利用SRAP和SSR標記構(gòu)建紅麻遺傳連鎖圖譜

武耀龍，李德芳，李建軍，黃思齊，李輝，唐慧娟，陳安國

（中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，長沙410205）

利用SRAP和SSR標記構(gòu)建紅麻遺傳連鎖圖譜

武耀龍，李德芳，李建軍，黃思齊，李輝，唐慧娟，陳安國*

（中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，長沙410205）

構(gòu)建紅麻遺傳連鎖圖譜，為今后紅麻重要農(nóng)藝性狀QTL定位、QTL圖位克隆、優(yōu)良基因篩選、分子標記輔助育種奠定良好的研究基礎(chǔ)。對256對SRAP引物和64對棉花SSR引物進行了兩次引物篩選，以泰紅763×F71為作圖群體親本，150個F2代單株作為作圖群體，構(gòu)建紅麻遺傳連鎖圖譜。共篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的SRAP引物73對、SSR引物8對，構(gòu)建的紅麻遺傳連鎖圖譜全長2155.43 cM，平均間距為16.09 cM，含有128個多態(tài)性標記，分布于18個連鎖群。本研究初步證實了棉花SSR引物用于紅麻是可行的，構(gòu)建的紅麻遺傳連鎖圖譜密度較高，標記較為均勻，適合后續(xù)的QTL定位、QTL圖位克隆等研究工作。

遺傳連鎖圖譜；紅麻；SRAP；SSR

紅麻（Hibiscus cannabinus L.），又名洋麻、槿麻、鐘麻等，屬于錦葵（Malvaceae）木槿屬（Hibiscus）一年生韌皮纖維作物，栽培種紅麻為二倍體（2n＝36）［1］。紅麻的韌皮纖維柔軟，纖維拉力強，其自然纖維具有抑菌、透氣、吸濕性好、散失水分快、可降解等特性，用來生產(chǎn)汽車內(nèi)襯、麻塑、紙地膜、輕型板材、絨毛漿、活性炭及環(huán)境友好型吸附材料，是重要的麻紡工業(yè)原料作物。因而紅麻被視為二十一世紀有潛力的優(yōu)勢作物［2，3］。遺傳連鎖圖譜（genetic linkage map）是研究優(yōu)良性狀基因定位的重要工具，同時也是研究基因組進化的基礎(chǔ)［4］。較高密度的遺傳圖譜，在數(shù)量性狀基因定位、圖位克隆、重要農(nóng)藝性狀基因、種質(zhì)資源鑒定和分子標記輔助選擇育種等研究中發(fā)揮了十分重要的作用［5］。因此構(gòu)建紅麻遺傳連鎖圖譜將推動紅麻分子標記輔助育種研究的開展，同時也為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)基因的篩選提供遺傳基礎(chǔ)。

Botstein等1980年首次研究了利用重組DNA探針得到的DNA多態(tài)性標記位點構(gòu)建人類遺傳連鎖圖譜之后，遺傳連鎖圖譜逐步成為了研究生物基因組的重要工具，并且這一研究工具逐步開始在農(nóng)作物中應(yīng)用，先后有水稻［6］、大豆［7］、大麥［8］等作物的高密度連鎖圖譜的構(gòu)建成功。與這些農(nóng)作物相比，麻類作物在遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建這方面研究起步較晚，分子遺傳的基礎(chǔ)研究比較滯后，Liu等［9］利用SSR引物構(gòu)建了一張含有132個標記，全長為2265.1 cM的第一張苧麻遺傳連鎖圖譜；福建農(nóng)林大學在紅麻分子遺傳連鎖圖譜構(gòu)建研究方面起步較早，張廣慶等［10］、張曉琛等［11］應(yīng)用ISSR、SRAP、RAPD分子標記以Ga42和阿聯(lián)紅麻為親本分別構(gòu)建了一張含有78和134個標記的紅麻遺傳連鎖圖譜，陳美霞等［12］以阿聯(lián)紅麻和福紅992為親本，利用SRAP、ISSR、RAPD構(gòu)建了一張含有26個連鎖群共307個標記、總長為4924.8 cM的紅麻連鎖圖譜。

