的體外震波能加速HUVECs細(xì)胞周期由G0期/G1期向S期和G2/M期的轉(zhuǎn)換,促進(jìn)細(xì)胞增殖,并且提高ICAM-1的表達(dá),這在體外震波促進(jìn)血管新生機(jī)制中起重要作用。

    體外震波治療;臍靜脈;內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞周期

    (Chinese Circulation Journal, 2016,31:1013.)

    體外震波作為物理療法,已成功運(yùn)用于泌尿系結(jié)石、膽道結(jié)石、骨骼肌肉系統(tǒng)疾病、肩周炎、糖尿病足等多年,近年來發(fā)現(xiàn)體外震波能促進(jìn)血管新生用于冠心病治療,改善心肌缺血。目前國內(nèi)外已在細(xì)胞水平、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床水平證實(shí)了其促血管新生的確切療效,且有效能量級別為0.09 mJ /mm2(相當(dāng)于體外震波碎石能量的1/10)[1-4],但其顯效機(jī)制目前尚不明確。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管形成的基礎(chǔ),在血管形成的過程中起最重要作用[5-7],可以說內(nèi)皮細(xì)胞增殖是血管形成的先決條件,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能提高血管新生。但血管新生過程復(fù)雜,還需要多種細(xì)胞因子的參與,細(xì)胞間粘附因子-1(ICAM-1)可在增生的內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá),介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合從而加速血管新生[8]。體外震波能否促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和ICAM-1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管新生,值得我們進(jìn)一步研究,故本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平探討體外震波促進(jìn)血管新生的有效能量,觀察其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及ICAM-1表達(dá)的影響,探討低能量體外震波促血管新生的可能機(jī)制,進(jìn)一步尋找體外震波促血管新生的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料

    胎牛血清白蛋白(美國Hyclone公司), HUVECs(中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所),DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone 公司),0.25% 胰蛋白酶(美國Gibco公司),青鏈霉素(美國Sigma公司),細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK,日本Dojindo公司),細(xì)胞周期檢測試劑盒(美國Beckmam Coulter公司),二喹林甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(杭州碧云天公司),鼠抗人ICAM-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司),山羊抗鼠HRP標(biāo)記IgG抗體(美國Santa Cruz公司),核糖核酸(RNA)抽提試劑盒(德國Qiagen公司), cDNA合成試劑(德國Promege公司),聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定量反應(yīng)試劑盒(德國Qiagen公司),引物(上海生物工程公司),10XLoading Buffer(DNA)(日本TaKaRa公司),ELX800酶標(biāo)儀(美國Chernicon公司),SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司),PCR擴(kuò)增儀(7300型,美國ABI公司),流式細(xì)胞儀(美國Becman Coulter公司)。

    1.2細(xì)胞培養(yǎng)

    將購于中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所的HUVECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)3 d,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS,濃度0.01 mol/L,pH=7.4,含NaCl、Na2HPO4、KCl、KH2PO4) 洗掉非貼壁細(xì)胞,按1:3的比例傳代。

    1.3HUVECs分組與震波處理

    將培養(yǎng)至對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化,用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1X105/ml,分別置于5支2 ml試管中,培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞同步化并隨機(jī)分組處理。采用瑞士STORZMEDICAL公司生產(chǎn)的震波儀(MODULITHSLC)進(jìn)行震波處理,實(shí)驗(yàn)部分分別給予0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/ mm2能量震波500擊處理(分別設(shè)定為0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/mm2能量組),對照組置于震波儀器中但不進(jìn)行震波處理,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,進(jìn)行后續(xù)檢測。

    1.4CCK檢測HUVECs增殖情況

    各組細(xì)胞懸液加入96孔板中( 100 μl/孔),再向每孔加入10 μl的CCK溶液,將培養(yǎng)板在(37℃, 5%CO2) 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,用酶標(biāo)儀測定在波長450 nm 處的吸光度值(A450),用吸光度值表示細(xì)胞增殖能力[9]。

    1.5 流式細(xì)胞儀術(shù)檢測HUVECs細(xì)胞周期的分布情況

    將各細(xì)胞懸液收集于15 ml試管中,以626 g離心5 min,加少量DMEM培養(yǎng)液,計(jì)數(shù),各組細(xì)胞量約1X105,收集沉淀重懸于200 μl的PBS中,再次離心收集沉淀,75%冰凍乙醇4℃固定細(xì)胞,離心棄固定液,再加PBS離心洗滌1次,沉淀重懸于200~500 μl的PBS,加入RnaseA 37℃水浴l h,加入碘化丙啶(PI)染色,終濃度50 ng/ml,4℃避光30 min,過300目篩網(wǎng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期[10]。

