原子力顯微鏡檢測(cè)α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因鼠線粒體微觀結(jié)構(gòu)的變化

高 歌 汪志鵬 段春禮 魯玲玲 楊 慧

(首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物系 北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所 北京市神經(jīng)再生修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100069)

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· 基礎(chǔ)研究 ·

原子力顯微鏡檢測(cè)α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因鼠線粒體微觀結(jié)構(gòu)的變化

高 歌 汪志鵬 段春禮 魯玲玲 楊 慧*

(首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物系 北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所 北京市神經(jīng)再生修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100069)

目的 使用原子力顯微鏡檢測(cè)α-突觸核蛋白(α-synuclein, α-syn)轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，皮質(zhì)線粒體表面微觀結(jié)構(gòu)的變化。方法 提取野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)細(xì)胞線粒體，使用共聚焦顯微鏡檢測(cè)其膜電勢(shì)變化，使用原子力顯微鏡的敲擊模式檢測(cè)線粒體膜表面的微觀結(jié)構(gòu)。結(jié)果 JC-1染色法檢測(cè)線粒體膜電勢(shì)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠線粒體膜電勢(shì)與野生組相比降低20.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)；原子力顯微鏡觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠線粒體長(zhǎng)度與野生組相比增加，表面光滑度減低，線粒體膜孔增多(P<0.05)。結(jié)論 α-Syn的轉(zhuǎn)基因小鼠線粒體膜電勢(shì)減低，線粒體膜完整性受到破壞。在原子力顯微鏡敲擊模式下檢測(cè)離體線粒體，能反映出轉(zhuǎn)基因小鼠線粒體膜表面微觀結(jié)構(gòu)的變化。

原子力顯微鏡；線粒體；α-突觸核蛋白；線粒體膜電勢(shì)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是第二大神經(jīng)退行性疾病，PD的發(fā)病因素涉及基因、環(huán)境、神經(jīng)內(nèi)毒素和老化等多種因素，這些致病因素中線粒體功能障礙是PD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。線粒體受損后，由于ATP合成的丟失、水解增加，離子穩(wěn)態(tài)的失平衡活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生增多，以及凋亡前體蛋白的釋放等結(jié)果，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷[1]。線粒體形態(tài)的改變?nèi)缒[脹、固縮、膜損傷、空洞樣形成是與這種生理及病理的功能緊密相關(guān)的。然而，在PD動(dòng)物模型中使用原力力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)檢測(cè)過(guò)表達(dá)α-syn后線粒體結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)研究報(bào)道很少。因此本研究使用過(guò)表達(dá)α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行線粒體微觀形態(tài)的研究。Thy1-α-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠能模擬PD癥狀的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)對(duì)PD模型小鼠腦組織的線粒體進(jìn)行提取后，檢測(cè)過(guò)表達(dá)α-syn 對(duì)線粒體功能的影響及使用AFM對(duì)線粒體的三維微觀形態(tài)及線粒體膜孔深度進(jìn)行直觀檢測(cè)，以期建立一種檢測(cè)PD模型小鼠中線粒體微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)的技術(shù)，對(duì)研究α-synuclein損傷線粒體的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及分組

Thy1-α-syn轉(zhuǎn)基因小鼠(購(gòu)于Jackson laboratory，美國(guó))，雄性，25～30 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：3377883。小鼠分為2組：轉(zhuǎn)基因小鼠組(transgenic mice, TG)及同窩對(duì)照野生小鼠組(wild type mice, WT)，每組3只，即從3窩同代小鼠中隨機(jī)取出TG及WT各一只。MinuteTM線粒體分離試劑盒(Invent公司，美國(guó))，JC-1(5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-甲基苯并咪唑氫碘化物)(Sigma公司，美國(guó))，原子力顯微鏡為美國(guó)VECCO公司，云母片為71856-01-10(EMS公司,美國(guó))，OTR8-10型號(hào)AFM探頭(Bruker 公司，美國(guó))，Triethoxysilane(Sigma公司，美國(guó))。

