反相高效液相色譜法測定大鼠血漿中奧沙利鉑的質(zhì)量濃度

劉 劍，張志清，楊秀嶺

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000）

反相高效液相色譜法測定大鼠血漿中奧沙利鉑的質(zhì)量濃度

劉 劍，張志清，楊秀嶺

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000）

目的 建立測定大鼠血漿中奧沙利鉑質(zhì)量濃度的反相高效液相色譜（RP－HPLC）法。方法 色譜柱為DiamonsilTMC18柱（250 mm× 4．6 mm，5 m），流動相為乙腈－水（7∶93），檢測波長為210 nm，流速為0．8m L／min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 L。結(jié)果 奧沙利鉑保留時(shí)間為8．51min，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y＝8 035．7X－11 791（r＝0．999 5），線性范圍為2．0～160．0 g／mL。低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度奧沙利鉑血漿樣品的方法回收率分別為（112．7±3．61）%，（102．8±3．33）%，（101．6±4．60）%，RSD分別為3．20%，3．24%，4．53%；低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度奧沙利鉑血漿樣品的提取回收率分別為（79．84±2．01）%，（82．29±3．28）%，（84．89±3．35）%，RSD分別為2．51%，3．98%，3．95%。血漿樣品在－40℃反復(fù)凍融3次后性質(zhì)穩(wěn)定，對測定無影響。測定10只大鼠血漿樣品中奧沙利鉑的平均質(zhì)量濃度為（67．4±10．45） g／m L。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，可為大鼠血漿中奧沙利鉑的質(zhì)量濃度測定提供方法學(xué)參考。

反相高效液相色譜法；大鼠；血漿；奧沙利鉑；血藥濃度

奧沙利鉑（L－OHP）為第3代鉑類抗癌藥物，毒性較低，安全性良好，是大腸癌的有效抗腫瘤藥物，美國食品藥物管理局（FDA）于2004年1月批準(zhǔn)了奧沙利鉑聯(lián)合方案作為晚期結(jié)直腸癌的一線方案[1]。此外，奧沙利鉑對卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、淋巴瘤、頭頸部腫瘤等也有客觀療效[2]。關(guān)于奧沙利鉑主藥含量測定及雜質(zhì)和其他成分測定已有相關(guān)報(bào)道[3－7]，新劑型脂質(zhì)體中含量測定也有部分研究[8－9]，但未見大鼠體內(nèi)奧沙利鉑質(zhì)量濃度測定方法的研究。為此，本研究中采用反相高效液相色譜－紫外檢測法（RP－HPLC－UV）測定大鼠血漿樣品中奧沙利鉑的藥物濃度，并探索和改進(jìn)方法，為今后研究提供方法學(xué)參考。

1 儀器、試藥與動物

Waters高效液相色譜儀，包括Waters－515型高壓泵、7725i型進(jìn)樣閥（Rhedyne）、Waters－486型紫外檢測器、Empower Application型操作平臺（美國 Waters公司）；CPA2250型電子天平（Sartorius）；MDF－U2086S型低溫冰箱（日本三洋）；XW－80A型渦旋混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；D37520型高速離心機(jī)（美國雅培）；AP－01P型抽濾泵（天津市協(xié)同儀器有限公司）；KQ－300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。注射用奧沙利鉑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號為13011311）；奧沙利鉑對照品（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號為619111204，純度99．8%）；帕洛諾司瓊（歐賽，齊魯制藥＜海南＞有限公司，批號為B1G1206005）；乙腈為色譜純，高氯酸溶液為分析純，蒸餾水。健康W istar大鼠，清潔級，雄性，體重（170±10）g，均由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SCXK（冀）2008－1－003。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：DiamonsilTMC18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；流動相：乙腈－水（7∶93）；檢測波長：210 nm；流速：0．8mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

2．2 溶液制備

精密稱取奧沙利鉑對照品200．0mg，置100m L容量瓶中，加水至刻度并搖勻，得質(zhì)量濃度為2 000．0μg／mL的奧沙利鉑貯備液；分別精密量取奧沙利鉑貯備液適量，制成質(zhì)量濃度為 1 600．0，1 000．0，800．0，500．0，200．0，100．0，50．0，20．0μg／mL的系列對照品溶液。

2．3 血漿樣品處理

空白血漿制備：大鼠眼眶取血，將所取空白血置涂有肝素的離心管中，離心2 min(10 000 r／min)，吸取上清液，即得空白血漿，立即貯存于－40℃的冰箱，備用。