    1.6 蛋白質(zhì)印跡方法(Westen blot)檢測

    提取震波后各組細(xì)胞總蛋白,用BCA法[11]測定總蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品上樣,聚丙稀銑胺凝膠電泳(SDSPAGE),電轉(zhuǎn)移90 min至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,5%脫脂奶粉封閉2 h后與ICAM-1(1:6 000)一抗4 ℃孵育過夜。與山羊抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記IgG抗體(1:10 000)二抗室溫孵育1 h后,再與化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)室溫作用3 min,后曝光、顯影和定影。

    1.7 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測

    提取并純化震波后各組HUVECs細(xì)胞RNA,按照MBI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作明合成cDNA,利用primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物,引物(上海生物工程公司合成):ICAM-1 (正義鏈) 5'-tccagacatgaccgctgagt-3',(反義鏈) 5'-ctcattggccaacctgcctt-3',擴(kuò)增片段長度為210 bp; GAPDH( 正義鏈) 5'-caaggtcatccatgacaactttg-3',(反義鏈) 5'-gtccaccaccctgttgctgtag-3',擴(kuò)增片段長度為496 bp,設(shè)定反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像、掃描,紫外燈下觀察結(jié)果并拍照記錄。用GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參基因,ICAM-1樣品目的基因的相對表達(dá)率(RQ) 參照文獻(xiàn)[12]方法采用2-ΔΔCt法計(jì)算,公式如下:RQ = 2-ΔΔCt;ΔΔCt =待測樣本目的基因ΔCt-對照組目的基因ΔCt;ΔCt =目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 體外震波治療對HUMVCs增殖的影響(圖1)

    不同能量組與對照組比較,0.09 mJ /mm2能量組增殖能力較對照組升高(吸光度值升高),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而0.03、0.18、0.24 mJ /mm2能量組的增殖能力( 0.60 ± 0.06、0.62 ± 0.06、0.58 ±0.04) 與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖1 不同震波能量級別對HUVECs增殖的影響

    2.2 體外震波治療對HUMVCs細(xì)胞周期分布的影響(表1)

    0.09 mJ/mm2能量組與對照組相比,G0 /G1期細(xì)胞比例降低[(53.16±5.89)% vs (71.30±4.95)%, P<0.05],S期及G2/M期細(xì)胞比例明顯升高[(39.05±5.25)% vs (25.01±5.39)%、(8.21 ±1.44)% vs (4.03±0.73)%],且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0.03 mJ/mm2能量組僅G2/M期細(xì)胞比例高于對照組[(5.69±0.93)% vs (4.03±0.73)%, P<0.05]。其余各組細(xì)胞周期比例較對照組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表1 各組HUVECs的細(xì)胞周期分布比例(n= 6,)

    表1 各組HUVECs的細(xì)胞周期分布比例(n= 6,)

    注: HUVECs:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。與對照組相比*P<0.05

    ?

    2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測ICAM-1 mRNA的表達(dá)(圖2)

    瓊脂糖凝膠電泳顯示,ICAM-1 PCR反應(yīng)所得的產(chǎn)物條帶均與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的長度一致,無明顯雜帶,擴(kuò)增曲線以"S"型為擴(kuò)增成功。與對 照 組 相 比,0.09 mJ/mm2能 量 組HUVECs ICAM-1mRNA的表達(dá)明顯增加[(9.27±0.95) vs (1.02±0.27),P<0.001];0.03 mJ/mm2能 量組亦能增加ICAM-1 mRNA的表達(dá)(7.08±0.60 vs 1.02±0.27,P<0.01),但不如0.09 mJ/mm2能量組明顯。

    圖2 體外震波對HUVECs ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響

    2.4 Western blot檢測ICAM-1蛋白的變化(圖3)

    與 對 照 組 相 比,0.09 mJ/mm2能 量 組 處理HUVECs時(shí)ICAM-1蛋 白 表 達(dá) 明 顯 增 加[(132.32±14.43) vs (100.00±0.00),P<0.05], 其余能量組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    圖3 體外震波對HUVECs ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

