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    螯合劑對(duì)鎂基骨水泥體外細(xì)胞毒性的影響

    2016-12-24 03:34:13楊在君康泰然彭正松黎云祥彭紅衛(wèi)廖詠梅
    關(guān)鍵詞:螯合劑氧化鎂主料

    張 莉,楊在君 ,丁 祥,康泰然,彭正松,黎云祥,楊 軍,彭紅衛(wèi),2,廖詠梅

    (1.西華師范大學(xué) 組織修復(fù)材料工程技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,四川 南充 637009;2.成都達(dá)普醫(yī)療器械有限公司,成都 610000)

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    螯合劑對(duì)鎂基骨水泥體外細(xì)胞毒性的影響

    張 莉1,楊在君1,丁 祥1,康泰然1,彭正松1,黎云祥1,楊 軍1,彭紅衛(wèi)1,2,廖詠梅1

    (1.西華師范大學(xué) 組織修復(fù)材料工程技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,四川 南充 637009;2.成都達(dá)普醫(yī)療器械有限公司,成都 610000)

    為提高鎂基骨水泥的生物相容性,探討了螯合劑,如:三聚磷酸鈉、六偏磷酸鈉、EDTA、L-Cys、L-Lys、L-Arg和L-Glu對(duì)鎂基骨水泥體外細(xì)胞毒性的影響。同時(shí),研究了主料A(氧化鎂和磷酸二氫鉀)和輔料B(蔗糖、羥基磷灰石和螯合劑)的加入順序?qū)︽V基骨水泥體外細(xì)胞毒性的影響。結(jié)果表明,螯合劑的加入可以明顯提高細(xì)胞的增殖率,其中三聚磷酸鈉的效果最為顯著,細(xì)胞增殖率達(dá)到119.6%。主料A和輔料B的加入順序?qū)︽V基骨水泥的體外細(xì)胞毒性也有較大的影響。因此,在鎂基骨水泥的制備過程中正確的制備方法是:先將主料A與固化液混合,攪拌成漿體后再加入輔料B,繼續(xù)攪拌均勻后備用。

    鎂基骨水泥;體外細(xì)胞毒性;螯合劑

    不穩(wěn)定骨折、因骨質(zhì)疏松而引發(fā)的骨折一直都是擺在外科醫(yī)生面前的難題,不僅要求醫(yī)生高超的手術(shù)技能,更依賴于性能優(yōu)異的骨修復(fù)材料[1,2]。目前的治療方法主要是切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù),而與這種手術(shù)配合使用的生物醫(yī)療材料有鋼鐵合金、尼龍線、可吸收高分子螺釘?shù)取_@些材料都存在一定的不足和不同程度的異物反應(yīng),甚至使用后期會(huì)釋放有毒有害物質(zhì),需要二次手術(shù)取出內(nèi)固定物。為了克服這種二次手術(shù)帶給病人的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),加快病人的骨愈合,骨修復(fù)材料領(lǐng)域迫切需要一種在人體內(nèi)可降解、粘結(jié)性好、強(qiáng)度高的骨粘合材料。

    目前,市面上的骨填充材料主要為磷酸鈣基填料和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。磷酸鈣基填料雖具有較好的生物相容性,但由于具有較高的鈣磷比,使得它們的體內(nèi)降解性較差。同時(shí),磷酸鈣基填料在凝固時(shí)不會(huì)膨脹,不具有粘接功能,因此不適用于韌帶之類的軟組織與骨的連接[3]。PMMA具有較強(qiáng)的粘接能力,但它屬于惰性的硬化聚合物,不具有降解性和促進(jìn)新骨生長(zhǎng)的功能。況且,PMMA在固化過程中放出大量的熱,從而導(dǎo)致周圍細(xì)胞死亡。