本研究在主要采用SRAP分子標記的基礎(chǔ)之上，同時采用了棉花的SSR引物用于紅麻遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，對棉花SSR引物用于紅麻分子標記的可行性進行了初步探討，同時不同類型分子標記技術(shù)用于構(gòu)建連鎖圖譜將有助于高質(zhì)量紅麻圖譜的構(gòu)建。本研究使用SRAP引物和棉花SSR引物構(gòu)建紅麻遺傳連鎖圖譜將為日后進一步加密圖譜、紅麻產(chǎn)量及品質(zhì)等相關(guān)性狀的QTL定位、紅麻優(yōu)良基因的篩選、QTL圖位克隆、紅麻分子標記輔助育種的開展奠定良好的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 作圖群體的構(gòu)建

為保證實驗的進行性以及實驗結(jié)果的可靠性，本實驗選取了6對親本雜交組合，分別為：泰紅763×F71、泰紅763×83－20、泰紅763×臺農(nóng)1號、Y1A1（中紅麻13號）×F71、Y1A1×83－20和泰紅763×83－18。本實驗所用的6個紅麻親本來自于中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所黃紅麻種植資源課題組（表1）

表1 供試紅麻材料Tab.1 Experimental kenaf materials

1.2 基因組DNA提取

親本和F1代的DNA均提取自紅麻子葉，F(xiàn)2代單株DNA提取自紅麻苗期的幼嫩葉片。采用北京天根公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，Unico公司生產(chǎn)的UV－2100型紫外分光光度計檢測DNA濃度，稀釋到20 ng／μL，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SRAP和SSR分子標記分析

256對SRAP引物來自于Li和Quiros［13］、Lin［14］等及Riaz［15］等發(fā)表的SRAP引物序列（表2）。64對SSR引物（表3）選自Cotton DB數(shù)據(jù)庫（http：／／algodon.tamu.edu／～mapbase／SSR－framepage.htm）。所有的引物均由上海生工生物股份有限公司合成。

表2 SRAP引物序列Tab.2 Primer sequences of SRAP

表3 SSR引物列表Tab.3 List of SSR primer

SRAP反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸1 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，32個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10 min，產(chǎn)物于4℃保存。

SSR反應(yīng)程序：94℃變性4 min；94℃變性30 s，52℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。SSR反應(yīng)程序參考陳浩東［16］、王志偉［17］等的反應(yīng)程序的基礎(chǔ)上作了適當?shù)恼{(diào)整。

擴增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠中分離，電壓200 V、電流220 mA的條件下電泳1 h，快速銀染檢測。本實驗所使用PCR儀為BIO－RAD S1000型，電泳儀為北京君意JY－JX7型，電泳儀電源為BIO－RAD PowerPac Basic。

SRAP－PCR與SSR－PCR反應(yīng)體系參考之前的研究［18］：2 μL 10×Taq Reaction Buffer、20 ng模板DNA、dNTP 220 μmol／L、引物0.35 μmol／L、Taq DNA聚合酶0.5U，總體積為20 μL。

1.4 標記命名與數(shù)據(jù)記載

讀取條帶是在相同遷移位點上的多態(tài)性條帶記為“1”，無條帶的記為“0”。為保證實驗的重復(fù)性與可靠性，條帶模糊不清的舍棄該條帶，膠片出現(xiàn)大面積條帶模糊或條帶跑偏等現(xiàn)象的舍棄該膠片進行重復(fù)性實驗。