    3 討論

    目前,冠心病已經(jīng)成為人類疾病死亡的主要原因,嚴(yán)重危害人類健康,當(dāng)心肌發(fā)生缺血、壞死時(shí),機(jī)體可代償性的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,從而促進(jìn)梗死周圍區(qū)側(cè)枝循環(huán)的建立,但這種微循環(huán)的重建代償不足以滿足機(jī)體改善心肌供血的需要[13]。尋找新的無創(chuàng)方法通過人為因素來促進(jìn)缺血區(qū)血管新生,從而改善缺血組織的血液供應(yīng),已經(jīng)成為近年來心血管疾病治療研究的熱點(diǎn)方向。近年來發(fā)現(xiàn)體外震波作為一種新型的血管再生療法,通過低能量脈沖波對心肌及血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生剪切力和空穴效應(yīng),能夠刺激新生血管形成,提高局部心肌血流和毛細(xì)血管密度[1,2]。體外震波能夠增加缺血心肌供血,減輕冠心病患者心絞痛癥狀,減少硝酸酯類用量,改善心功能,期間未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng),初步證實(shí)其安全有效[3,14],但其具體機(jī)制仍然不清楚,仍需我們不斷研究。

    本研究采用能夠近似反映人類血管內(nèi)皮細(xì)胞真實(shí)情況的HUVECs進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.09 mJ / mm2500擊低能量震波能加速HUVECs細(xì)胞周期由G0/G1期向G2/M期和S期的轉(zhuǎn)換,增加S期及G2/ M期細(xì)胞數(shù),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。0.09 mJ /mm2能量被認(rèn)為最佳能量,這與國外報(bào)道類似[1,2,14],但對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響至今少見報(bào)道。而內(nèi)皮細(xì)胞增殖同遷移、成熟和毛細(xì)血管形成一樣,是血管新生中極為重要的一環(huán)[15],因此認(rèn)為體外震波可以通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖來促進(jìn)血管新生。

    研究發(fā)現(xiàn)人為地增加心肌局部細(xì)胞生長因子的濃度,對緩解以致解除心肌缺血有潛在的可行性[16]。血管內(nèi)皮生長因子( VEGF) 是促血管生成的重要調(diào)節(jié)因子,低能量體外震波能促進(jìn)受損心肌組織高表達(dá)VEGF、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)等血管相關(guān)細(xì)胞因子,參與促進(jìn)缺血心肌組織新生毛細(xì)血管的形成和側(cè)枝循環(huán)的建立[1,17,18]。研究還發(fā)現(xiàn)體外震波能促進(jìn)具有分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞(MSCs)的增殖、分化和旁分泌活動(dòng),參與血管新生[19-21]。ICAM-1屬于黏附因子中免疫球蛋白超家族(IGSF)中的成員,是介導(dǎo)黏附反應(yīng)重要的一個(gè)黏附因子,ICAM-1廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面,內(nèi)皮細(xì)胞上的細(xì)胞間黏附因子介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合,從而參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、細(xì)胞組織生長及分化、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移等生理病理過程。

    血管形成是一個(gè)復(fù)雜的過程,血管生成過程中需要血管內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間、血管內(nèi)皮細(xì)胞相互間及血管內(nèi)皮細(xì)胞與其他周圍細(xì)胞間的相互作用,這種作用是黏附因子完成的,研究證明ICAM-1通過影響機(jī)體免疫抑制活性,有助于異位組織逃避機(jī)體免疫系統(tǒng),促進(jìn)異位組織侵入后的血管生成[22]。亦有研究發(fā)現(xiàn)ICAM-1介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,促發(fā)炎性反應(yīng),一方面聚集的白細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)和化學(xué)物質(zhì),可引起血管內(nèi)皮損傷,另一方面也可以促進(jìn)缺血組織炎癥血管新生[23],炎癥反應(yīng)對缺血組織的這種雙重作用以哪種為主與缺血的程度和時(shí)間相關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示,體外震波處理HUVECs在0.03~0.09 mJ/mm2能量時(shí)促進(jìn)ICAM-1mRNA的表達(dá),而Western blot檢測發(fā)現(xiàn)只有0.09 mJ/mm2能量時(shí)才表達(dá)ICAM-1蛋白,出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能與較低的能量使細(xì)胞出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)低,只出現(xiàn)基因水平的變化,而適宜的能量不僅出現(xiàn)基因水平的變化,而且出現(xiàn)蛋白質(zhì)水平的變化,認(rèn)為體外震波促進(jìn)ICAM-1的表達(dá)在促進(jìn)血管新生中起到重要作用,此時(shí)作為炎性因子正面作用更大。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,體外震波能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,提高黏附因子ICAM-1的表達(dá)而參與血管新生,且0.09 mJ/mm2為最佳能量。但本實(shí)驗(yàn)僅檢測了具有代表性的黏附因子ICAM-1,震波作用后與血管新生相關(guān)的其他細(xì)胞因子、酶、基因等也有待進(jìn)一步研究。