    磷酸鎂水泥(MPC)具有早期強(qiáng)度高、凝固時(shí)間短、耐磨性好等優(yōu)異性能,主要用于機(jī)場(chǎng)、道路的搶修、核廢料的固化以及近幾年才出現(xiàn)的受損骨的修復(fù)[4]。這種骨修復(fù)材料具有和磷酸鈣骨水泥一樣的生物相容性,能夠誘導(dǎo)骨再生,經(jīng)適當(dāng)改性后具有很高的強(qiáng)度,可作為牙科修復(fù)材料,對(duì)礦質(zhì)表面、金屬表面具有很強(qiáng)的粘附力,亦可作為骨粘合修復(fù)材料,是近年生物無機(jī)水泥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5]。目前研究較多的是采用磷酸二氫氨的銨鹽型鎂基骨水泥[6,7]。但是,銨鹽型鎂基骨水泥在制作過程中會(huì)產(chǎn)生刺激性的氨氣,造成環(huán)境污染。同時(shí),銨鹽型骨水泥在體內(nèi)也會(huì)釋放出氨氣,對(duì)細(xì)胞具有毒害作用,導(dǎo)致生物相容性相對(duì)較差[8]。除銨鹽型鎂基骨水泥外,2009年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了一個(gè)采用磷酸二氫鉀的鉀鹽型鎂基骨水泥。近年來,國(guó)內(nèi)有些學(xué)者對(duì)鉀鹽型鎂基骨水泥進(jìn)行了改進(jìn),如中國(guó)專利CN 102488921 A公開了一種提高鉀鹽型鎂基水泥生物相容性的助劑,它是采用葡萄糖酸鈉或維生素C糖苷、甘露醇、山梨醇或木糖醇,或甘露醇、山梨醇、木糖醇、氨基酸作為金屬離子螯合劑,將氧化鎂、磷酸鹽、羥基磷灰石、硫酸鈣、金屬離子螯合劑等粉體直接與水混合,攪拌成膏體狀泥[9]。然而筆者對(duì)上述鉀鹽型鎂基骨水泥進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)這些骨水泥或多或少的具有一定的細(xì)胞毒性。其原因主要是磷酸鹽和氧化鎂未能完全反應(yīng),游離出較高濃度的K+和Mg2+離子,從而造成細(xì)胞的死亡。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)基

    本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株為L(zhǎng)929細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞所)。細(xì)胞培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基(HYCLONE公司),胎牛血清(GIBCO公司),MTT(SIGMA公司)。

    1.2 鎂基骨水泥粉體和固化液

    粉體分為兩部分,即主料A和輔料B。主料A包括43%的氧化鎂和43%的磷酸二氫鉀(粉體總的質(zhì)量百分比)。氧化鎂使用前1 600℃煅燒4h,然后隨爐冷卻。輔料B包括4%的蔗糖,8%的羥基磷灰石和2%的金屬螯合劑。螯合劑的種類為:三聚磷酸鈉、六偏磷酸鈉、EDTA、L-Cys、L-Lys、L-Arg和L-Glu。以專利CN10176344A中的所述的一個(gè)實(shí)施例為對(duì)照,即:45%氧化鎂,45%磷酸二氫鉀,8%的羥基磷灰石和2%的蔗糖[10]。所有粉體成份均利用球磨儀研磨后過300目的尼龍篩。固化液為5%的磷酸溶液。粉體使用25KGy的輻照滅菌,固化液使用121℃濕熱滅菌30min。

    1.3 鎂基骨水泥的制備

    按照粉體總比例10∶3(質(zhì)量體積比,g/mL)將主料A與固化液混合,攪拌成漿體狀,然后加入輔料B繼續(xù)攪拌均勻,供注射或直接使用。為了比較主料A和輔料B加入順序?qū)w外細(xì)胞毒性的影響,將A和B混合后再加入固化液攪拌成漿體供注射或直接使用。對(duì)照組將粉體和固化液混合后攪拌成漿體使用。

    1.4 體外細(xì)胞毒性檢測(cè)

    陰性對(duì)照為高密度聚乙烯,陽(yáng)性對(duì)照為有機(jī)穩(wěn)定劑聚氯乙烯。將1.3中制備的樣品漿體灌裝入5mL注射器中,注射入預(yù)裝有5mL細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管中,根據(jù)注射的質(zhì)量,調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)液的量至浸提濃度為0.2g/mL。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均按0.2g/mL的比例浸提。浸提24h,浸提條件為37±1℃。