血漿樣品處理：取血漿200μL，置2 m L塑料離心管中，加入6%高氯酸溶液160μL，渦旋振蕩0．5 min，離心2 min（10 000 r／min），吸取上清液20μL進(jìn)樣，并采用高效液相色譜（HPLC）法分析。

2．4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：將奧沙利鉑對照品溶液直接進(jìn)樣；另取空白血漿、空白血漿＋奧沙利鉑對照品及血漿樣品按擬訂方法處理并測定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾奧沙利鉑的測定，色譜峰分離良好，奧沙利鉑的保留時(shí)間為8．51min。

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密量取2．2項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的對照品溶液20μL，置2m L塑料離心管中，加入空白血漿180μL，制成質(zhì)量濃度分別為160．0，100．0，80．0，50．0，20．0，10．0，5．0，2．0μg／m L的模擬血漿樣品，按擬訂方法處理并測定。以奧沙利鉑峰面積（Y）對血漿藥物質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y＝8 035．7X－11 791，r＝0．999 5（n＝8）。結(jié)果表明，奧沙利鉑檢測質(zhì)量濃度在2．0～160．0μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。定量下限為2μg／m L。

精密度試驗(yàn)：精密量取質(zhì)量濃度為50，200，1000μg／m L的奧沙利鉑對照品溶液20μL各5份，加入180μL空白血漿，制成5．0，20．0，100．0μg／m L3種質(zhì)量濃度的奧沙利鉑模擬血漿樣品，按擬訂方法處理并測定，于同日內(nèi)測定5次，計(jì)算日內(nèi) RSD；另每日測定1次，連續(xù)測定5 d，計(jì)算日間RSD。結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（s，n＝5）

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（s，n＝5）

日內(nèi)精密度 日間精密度加入量（ g／m L）5．0 20．0 100．0測得量（ g／mL）5．7±0．23 20．6±0．66 100．0±4．35 RSD（%）4．07 3．21 4．35測得量（ g／m L）5．7±0．21 20．6±0．66 99．9±2．88 RSD（%）3．64 3．23 2．88

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取質(zhì)量濃度為200．0μg／mL的奧沙利鉑對照品溶液20μL，加入180μL空白血漿，制成質(zhì)量濃度為20．0μg／m L的奧沙利鉑模擬血漿樣品，按擬訂方法處理，處理時(shí)間分別為即刻處理和反復(fù)凍融3次后處理，結(jié)果的 RSD為1．67%。另外，同上操作配制質(zhì)量濃度為20．0μg／mL的奧沙利鉑模擬血漿樣品即刻處理后，分別在室溫和0℃放置0，0．5，1，2，3，4 h后測定并計(jì)算，結(jié)果的 RSD分別為41．85%和7．15%，表明奧沙利鉑在室溫放置環(huán)境下不穩(wěn)定，在其他考察條件下性質(zhì)穩(wěn)定。

回收率試驗(yàn)：精密量取質(zhì)量濃度為50．0，200．0，1 000．0μg／mL的奧沙利鉑對照品溶液20μL各5份，加入180μL空白血漿，制成5．0，20．0，100．0μg／m L 3種質(zhì)量濃度的奧沙利鉑模擬血漿樣品各5份，按擬訂方法處理并測定，測得峰面積（A）并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求得奧沙利鉑實(shí)際質(zhì)量濃度（B），并與配制質(zhì)量濃度（C）做比較，計(jì)算方法回收率（B／C）。精密量取質(zhì)量濃度為50．0，200．0，1 000．0μg／mL的奧沙利鉑對照品溶液20μL各5份，加入180μL蒸餾水，制成5．0，20．0，100．0μg／m L 3種質(zhì)量濃度的奧沙利鉑樣品各5份，按擬訂方法處理并測定，測得峰面積（D），然后計(jì)算提取回收率（A／D）。結(jié)果見表2。

表2 奧沙利鉑回收試驗(yàn)結(jié)果（s，%，n＝5）

表2 奧沙利鉑回收試驗(yàn)結(jié)果（s，%，n＝5）

方法回收率加入量 提取回收率（ g／m L）5．0 20．0 100．0回收率112．7±3．61 102．8±3．33 101．6±4．60 RSD 3．20 3．24 4．53加收率79．84±2．01 82．29±3．28 84．89±3．35 RSD 2．51 3．98 3．95