    [1] Nishida T, Shimokawa H, Oi K, et al。 Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia induced-myocardial dysfunction in pigs in vivo。 Circulation, 2004, 110: 3055-3061.

    [2] Uwatoku T, Ito K, Abe K, et a1. Extracorporeal cardiac shock wave therapy proves left ventficular remodeling after acute myocardial infarction in pigs。 Coron Artery Dis, 2007, 18: 397-404.

    [3] Kikuchi Y, Ito K, Ito Y, et al。 Double-blind and placebo-controlled study of the effectiveness and safety of extracorporeal cardiac shock wave therapy for severe angina pectoris。 Circ J, 2010, 74: 589-591.

    [4] 周超, 王靜, 龐璽倬, 等。 體外心臟震波治療冠心病新進(jìn)展。 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 287-289.

    [5] Folkman J, Shing Y。 Angiogenesis。 J Biol Chem, 1992, 267: 10931-10934.

    [6] Dimmeler S, Zeiher AM。 Endothelial cell apoptosis in angiogenesis and vessel regression. Circulation Res, 2000, 87: 434-439.

    [7] Lorier G, Tourino C, Kalil RA。 Coronary angiogenesis as an endogenous response to myocardial ischemia in adults。 Arq Bras Cardiol, 2011, 97: e140-e148.

    [8] Hoefer IE, van Royen N, Rectenwald JE, et al。 Arteriogenesis proceeds via ICAM-1/Mac-1- mediated mechanisms。 Circ Res, 2004, 94: 1179-1185.

    [9] Lei H, Weihua C, Jichao Y, et al。 Sodium valproate inhibits proliferation in rat neural stem cells through p21 pathway。 J Third Military Medical University, 2013, 6: 487-490.

    [10] 魏子寒, 王穎, 楊國杰, 等。 磷酸肌酸鈉對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響及機(jī)制研究。 中國循環(huán)雜志, 2014, 29: 738-742.

    [11] 曹娜, 葛力萁, 程明月, 等。 阿托伐他汀通過SIRT1/NADPH 氧化酶對抗高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷作用。 中國循環(huán)雜志, 2014, 29: 1000-1004.

    [12] Livak KJ, Schmittgen TD。 Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2( -Delta Delta C( T) ) Method。 Methods, 2001, 25: 402-408.

    [13] 史彤彤, 程明月, 張超群, 等。 白藜三醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響及其可能機(jī)制。 中國循環(huán)雜志, 2014, 29: 643-646.

    [14] Fukumoto Y, Ito A, Uwatoku T, et al。 Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease。 Coron Artery Dis, 2006, 17: 63-70.

    [15] Carmeliet P, Jain RK。 Angiogenesis in cancer and other diseases。 Nature, 2000, 407: 249-257.

    [16] 馬潔, 周召鋒, 徐晤, 等。 白藜蘆醇對兔心肌梗死后血管新生的誘導(dǎo)作用。 中國循環(huán)雜志, 2011, 26: 141-144.

    [17] Ito K, Fukumoto Y, Shimokawa K。 Extracorporeal shock wave therapy for ischemic cardiovascular disorders。 Am J Cardiovasc Drugs, 2011, 11: 295-302.

    [18] Mariotto S, Cavalieri E, Amelio E, et al。 Extracorporeal shock waves: from lithotripsy to anti-inflammatory action by NO production. Nitric Oxide, 2005, 12: 89-96.

    [19] Suhr F, Delhasse Y, Bungartz G, et al。 Cell biological effects of mechanical stimulations generated by focused extracorporeal shock wave applications on cultured human bone marrow stromal cells。 Stem Cell Res, 2013, 11: 951-964.

    [20] Zhao Y, Wang J, Wang M, et al。 Activation of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells-a new mechanism of defocused low-energy shock wave in regenerative medicine。 Cytotherapy, 2013, 15: 1449-1457.