本研究中出現(xiàn)的標記名稱前面一部分為引物名稱或引物名稱簡寫，后面的數(shù)字表示該標記DNA片段的大小，中間用“－”連接。例如，M1E3－561表示SRAP引物Me1Em3擴增出來的大小為561 bp的條帶；MUCS242－687表示棉花SSR引物MUCS242擴增出來的687 bp的多態(tài)性條帶。條帶片段的大小的計算本實驗采用對天根公司生產(chǎn)的100 bp marker每一條條帶到點樣孔之間的距離和條帶片段大小作擬合曲線（圖1），對電泳出來的每一板膠，統(tǒng)計其100 bp片段與點樣孔之間的間距，從而對擬合曲線進行參數(shù)矯正，然后統(tǒng)計每一個多態(tài)性條帶與點樣孔之間的間距，利用Excel計算出具體片段大小。該方法的基本原理是DNA片段在PAGE凝膠中在電場下的移動主要是依靠電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，因此電泳的遷移率與分子量的對數(shù)值呈線性關(guān)系，相對遷移率＝樣品遷移距離／標記遷移距離，據(jù)此可以計算出未知DNA片段大小。

圖1 根據(jù)marker片段大小所做曲線計算DNA多態(tài)性片段大小Fig.1 Calculation of DNA polymorphism fragment with curve made by marker MW

1.5 軟件參數(shù)設(shè)定

按照JoinMap 4.0［19］軟件的要求，所有標記母本泰紅763的帶型記為a，父本F71的帶型記為b；如果該條帶泰紅763對F71為顯性，則F2代中顯性的記為a，隱性的記為c；如果該條帶F71對泰紅763為顯性，則F2代中顯性的計為b，隱性的計為d；雜種帶型記為h。由于某些原因造成條帶模糊不清或數(shù)據(jù)缺失的記為“－”。

參考盛潔［20］等的方法利用Excel軟件對分子標記的分離數(shù)據(jù)進行偏分離卡方檢驗，計算標記是否符合3：1的分離比例，若卡方值X2（0.05）＞3.84則認為差異顯著。

JoinMap 4.0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，軟件的Lod值設(shè)為3.0，重組頻率為0.25，采用Kosambi函數(shù)計算圖距。JoinMap軟件構(gòu)建圖譜過程中，將間距大于100 cM的連鎖群進行拆分處理，間距過大的單個標記舍棄。連鎖群的命名依據(jù)連鎖群的長度大小順序分別用LG（linkage group）后面加數(shù)字序號命名連鎖群，如：LG1表示第一連鎖群。

2 結(jié)果與分析

2.1 作圖親本的確立

本研究作圖雜交親本組合為泰紅763×F71，選擇依據(jù)為后續(xù)SRAP－PCR對6個親本組合的擴增結(jié)果（表4）與兩親本表型性狀的差異。結(jié)果表明，組合泰紅763×F71不僅表型性狀的差異巨大，對兩親本SRAP分子標記擴增的結(jié)果也表明二者之間差異較大，適合作為連鎖圖譜構(gòu)建親本。

表4 6個親本擴增結(jié)果Tab.4 SRAP results of six materials

2.2 SRAP和SSR結(jié)果分析

第一次引物篩選以6個親本材料DNA為模板進行SRAP－PCR擴增，引物的再次篩選以親本泰紅763、F71以及10個隨機選取的F2代群體單株DNA為模板對引物進行SRAP－PCR、SSRPCR擴增；由于本實驗使用的SSR引物較少，因此直接進行了第二次引物篩選，跳過了引物的初次篩選。

初次引物篩選結(jié)果（表5）：在256對引物組合中，條帶主要分布于200～800 bp之間，共有175對引物能夠擴增出多態(tài)性條帶，占總數(shù)的68.3%；256對引物共擴增出2573條條帶，平均每個引物可擴增出10.1條；175對引物共擴增出多態(tài)性條帶467個，平均每個引物可擴增出2.67條多態(tài)性條帶，多態(tài)率為18.2%；從256對引物中共篩選出91對帶型清晰明亮且多態(tài)性較高的引物。

表5 初次引物篩選數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.5 Statistics of first round primer screening