2．5 血漿樣品測定

精密稱取注射用奧沙利鉑50．0mg，溶于7m L蒸餾水中，制備相應(yīng)質(zhì)量濃度的奧沙利鉑溶液。取大鼠10只，根據(jù)文獻(xiàn)[10]推算大鼠給藥量，奧沙利鉑為23．1mg／kg，用1mL注射器尾靜脈給藥，且均在給藥后即刻由眼底靜脈叢取血 0．5 m L，置涂有肝素的離心管中，離心2 min(10 000 r／min)，吸取上清液即刻按擬訂方法處理，分別進(jìn)行測定。結(jié)果10只大鼠血漿樣品中奧沙利鉑的質(zhì)量濃度分別為65．2，62．2，71．5，58．6，77．6，59．7，47．6，77．6，78．6，75．8μg／mL，平均質(zhì)量濃度為（67．4±10．45）μg／mL。

3 討論

3．1 流動相的選擇

比較了甲醇－水和乙腈－水，結(jié)果表明，選用甲醇－水作流動相時(shí)，血漿雜質(zhì)峰較多，不能與奧沙利鉑色譜峰較好地分離；而選用乙腈－水作流動相時(shí)，可得到峰形良好的單峰，且與血漿內(nèi)源性物質(zhì)分離完全，保留時(shí)間適中，有利于試驗(yàn)順利進(jìn)行。故選用乙腈－水(7∶93)為流動相。

3．2 血漿樣品的處理

因流動相中含有乙腈，故擬訂使用乙腈沉淀蛋白，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用乙腈沉淀蛋白處理血漿樣品時(shí)奧沙利鉑測得質(zhì)量濃度很小，不利于樣品的測定。鄭仁娟等[11]的研究結(jié)果顯示，奧沙利鉑最穩(wěn)定的pH為4．2，偏酸或偏堿均會加速其水解。趙雁等[12]的研究結(jié)果顯示，改用6%高氯酸溶液沉淀蛋白效果良好，奧沙利鉑的質(zhì)量濃度有明顯改善，有利于樣品的測定。

3．3 方法學(xué)考察

考慮到藥物在大鼠全血中會降解[12－13]，以及經(jīng)處理后在室溫放置下性質(zhì)不穩(wěn)定，為避免樣品測定受到影響，所有血漿樣品應(yīng)即刻處理即時(shí)測定。

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M ass Concentration Determ ination of Oxalip latin in Plasm a of Rats by RP－HPLC

Liu Jian，Zhang Zhiqing，Yang Xiuling
（The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei，China 050000）

Objective To establish a RP－HPLC method for determining the mass concentration of oxaliplatin in plasma of rats．M ethods The DiamonsilTMC18column（250 mm×4．6 mm，5μm）was used with mobile phase consisted of acetonitrile－water（7∶93）at the flow rate of 0．8 mL／min，the detection wavelength was set at 210 nm and column temperature was 30℃，and the injection volume was 20μL．Resu lts The retention time of oxaliplatin was 8．51 min．the standard curve was Y＝8 035．7 X－11 791（r＝0．999 5）with a linearity range of 2．0－160．0 μg／mL．The recovery rate of method of low，midd le and high concentration were（112．7± 3．61）%，（102．8±3．33）%，（101．6±4．60）%，RSD were 3．20%，3．24% and 4．53%，respectively；the recovery rate of extraction of low，middle and high concentration were（79．84±2．01）%，（82．29±3．28）%，（84．89±3．35）%，RSD were 2．51%，3．98% and 3．95%，respectively．The plasma samples were stable when stored at－40℃ for freeze－thaw for thrice and the processed samples were stable，but were unstable at room temperature．The average of plasma concentration in 10 rats were（67．4±10．45）μg／mL．Conclusion The method is accurate，simple and has high sensitivity and reproducibility．It can provide methodology reference for the determination of oxaliplatin concentration in plasma of rats．

RP－HPLC；rats；plasma；Oxaliplatin；plasma concentration

R965；R979．1

A

1006－4931(2016)04－0054－03

劉劍（1979－），碩士研究生，主管藥師，研究方向?yàn)樗巹訉W(xué)和藥物體內(nèi)相互作用，（電話）0311－66003452（電子信箱）ljhaiyang＠aliyun．com。

2015－07－05)