    [21] 王靜, 周超, 郭濤。 心臟震波聯(lián)合干細(xì)胞治療在心血管領(lǐng)域的運(yùn)用展望。 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 602-604.

    [22] Griffioen AW。 Anti-angiogenesis: making the tumor vulnerable to the immune system。 Cancer Immunol Immunother, 2008, 57: 1553-1558.

    [23] 宋宜慧, 黃熙。 細(xì)胞間黏附分子-1與血管生成的研究進(jìn)展。 免疫學(xué)雜志, 2012, 23: 530-533.

    Effect of Extracorporeal Shock Wave on Proliferation, Cell Cycle and Intercellular Adhesion Molecule-1 Expression in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

    MA Yi-ming, LI Li, CAI Hong-yan, HU Zhao, GUO Tao。
    Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming (650000), Yunnan, China Corresponding Author: CAI Hong-yan, Email: hyflykm@sina.com。

    Objective: To observe the effect of extracorporeal shock wave therapy (ESWT) on proliferation, cell cycle and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)。Methods: HUVECs were cultured in vitro at the concentration of (1X105/ml) and the cells were divided into 2 sets of groups: CSWT group, the cells were treated by different energy of (0.03, 0.09, 0.18, 0.24) mJ/mm2respectively and corresponding Control group, in which the cells had no CSWT。 HUVEC proliferation was detected by CCK colorimetric method, cell cycle was measured by flow cytometry, mRNA and protein expressions of ICAM-1 were examined by RT-PCR and Western blot analysis respectively。Results: Compared with Control group, (0.09 mJ/mm2) CSWT group had promoted HUVECs proliferation, P<0.05 and the other CSWT groups were similar to corresponding Control groups, P>0.05; (0.09 mJ/mm2) CSWT group showed decreasedproportion of G0/G1 stage and increased S and G2/M stages, all P<0.05; while (0.03 mJ/mm2) CSWT group only increased the proportion of G2/M stage, P<0.05 and the other CSWT groups were similar to corresponding Control group, P>0.05. Compared with Control group, (0.09 mJ/mm2) and (0.03mJ/mm2) CSWT groups showed increased mRNA expression of ICAM-1 (9.27±0.95) vs (1.02±0.27), P<0.001 and (7.08±0.60) vs (1.02±0.27), P<0.01; (0.09 mJ /mm2) CSWT group had elevated protein expression of ICAM-1, P<0.05.Conclusion: ESWT especially at (0.09 mJ/mm2) may accelerate cell cycle transition from G0/G1 stage to S and G2/M stages, promote HUVECs proliferation and increase ICAM-1 expression which may play important roles in ESWT facilitated angiogenesis in vitro。

    Extracorporeal shock wave therapy; Human umbilical vein; Endothelial cells; Cell cycle;

    2016-01-24)

    (編輯:王寶茹)

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260027);云南省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012WS005);云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014FZ023);云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金(2013FB128)