二次引物篩選結(jié)果（表6）：初次篩選出來的91對多態(tài)性引物中有11對引物沒有擴增出多態(tài)性條帶，占總數(shù)的12%；所有引物共擴增出1487條條帶，平均每個引物可擴增16.3條條帶。多態(tài)性條帶共有274條，80對能夠擴增出條帶的引物平均每對擴增3.4條多態(tài)性條帶，多態(tài)率為18.4%。64對SSR引物有57對引物能夠擴增出條帶，其中有36對引物有多態(tài)性條帶，條帶主要分布在300～700 bp之間，共擴增出864條條帶，其中89條為多態(tài)性條帶，多態(tài)率為10.24%。引物的再次篩選共篩選出帶型清晰、易辨認且多態(tài)性較好的SRAP引物73對、SSR引物8對。

表6 二次引物篩選結(jié)果Tab.6 Results of second round primer screening

本實驗對共231個多態(tài)性標記為點進行遺傳連鎖分析，最后共有128個標記進入18個連鎖群，其中有120個SRAP標記和8個SSR標記，有103個多態(tài)性標記沒有進入連鎖圖譜。至少含有5個標記的連鎖群有10個，8個連鎖群只有2～3個多態(tài)性標記，說明該圖譜還需要更多的標記添加進去，有待后續(xù)實驗的完善。整張圖譜覆蓋基因組的長度為2155.43 cM，兩個標記間的平均距離為16.09 cM，最大間距為78.223 cM，最小間距為0；最長的LG1長達840.424 cM，含有40個標記，最短的LG18只有6.116 cM；圖譜標記間距較為均勻，有一小部分區(qū)域出現(xiàn)標記聚集現(xiàn)象。

128個多態(tài)性標記以及偏分離標記在連鎖圖譜的分步情況如表7和圖2：

表7 128個標記在連鎖圖譜上的分布Tab.7 Distribution of 128 loci on the genetic map

連鎖群長度標記數(shù)偏分離標記平均間距（cM）偏分離比例（%）LG1148.353116.1233.33 LG1246.84657.8183.33 LG1343.223214.4166.67 LG1429.682114.8450.00 LG1518.51209.260.00 LG1616.42228.21100.00 LG1713.34206.670.00 LG186.12332.04100.00總計2155.431287816.0960.94

圖2 利用128個多態(tài)性標記構(gòu)建的紅麻遺傳連鎖圖譜Fig.2 kenaf genetic linkage map made by 128 polymorphic markers

3 討論

3.1 SSR引物通用性

SSR（Simple Sequence Repeat）是一種基于PCR反應(yīng)的分子標記技術(shù)，具有操作簡便、高多態(tài)性、高共顯性等特點，廣泛地應(yīng)用于動物、植物、微生物等研究領(lǐng)域［21］。但其缺點是擴增位點較少，引物的開發(fā)成本高且SSR標記中所使用的引物不同，實驗結(jié)果差異較大。分子標記技術(shù)種間的通用性有利于提高引物利用效率，降低開發(fā)成本［22］。近年來，眾多研究發(fā)現(xiàn)SSR引物在近緣物種乃至遠源物種中的通用性得到了較好的驗證，Sharma等［23］分析發(fā)現(xiàn)98對水稻SSR引物和20對甘蔗EST－SSR引物在23份竹子中的通用性分別為44.9%和75%；鐘敏等研究發(fā)現(xiàn)1205對綠豆基因組DNA SSR引物在小豆、豇豆和飯豆中的通用性比例分別為50%、73.3%和81.6%，多態(tài)性比例分別為4.1%、1.7%和1.5%。鄭麗珊等［24］利用1595對棉花SSR引物對不同基因型的貢蕉和野蕉進行擴增，得到183對有效擴增引物。紅麻和棉花一樣都屬于錦葵科木槿屬作物，因此本研究選取了64對棉花SSR引物對紅麻作圖群體雙親和10個F2代單株進行PCR擴增，其中57對引物擴增出了條帶，通用性比例高達89%；36對引物具有多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為56%；共選出8對多態(tài)性較高的引物用于作圖群體的擴增，很好地證明了棉花SSR引物用于紅麻分子標記研究是可行的，同時也初步證實了近緣物種間進行SSR引物的通用性分析是有效可行的。