1.2 方法

1)線粒體提取:使用Minute TM線粒體分離試劑盒，快速?gòu)母鹘M小鼠腦皮質(zhì)中分離出完整線粒體。步驟如下：(1)將新鮮皮質(zhì)組織60 mg放置于離心管柱上。加入250 μL Buffer A，用塑料棒反復(fù)扭轉(zhuǎn)研磨組織1 min， 14 000 r/min離心30 s，棄去離心管柱，渦旋震蕩重懸沉。(2)3 000 r/min離心1 min(沉淀為細(xì)胞核)，小心地將上清液轉(zhuǎn)移到新的2.0 mL離心管中，加入400 μL 緩沖液B，渦旋震蕩10 s混合，溶液。(3) 隨后14 000 r/min離心10 min，棄去上清液(上清液包含胞質(zhì)蛋白)。(4)沉淀加入200 μL緩沖液B渦旋震蕩10 s重懸沉淀，10 000 r/min離心5 min。(5)將上清液轉(zhuǎn)移到新的2.0 mL離心管中。加入1.6 mL預(yù)冷的mito Buffer A (145 mmol/L KCl, 50 mmol/L sucrose, 1 mmol/L EGTA,1 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L PB, pH值為7.4)，14 000 r/min離心15 min,沉淀即為分離出的線粒體(約140 μg)。

2)JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電勢(shì):準(zhǔn)備好WT組及TG組皮質(zhì)的新鮮線粒體懸液后，在mito Buffer A中加入終濃度為10 mmol/L 丙酮酸鈉，10 mmol/L 琥珀酸鈉，1 mmol/L的二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)的緩沖液中，加入5 μmol/L的 JC-1染液，37 ℃孵育30 min后，14 000 r/min離心15 min洗去染液，使用mito Buffer A重懸，即刻吸取2 μL制片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：觀察紅色熒光，濾波器激發(fā)波長(zhǎng)529 nm，散發(fā)波長(zhǎng)590 nm，觀察綠色熒光：濾波器激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，散發(fā)波長(zhǎng)530 nm。使用紅色與紅綠熒光比值反映線粒體膜電勢(shì)的變化情況。

3)云母片處理：熒光顯微鏡觀察確認(rèn)活性高的線粒體后，取2 μL線粒體懸液，事先用Triethoxysilane處理的新鮮的云母片，使之帶上正電荷，與帶負(fù)電荷的線粒體結(jié)合，晾干后用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定10 min，用超純水輕沖洗云母片，沖走鹽粒，隨著線粒體基質(zhì)液體的蒸發(fā)，多聚甲醛的固定，會(huì)使線粒體的體積變小，樣品干燥箱晾干后行原子力顯微鏡檢測(cè)(圖1)。

圖1 線粒體與云母片的黏附過(guò)程

Fig.1 Process of mitochondria attaching to triethoxysilane coatedmica

4) 原子力顯微鏡觀察線粒體膜表面結(jié)構(gòu):使用OTR8-10型號(hào)探針檢測(cè)線粒體，其縱向分辨率為0.1 nm，橫向分辨率為2 nm。采取敲擊模式進(jìn)行檢測(cè)，使用的掃描范圍為：2 μm×2 μm，掃描分辨率為512×512 像素, 掃描速度為每秒0.8 line。圖像采用Nanoscope 1.40r3軟件分析，進(jìn)行了線粒體的三維構(gòu)建。測(cè)量線粒體的形態(tài)參數(shù)，包括長(zhǎng)度、寬度、長(zhǎng)寬比、高度、表面粗糙度、膜孔的深度和個(gè)數(shù)。共檢測(cè)90個(gè)線粒體 (n=3)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電勢(shì)

線粒體電勢(shì)情況如圖2所示，左列(圖2A、B)是2組皮質(zhì)組織提取的線粒體經(jīng)JC-1 染色后，發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm 時(shí)，顯示紅色，反映聚合態(tài)的JC-1，表征線粒體膜電勢(shì)良好，右列(圖2C、D)是發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm時(shí)，顯示綠色，反映單體的JC-1，表征線粒體膜電勢(shì)降低。使用Image J軟件分析熒光個(gè)數(shù)，結(jié)果顯示TG組線粒體膜電勢(shì)比WT組平均下降20.4% (P<0.01,n=3，圖2E)。