    體外細(xì)胞毒性檢測(cè)參照GB/T16886.5—2003中的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。將配置好的2×104/mL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板,設(shè)置空白、陰性、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組6孔,每孔接種100μL細(xì)胞懸液。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2氣體)37℃培養(yǎng)24h后,棄去原培養(yǎng)液??瞻讓?duì)照組加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液,陰性和陽(yáng)性對(duì)照組分別加入陰性和陽(yáng)性浸提液,實(shí)驗(yàn)組加入實(shí)驗(yàn)樣品浸提液。每孔100μL,置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24h后每孔加入5g/L的MTT溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)液體,加入150μL DMSO,置于震蕩器上震蕩10min,在酶標(biāo)儀570nm和630nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。通過以下公式計(jì)算相對(duì)增殖率(RGR),RGR=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白對(duì)照組吸光度值) ×100%。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 不同螯合劑對(duì)鎂基骨水泥的體外細(xì)胞毒性影響

    含不同螯合劑的鎂基骨水泥的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(a~h, j為空白對(duì)照)和表1。從圖1可知,螯合劑的加入不僅能降低細(xì)胞的死亡率還能促進(jìn)細(xì)胞的增殖分裂。同時(shí)由表1也說明了螯合劑的加入可以明顯提高細(xì)胞的增殖率,使得鎂基骨水泥的細(xì)胞毒性達(dá)到1級(jí)或0級(jí)。其中,三聚磷酸鈉的效果最為顯著,細(xì)胞相對(duì)增殖率達(dá)119.6%,能促進(jìn)細(xì)胞的增殖。而對(duì)照組的體外細(xì)胞毒性達(dá)到3級(jí)。

    2.2 主料A和輔料B加入順序?qū)︽V基骨水泥體外細(xì)胞毒性的影響

    以螯合劑三聚磷酸鈉為例探討了主料A和輔料B對(duì)鎂基骨水泥的體外細(xì)胞毒性影響,結(jié)果見圖1(i)和表2。由表2可見,如將A和B混合后再加入固化液會(huì)使細(xì)胞增殖率大大降低,從而降低鎂基骨水泥的生物相容性。

    表1 含不同螯合劑的鎂基骨水泥樣品的細(xì)胞相對(duì)增殖率

    表2 主料A和輔料B的加入順序?qū)?xì)胞增殖率的影響

    3 討 論

    生物相容性是指材料與生物體之間的相互作用后產(chǎn)生的各種生物、物理、化學(xué)等反應(yīng)。一般地講,就是材料植入人體后相容程度,即是否對(duì)人體組織造成危害。鎂基骨水泥中的主要化學(xué)反應(yīng)為:

    MgO+KH2PO4+5H2O—MgKPO4·6H2O[11]

    因此,在鎂基骨水泥的粉體中,主要參與化學(xué)反應(yīng)的為氧化鎂和磷酸二氫鉀,其它輔料基本不參與反應(yīng)。而終產(chǎn)物為凝膠物MgKPO4·6H2O及未反應(yīng)完的氧化鎂和磷酸二氫鉀。如果該反應(yīng)不充分將導(dǎo)致機(jī)體局部鉀離子和鎂離子濃度增加,從而導(dǎo)致機(jī)體周圍細(xì)胞壞死,對(duì)組織愈合極為不利。解決這一問題主要從兩方面入手:(1)優(yōu)化氧化鎂和磷酸二氫鉀的比例;(2)優(yōu)化反應(yīng)條件。關(guān)于第一方面,目前已有較多的研究,如專利CN101076344 A[10]。因此,本研究主要從反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。首先在固化液方面,本研究利用5%的磷酸水溶液(質(zhì)量體積比)替代傳統(tǒng)的水溶液。這樣可以增加反應(yīng)體系中氫離子的濃度,從而促進(jìn)反應(yīng)。同時(shí)如果氧化鎂過量,將會(huì)造成組織周圍pH值升高帶來堿性化,不利于組織修復(fù),而使用一定濃度的酸溶液作為固化液可以調(diào)節(jié)pH值在7附近,有利于骨骼的生長(zhǎng)。其次,為了去除未反應(yīng)的K+和Mg2+離子,本研究加入了螯合劑,同時(shí)調(diào)整了主料和輔料的加入順序。這里所謂的主料包括:氧化鎂和磷酸二氫鉀;輔料為:蔗糖、羥基磷灰石和螯合劑等。即,將氧化鎂和磷酸二氫鉀以一定的比例混合后,加入一定量的固化液,攪拌成漿體狀,最后加入輔料繼續(xù)攪拌均勻,供注射或直接使用。這樣做的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在以下兩方面:(1)該反應(yīng)的主反應(yīng)為氧化鎂和磷酸二氫鉀的酸堿中和反應(yīng),可以排除輔料對(duì)反應(yīng)的影響,同時(shí),如將輔料與主料一起加入勢(shì)必增加粉體的量,而固化液的量是一定的,這樣會(huì)使攪拌初期液體太少,主料和固化液不能充分接觸而使反應(yīng)不完全;(2)螯合劑的作用是螯合掉多余的鉀離子和鎂離子,如果將螯合劑和主料一起加入,那么螯合劑在反應(yīng)前或反應(yīng)初期就與鉀離子和鎂離子發(fā)生了反應(yīng),無法達(dá)到預(yù)期的目的,而在主反應(yīng)后加入螯合劑才能真正發(fā)揮螯合劑的功能。