    650000 云南省昆明市,昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科

    馬一銘 碩士研究生 主要從事冠心病介入治療研究 Email:mymkm@sina.com 通訊作者:蔡紅雁 Email:hyflykm@sina.com

    R54

    A

    1000-3614(2016)10-1013-05

    10.3969/j.issn.1000-3614.2016.10.016

    猜你喜歡
    細(xì)胞周期內(nèi)皮細(xì)胞新生
    重獲新生 庇佑
    中國慈善家(2022年1期)2022-02-22 21:39:45
    淺議角膜內(nèi)皮細(xì)胞檢查
    紅霉素聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響
    堅(jiān)守,讓百年非遺煥新生
    海峽姐妹(2017年7期)2017-07-31 19:08:23
    雌激素治療保護(hù)去卵巢對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的初步機(jī)制
    NSCLC survivin表達(dá)特點(diǎn)及其與細(xì)胞周期的關(guān)系研究
    X線照射劑量率對A549肺癌細(xì)胞周期的影響
    細(xì)胞微泡miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控
    新生娃萌萌噠
    視野(2015年4期)2015-07-26 02:56:52
    熊果酸對肺癌細(xì)胞株A549及SPCA1細(xì)胞周期的抑制作用
    免费人成在线观看视频色| 最新在线观看一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产精品国产高清国产av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 免费在线观看亚洲国产| 性色av乱码一区二区三区2| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产精品综合久久久久久久免费| 女同久久另类99精品国产91| 免费av观看视频| 亚洲人成网站在线播| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 亚洲第一电影网av| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品三级大全| 亚洲av免费在线观看| 国产三级在线视频| 久久香蕉精品热| 一本综合久久免费| netflix在线观看网站| 国产久久久一区二区三区| 国产69精品久久久久777片| 男人的好看免费观看在线视频| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲国产高清在线一区二区三| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 99热这里只有是精品在线观看 | 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品一区二区免费欧美| 男人狂女人下面高潮的视频| 一进一出抽搐动态| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日韩欧美免费精品| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜影院日韩av| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲成人免费电影在线观看| 黄色配什么色好看| 国产色婷婷99| 校园春色视频在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 男女视频在线观看网站免费| 久久99热这里只有精品18| 亚洲精品亚洲一区二区| 午夜两性在线视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 中出人妻视频一区二区| xxxwww97欧美| 毛片女人毛片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 嫩草影院精品99| 亚洲,欧美精品.| 国产免费av片在线观看野外av| 婷婷色综合大香蕉| 久久精品国产自在天天线| 床上黄色一级片| 亚洲黑人精品在线| 色噜噜av男人的天堂激情| 悠悠久久av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 白带黄色成豆腐渣| 国产探花极品一区二区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久人妻av系列| x7x7x7水蜜桃| 国产日本99.免费观看| 日韩亚洲欧美综合| 日本一二三区视频观看| а√天堂www在线а√下载| 成人特级av手机在线观看| 成年女人永久免费观看视频| 有码 亚洲区| 天堂√8在线中文| 热99在线观看视频| 午夜影院日韩av| 久久人人精品亚洲av| 永久网站在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产毛片a区久久久久| 91狼人影院| 在线播放无遮挡| 波多野结衣巨乳人妻| 99精品在免费线老司机午夜| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产成人a区在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 人妻久久中文字幕网| xxxwww97欧美| 色视频www国产| 国产成人av教育| 男人和女人高潮做爰伦理| 午夜精品久久久久久毛片777| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 直男gayav资源| 美女高潮的动态| 熟女人妻精品中文字幕| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产亚洲av嫩草精品影院| 男人的好看免费观看在线视频| 国产精华一区二区三区| 1024手机看黄色片| 亚洲欧美日韩高清专用| 午夜福利视频1000在线观看| 禁无遮挡网站| 国产亚洲精品久久久com| 国产亚洲精品久久久com| 欧美成狂野欧美在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 可以在线观看的亚洲视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成人无遮挡网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产大屁股一区二区在线视频| 少妇的逼水好多| 熟女电影av网| 久久亚洲精品不卡| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲av熟女| 免费在线观看成人毛片| 国产在线精品亚洲第一网站| 成人国产综合亚洲| 此物有八面人人有两片| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲av第一区精品v没综合| 一级av片app| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品一及| 国产视频内射| 国产精品亚洲一级av第二区| 日韩欧美免费精品| 久久伊人香网站| 一区二区三区激情视频| 淫秽高清视频在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 不卡一级毛片| 深爱激情五月婷婷| 又爽又黄a免费视频| 色哟哟哟哟哟哟| 嫩草影院精品99| 亚洲人成网站在线播| 成年女人看的毛片在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 亚洲人成网站在线播| 成年女人看的毛片在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美高清性xxxxhd video| 国产精品一区二区性色av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费看日本二区| 在线a可以看的网站| 一二三四社区在线视频社区8| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 精品乱码久久久久久99久播| 极品教师在线视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲av一区综合| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 午夜福利高清视频| www.www免费av| 