2.2 原子力顯微鏡檢測(cè)小鼠皮質(zhì)線粒體

圖3左側(cè)列分別是不同組的線粒體二維結(jié)構(gòu)圖(圖3C、E)，右側(cè)列為左側(cè)的三維形貌圖(3D、F)。圖3A、B為云母片本底圖，因?yàn)橛宣}粒存在，所以也呈現(xiàn)非光滑的顆粒狀?？梢杂^察到，WT組的線粒體呈圓棒狀，表面較為光滑，TG組的線粒體形狀不規(guī)則，表面可見(jiàn)較多膜孔樣凹陷(3F圖紅色箭頭指示)。圖G代表云母片本底光滑度，圖3H，3I分別顯示了2組線粒體的長(zhǎng)寬測(cè)量值，藍(lán)線代表長(zhǎng)度測(cè)量值，紅線代表寬度測(cè)量值。

2.3 WT及TG組線粒體長(zhǎng)度，寬度，長(zhǎng)寬比，高度，表面粗糙度，膜孔個(gè)數(shù)及膜孔深度比較

圖像使用Nanoscope 1.40r3軟件分析線粒體的形貌參數(shù)，結(jié)果顯示，WT組線粒體平均長(zhǎng)度為(371.40 ± 40.78)nm，表面粗糙度為(13.980±0.984)nm，線粒體的膜孔個(gè)數(shù)為1.400±0.510，而TG組線粒體長(zhǎng)度明顯增加到(643.20±95.35)nm，平均表面粗糙度增加為(22.870±1.732)nm，線粒體的膜孔個(gè)數(shù)為4.200±0.663，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而線粒體的寬度、高度、長(zhǎng)寬比及膜孔深度在TG組雖有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。共檢測(cè)90個(gè)線粒體，其中轉(zhuǎn)基因組45個(gè)，野生組45個(gè)，詳見(jiàn)表1。

圖2 WT及TG組線粒體膜電勢(shì)變化情況

Fig.2 Mitochondrial Δψm isolated from WT and TG mice

Δψm of purified mitochondria was visualized by the probe JC-1. Confocal image showed the Δψm. Normal Δψm was red fluorescence for the aggregation of the JC-1 monomers (A, B), while green fluorescence was associated with reduced Δψm (C, D). The same intensity was used to acquire the images. Quantitative and statistical analysis showed the decreased Δψm in mitochondria isolated from TG mice (E). Thirty visual fields were detected by Image J. (**P<0.01,n=3). Scale bar=50 μm；WT：wild type mice；TG：transgenic mice.

表1 WT及TG組線粒體形貌參數(shù)比較

Tab.1 Quantitative analysis of nanostructural changes in isolated mitochondria from WT and TG (n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsWT group；WT：wild type mice； TG：transgenic mice.

圖3 線粒體的平面(2D)及立體結(jié)構(gòu)圖(3D)

Fig.3 Representative atomic force microscopy (AFM) topographic images and line profiles of mitochondria isolated from WT (wild type) (C, D, H), TG (transgenic type) (E, F, I) mice

A： mica surface 2D image as the background； B： mica surface 3D image； C： 2D mitochondrial image of WT； D： 3D image of WT； E：2D mitochondrial image of TG； F： 3D image of TG. The lines profiles were showed in Fig(G,H,I).G：Mica surface was showed；H： size of mitochondria in WT； I： size of mitochondria in TG. Blue line represented the length of mitochondria.Red line representedthe width of mitochondria;WT: wild type mice; TG:transgenic mice; Red arrow showed the pore-like changes (F).