    本研究中的細(xì)胞增值率數(shù)據(jù)與專利CN101076344A、CN102488921A存在差別,這與試驗(yàn)方法有關(guān);CN101076344A、CN102488921A均為材料凝固24h后再浸提[9,10]。這與材料進(jìn)入人體的初始狀態(tài)不符,實(shí)際上材料進(jìn)入人體的初始狀態(tài)為漿體狀,而非固體狀。本研究是將漿體直接注射到浸提液中,讓其在浸提液中凝固,這更符合材料進(jìn)入人體的實(shí)際情況,其細(xì)胞增值率數(shù)據(jù)也更能說明問題。

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    Cytotoxicity Test of Magnesium Phosphate Bone Cement with Chelating Agent

    ZHANG Li1,YANG Zaijun1,DING Xiang1,KANG Tairan1,PENG Zhengsong1,LI Yunxiang1,YANG Ju1,PENG Hongwei1,2,LIAO Yongmei1

    (1.Collaboration Innovation Center for Tissue Repair Material Engineering Technology,China West Normal University,Nanchong Sichuan 637009,China;2.Chengdu Medapp Biotech.Co.Ltd,Chengdu 610000,China)

    Magnesium phosphate cements (MPC) have properties that are relevant to biomedical applications,such as fast setting,early strength acquisition and adhesive properties.In order to improve the biocompatibility of MPC,the in vitro cytotoxicity of MPC with chelating agent,such as,sodium tripolyphosphate,sodium hexametaphosphate,EDTA,EDTA,L-Cys,L-Lys,L-Arg and L-Glu,was studied in this paper.The effect of different addition sequence of main materials A (magnesium oxide and potassium dihydrogen phosphate) and auxiliary materials B (sucrose,hydroxyapatite and chelating agent) on the in vitro cytotoxicity of MPC was also discussed.The results indicated that the addition of chelating agent in MPC can significantly improve the cell proliferation rate,among them,the effect of sodium tripolyphosphate was the most significant,and the cell proliferation rate reached 119.6%.And the addition sequence of main materials A and auxiliary materials B greatly influences the in vitro cytotoxicity of MPC.Therefore, in the process of preparation of MPC,the correct method is as follows:first mix main materials A and the setting liquid;secondly, stir them into a paste;then add the auxiliary materials B into the paste;last,continue to stir everything evenly.

    magnesium phosphate bone cement;in vitro cytotoxicity;chelating agent

    1673-5072(2016)03-0270-04

    2015-09-05 基金項(xiàng)目:四川省教育廳重大培育項(xiàng)目(14CZ0015) 作者簡(jiǎn)介:張 莉(1992—),女,四川達(dá)州人,碩士研究生,主要從事功能基因的研究。 通訊作者:楊在君(1981—),男,四川儀隴人,副教授,主要從事遺傳和材料的研究與教學(xué)。E-mail:zaijunyang@cwnu.edu.cn

    R318

    A

    10.16246/j.issn.1673-5072.2016.03.007

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