日日夜夜操网爽| 色在线成人网| 国产成人影院久久av| 赤兔流量卡办理| avwww免费| 欧美成狂野欧美在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美成狂野欧美在线观看| 色5月婷婷丁香| 亚洲综合色惰| 久久久国产成人精品二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 一夜夜www| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲色图av天堂| 麻豆国产97在线/欧美| 免费看日本二区| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美性感艳星| 国产欧美日韩精品一区二区| 草草在线视频免费看| 日韩 亚洲 欧美在线| 婷婷亚洲欧美| av在线天堂中文字幕| 国产大屁股一区二区在线视频| 午夜免费成人在线视频| 国产亚洲精品久久久com| 久久久久久久久久成人| 亚洲自偷自拍三级| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产乱人视频| 高清毛片免费观看视频网站| 国产探花极品一区二区| www.999成人在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品国产亚洲在线| 久久久久久久精品吃奶| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 色吧在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 91字幕亚洲| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美日本视频| 亚洲熟妇熟女久久| 精品久久久久久久久久久久久| 国产三级中文精品| 国模一区二区三区四区视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲最大成人av| 在线播放国产精品三级| 久久人人精品亚洲av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲自拍偷在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美精品啪啪一区二区三区| av在线天堂中文字幕| 国产成人a区在线观看| 日韩中字成人| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 搡老妇女老女人老熟妇| 中文字幕高清在线视频| 88av欧美| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲美女视频黄频| 成年女人毛片免费观看观看9| 一级黄色大片毛片| 国产黄a三级三级三级人| 直男gayav资源| 国产三级中文精品| 亚洲av免费高清在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲av.av天堂| 国产单亲对白刺激| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲精品久久国产高清桃花| 老司机深夜福利视频在线观看| 精品久久国产蜜桃| 中文字幕久久专区| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲成a人片在线一区二区| 国内精品美女久久久久久| 成人午夜高清在线视频| 亚洲无线观看免费| 嫩草影院精品99| 午夜精品一区二区三区免费看| eeuss影院久久| 国产成人aa在线观看| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品一及| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 能在线免费观看的黄片| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲av熟女| 免费av观看视频| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲第一电影网av| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲自拍偷在线| 国产麻豆成人av免费视频| 女同久久另类99精品国产91| 欧美成人一区二区免费高清观看| 一个人看的www免费观看视频| 乱人视频在线观看| 9191精品国产免费久久| 色综合站精品国产| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲精品成人久久久久久| 最后的刺客免费高清国语| 免费av观看视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产真实乱freesex| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 精品午夜福利在线看| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 免费在线观看成人毛片| 婷婷精品国产亚洲av在线| 成人av在线播放网站| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲av一区综合| 欧美高清成人免费视频www| 国产黄a三级三级三级人| 十八禁国产超污无遮挡网站| 黄色女人牲交| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲国产精品sss在线观看| 一级黄片播放器| 欧美一区二区精品小视频在线| 禁无遮挡网站| 欧美日韩黄片免| 成人无遮挡网站| 亚洲av五月六月丁香网| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲经典国产精华液单 | 久久精品91蜜桃| 色精品久久人妻99蜜桃| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲av一区综合| 在线观看舔阴道视频| 国产一区二区在线av高清观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产91精品成人一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 男人舔女人下体高潮全视频| 日韩欧美在线二视频| 午夜福利欧美成人| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲精品456在线播放app | 天美传媒精品一区二区| 国产免费男女视频| 欧美成人性av电影在线观看| 少妇高潮的动态图| 亚洲黑人精品在线| av天堂中文字幕网| 亚洲欧美清纯卡通| 身体一侧抽搐| 成人av在线播放网站| 我的老师免费观看完整版| 亚洲欧美清纯卡通| 一区二区三区激情视频| 精品欧美国产一区二区三| 国产午夜福利久久久久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 午夜两性在线视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产极品精品免费视频能看的| 两个人视频免费观看高清| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 一a级毛片在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成年女人看的毛片在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美日韩综合久久久久久 | 可以在线观看的亚洲视频| 91久久精品电影网| bbb黄色大片| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产乱人视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲精品在线观看二区| 国产单亲对白刺激| 一区福利在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 久久久成人免费电影| 精品久久久久久久久久久久久| 他把我摸到了高潮在线观看| 午夜久久久久精精品| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲国产精品久久男人天堂| 我的女老师完整版在线观看| 天堂影院成人在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品一区二区免费欧美| 天堂动漫精品| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 午夜福利免费观看在线| 特级一级黄色大片| 老鸭窝网址在线观看| 在线观看66精品国产| 国产精品久久视频播放| 