3.2 多種分子標記技術(shù)對構(gòu)建連鎖圖譜的影響

多種分子標記技術(shù)的共同使用構(gòu)建物種的遺傳連鎖圖譜成為了近年來遺傳圖譜構(gòu)建的趨勢，王志偉等［17］利用AFLP與SSR分子標記技術(shù)構(gòu)建了一張含有251個標記的棉花遺傳連鎖圖譜，駱晚俠等［25］利用SSR和EST－SSR構(gòu)建了一張含有145個標記的小豆遺傳連鎖圖譜，Xia等［26］使用SNPs與SSR標記技術(shù)構(gòu)建了第一張含269個標記的草魚遺傳連鎖圖譜。SRAP分子標記對開放閱讀框的擴增效果較好，但對染色體末端的擴增較差；SSR標記的多態(tài)性高，重復(fù)性好，但同時擴增片段少，基因型判斷錯誤概率大；RAPD分子標記不依賴于種屬特異性和基因組的結(jié)構(gòu)，一套引物可以分析不同生物基因組，但其重復(fù)性差，為顯性標記，無法識別雜合子［27］。多種分子標記技術(shù)的使用有利于克服各種分子標記技術(shù)的缺陷，構(gòu)建出來的遺傳連鎖圖譜精細程度高、覆蓋染色體上的基因范圍更廣。本實驗中發(fā)現(xiàn)，SSR引物絕大多數(shù)都處于連鎖群的中下部，如NAU3437的三個標記處于LG1的中下部；MUCS573－763處于LG2的中下部；NAU3424的兩個標記處于LG6的下部；MUCS573－751處于LG5的中部，只有NAU3424－377處于所在連鎖群的上部。陳美霞等［12］用SRAP、ISSR、RAPD構(gòu)建的紅麻遺傳連鎖圖譜發(fā)現(xiàn)圖譜中LG20、LG21、LG22、LG25、LG26僅僅包含有RAPD標記。造成一種標記集中分布在一個連鎖群的同一位置或者同一連鎖群上的原因可能是分子標記位點較少，標記的間隔過大引起的，也有可能是分子標記技術(shù)本身的特性決定的，因此在構(gòu)建圖譜過程中，應(yīng)盡量多地開發(fā)高質(zhì)量的引物并且多種分子標記技術(shù)共同使用，對提高圖譜的精度，構(gòu)建紅麻高密度的飽和連鎖圖譜有重要的作用。