999久久久精品免费观看国产| 好男人在线观看高清免费视频| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美色视频一区免费| av在线蜜桃| av女优亚洲男人天堂| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 精华霜和精华液先用哪个| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美在线黄色| av黄色大香蕉| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 成人一区二区视频在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 老司机福利观看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲在线自拍视频| a级毛片a级免费在线| 亚洲午夜理论影院| 国产黄色小视频在线观看| 黄色配什么色好看| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲成人久久性| 午夜激情福利司机影院| 五月伊人婷婷丁香| 国产大屁股一区二区在线视频| 五月玫瑰六月丁香| 免费av观看视频| 男女之事视频高清在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 十八禁人妻一区二区| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 色在线成人网| 直男gayav资源| 男女床上黄色一级片免费看| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美在线黄色| 成年免费大片在线观看| 国产黄片美女视频| 永久网站在线| 亚洲av熟女| 婷婷亚洲欧美| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲第一电影网av| 成人三级黄色视频| 午夜激情欧美在线| 久久国产精品影院| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日本黄色片子视频| 日韩人妻高清精品专区| 天美传媒精品一区二区| 日韩大尺度精品在线看网址| 免费av毛片视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 色在线成人网| 99精品久久久久人妻精品| 免费无遮挡裸体视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲经典国产精华液单 | 国产毛片a区久久久久| 免费看美女性在线毛片视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| www.999成人在线观看| 观看免费一级毛片| 国产欧美日韩一区二区三| 日韩欧美在线二视频| eeuss影院久久| 成人鲁丝片一二三区免费| 无人区码免费观看不卡| 一进一出抽搐gif免费好疼| 毛片女人毛片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 中文字幕av在线有码专区| 免费看美女性在线毛片视频| 精品不卡国产一区二区三区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精华霜和精华液先用哪个| 国产大屁股一区二区在线视频| 精品久久国产蜜桃| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲五月婷婷丁香| av在线观看视频网站免费| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲18禁久久av| 欧美日本视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美一区二区精品小视频在线| 又爽又黄无遮挡网站| 一进一出好大好爽视频| 人人妻人人看人人澡| 欧美zozozo另类| 欧美日韩黄片免| 国产亚洲欧美98| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产乱人伦免费视频| 好男人在线观看高清免费视频| 村上凉子中文字幕在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲av二区三区四区| 欧美日韩福利视频一区二区| 五月伊人婷婷丁香| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲av一区综合| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 色噜噜av男人的天堂激情| av黄色大香蕉| 国产91精品成人一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 91av网一区二区| 极品教师在线视频| 美女大奶头视频| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩中字成人| 99热这里只有精品一区| 婷婷六月久久综合丁香| 直男gayav资源| 国产成年人精品一区二区| a级一级毛片免费在线观看| 两个人视频免费观看高清| 欧美区成人在线视频| 亚洲欧美激情综合另类| 黄色女人牲交| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 午夜免费成人在线视频| 直男gayav资源| 午夜福利免费观看在线| 一级黄色大片毛片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲综合色惰| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲专区国产一区二区| x7x7x7水蜜桃| 国产91精品成人一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 夜夜躁狠狠躁天天躁| 最近中文字幕高清免费大全6 | 五月伊人婷婷丁香| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久热精品热| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 淫秽高清视频在线观看| 国产视频一区二区在线看| 成年免费大片在线观看| 国产成年人精品一区二区| 看免费av毛片| 毛片一级片免费看久久久久 | 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 岛国在线免费视频观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产老妇女一区| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美精品国产亚洲| 日本熟妇午夜| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久99热这里只有精品18| 中文资源天堂在线| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲成人中文字幕在线播放| 丁香六月欧美| 在线观看午夜福利视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品久久电影中文字幕| 久久久久久久午夜电影| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 又爽又黄无遮挡网站| 哪里可以看免费的av片| 伦理电影大哥的女人| 国产中年淑女户外野战色| 色吧在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| av女优亚洲男人天堂| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美日本视频| 好男人在线观看高清免费视频| 午夜福利欧美成人| 18+在线观看网站| 久久九九热精品免费| 在线观看一区二区三区| netflix在线观看网站| 欧美乱妇无乱码| 久久亚洲精品不卡| 9191精品国产免费久久| 久久久色成人| 日韩欧美精品v在线| 亚洲三级黄色毛片| 69人妻影院| 大型黄色视频在线免费观看| www.熟女人妻精品国产| 亚洲性夜色夜夜综合| 精品一区二区三区人妻视频| 久久伊人香网站| 观看美女的网站| 国产高清视频在线播放一区| 久久精品国产亚洲av天美| 超碰av人人做人人爽久久| 午夜福利高清视频| 又爽又黄a免费视频| 观看美女的网站| 大型黄色视频在线免费观看| av黄色大香蕉| 成人午夜高清在线视频| av天堂在线播放| 亚洲在线观看片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 成人av一区二区三区在线看|