3.3 偏分離標記對連鎖圖譜構(gòu)建的影響

植物中的偏分離標記是普遍存在的，普遍認為偏分離是物種進化強有力的推進力，對生物體有性繁殖的諸多要素是非常重要的，這些因素包括性別和性別比、重組、異型性染色體、生殖隔離和配偶選擇等［28］。產(chǎn)生偏分離的原因可能與雌配子體、雄配子體、合子選擇、作物種間群體配子重組率差異、偏分離研究與高密度分子標記遺傳連鎖圖譜構(gòu)建著絲點區(qū)域、遺傳搭車效應(yīng)、親本遺傳背景、群體類型和非遺傳因素等有關(guān)［29］。在連鎖圖譜中，偏分離標記對圖譜的準確性產(chǎn)生影響，不僅可以影響標記之間的距離，甚至可以影響到標記在連鎖圖譜上的順序［30］。本實驗中的128個標記中有78個（占60.9%）標記是偏分離標記，偏分離比例較為嚴重，幾乎每個連鎖群上都具有偏分離標記，只有LG15與LG17連鎖群上沒有偏分離標記，偏分離標記多以成簇的形式分布于連鎖群的中部和兩端，而且這些偏分離標記在一個聚集簇中大多按照一個方向偏離，或向母本偏離，或向父本偏離，余渝等［29］在棉花高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建中也同樣發(fā)現(xiàn)了這種偏分離標記聚集的現(xiàn)象。在偏分離標記中有46個（58.9%）偏向父本基因型，32個（41.1%）標記偏向母本基因型。張廣慶等［10］，陳美霞等［12］，張曉琛等［11］利用同樣的作圖親本構(gòu)建的三張連鎖圖譜偏分離比例都較高，分別為56%、26%和46%。而且在這三個圖譜中標記數(shù)越多，偏分離比例就越小，標記數(shù)最多的為307，但偏分離標記數(shù)仍高達80個。因此可能是由于作圖親本的剩余雜合性導(dǎo)致等位基因型復(fù)雜，連鎖關(guān)系難以確定是本次實驗中圖譜標記中偏分離比例較高的最主要原因［31］。當然偏分離標記比例較高同樣與標記基因型的統(tǒng)計，親本基因的突變等多方面因素有關(guān)。克服偏分離標記的方法最好是作圖時先將偏分離的標記剔除，然后再將偏分離標記添加進去，觀察偏分離標記對圖譜的影響，最終確定標記的去留。但對偏分離標記的定位和遺傳效應(yīng)研究都必須建立在高密度遺傳圖譜的基礎(chǔ)之上，本實驗由于紅麻分子遺傳研究基礎(chǔ)較為薄弱，時間有限，無法篩選更多的引物更多的標記進入連鎖圖譜，因此沒有對偏分離標記做比對處理。隨著紅麻分子標記研究的不斷進展，會有高密度的遺傳圖譜構(gòu)建出來，對偏分離標記的定位也將成為可能。對偏分離標記的研究不僅有利于獲得高精度的遺傳圖譜和QTL定位分析，也有利于紅麻的分子育種的研究進展。

4 結(jié)論

本研究采用SRAP引物以棉花SSR引物構(gòu)建出一張密度較高、分布較為均勻的紅麻遺傳連鎖圖譜，圖譜含有128個多態(tài)性標記，分布于18個連鎖群，全長為2155.43 cM，標記間平均間距為16.09 cM。

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Constructing a Genetic Linkage Map by SRAP and SSR Marker for Kenaf（Hibiscus cannabinus L.）

WU Yaolong，LI Defang，LI Jianjun，HUANG Siqi，LI Hui，TANG Huijuan，CHEN Anguo
（Institute of Bast Fiber Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410205，China）

Construction of genetic linkage map for kenaf will lay good foundation for QTL mapping，QTL map－based cloning，superior gene screening and molecular marker－assisted breeding of essential agronomic traits.256 pairs of SRAP primers and 64 pairs of SSR primers of cotton were screened twice，150 F2derived from two kenaf varities，Thailand No.1 and F71，as mapping material.73 pairs of SRAP primers and 8 pairs of SSR primers were screened，and these primers are clearly visible and high polymorphic.A genetic linkage map with 128 DNA loci spanning 2155.43 cM was constructed.It contains 128 polymorphic makers scattered in 18 linkage groups with average interval of genetic linkage map 16.09 cM.In this paper，it is proved that SSR primers of cotton used for kenaf are available and genetic linkage map for kenaf has relatively high density and its markers are evenly distributed，which will be suitable for QTL mapping and QTL map－based cloning and etc.in the subsequent study.

genetic linkage map；kenaf；SRAP；SSR

S563.5

A

1671－3532（2016）06－0249－09

2016－06－28

國家麻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS－19－E07）

武耀龍（1988－），男，在讀研究生，專業(yè)方向作物遺傳育種。E－mail：wuyaolong2012＠126.com

*通訊作者：陳安國（1964－），男，研究員，主要從事一年生麻類遺傳育種及新品種推廣。Email：cagibfc＠126.com