3 討論

大量的研究[2-5]結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)α-syn能引起線粒體腫脹，線粒體滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)開放，線粒體膜電勢(shì)降低，鈣穩(wěn)態(tài)失衡，ROS產(chǎn)生增加，進(jìn)而引起細(xì)胞壞死或凋亡，另外，也有文獻(xiàn)[4]報(bào)道，過(guò)表達(dá)α-syn能在生物膜上引起孔道樣改變。

自從Binnig等[2]1986年發(fā)明AFM以來(lái)，AFM成為了一項(xiàng)非常重要的檢測(cè)各種細(xì)胞及生物材料表面特性的技術(shù)方法。在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，AFM作為一種成像技術(shù)能提供樣品的三維成像和樣品的細(xì)微結(jié)構(gòu)，包括微生物、細(xì)胞膜、生物大分子及細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)等[3-5]。相比電鏡及其他顯微鏡，AFM最主要的優(yōu)勢(shì)是不需要特殊處理樣品，并且在各種環(huán)境下如大氣中，真空，甚至溶液介質(zhì)中都能進(jìn)行測(cè)試，樣品制備方法簡(jiǎn)單，分辨率達(dá)到nm級(jí)別，并且AFM能提供樣品的二維，三維結(jié)構(gòu)圖像。Wilson等[6]的研究中，離體評(píng)估線粒體形態(tài)的是通過(guò)測(cè)量線粒體懸液的吸光度等數(shù)值進(jìn)行的，使用熒光顯微鏡觀測(cè)在體的線粒體腫脹程度也沒(méi)有特別量化的指標(biāo)[7]，雖然使用高分辨率的電鏡能進(jìn)行觀測(cè)線粒體的輪廓及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，但是它不能像AFM一樣給出微觀的三維形貌圖，也不能觀察到線粒體的膜表面的改變。

α-Syn作為路易小體(Lewy bodies，LBs)的主要成分，在PD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用。α-Syn的N端有6個(gè)氨基酸(KTKEGV)高度保守序列，可與脂質(zhì)膜可逆結(jié)合，它對(duì)心磷脂具有高度親和性，而心磷脂在線粒體內(nèi)外膜中含量豐富[8]。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，它在離體的環(huán)境下存活的時(shí)間短，功能損傷大，本實(shí)驗(yàn)室使用試劑盒快速提取線粒體后，在體外進(jìn)行JC-1檢測(cè)時(shí)加入丙酮酸鹽、琥珀酸鹽及ADP，以維持在體的微環(huán)境，保證線粒體在固定之前保持其完整的形態(tài)及功能。JC-1染色結(jié)果顯示，TG組離體線粒體膜電勢(shì)與WT組相比下降20.2%(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)室的前期結(jié)果顯示在MN9D和原代神經(jīng)元中過(guò)表達(dá)α-syn后，能對(duì)線粒體功能造成損傷[9]。在PC12細(xì)胞培養(yǎng)基中外加α-syn也能引起線粒體功能損傷，cytochrome c釋放增加，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[10]。α-Syn轉(zhuǎn)基因小鼠皮層的線粒體膜電勢(shì)減低，ROS增加。那么這種線粒體功能的降低是不是有其形態(tài)改變的基礎(chǔ)呢？隨后本研究AFM檢測(cè)線粒體微觀結(jié)構(gòu)的變化。

AFM利用樣品和探針之間的原子力檢測(cè)樣品的形貌結(jié)構(gòu)，其分辨率達(dá)到納米級(jí)別，AFM有3種掃描模式，接觸模式(contact mode)、非接觸模式(non-contact mode)，敲擊模式(tapping mode)。鑒于線粒體屬于軟質(zhì)樣品，為了增加縱向分辨率，本研究采用了敲擊模式進(jìn)行線粒體的檢測(cè)。敲擊模式很好的消除了橫向力的影響，降低了由吸附液層引起的力，圖像分辨率高，適于觀測(cè)軟、易碎、或膠黏性樣品，并且不會(huì)損傷線粒體的膜結(jié)構(gòu)。AFM在Z方向的分辨率為0.1 nm，那么，就要求樣品下的基底的粗糙度為0.1 nm或更小，云母片因?yàn)槠浔砻嫫交?，并呈現(xiàn)片層結(jié)構(gòu)。因此本研究也選用廣泛使用的云母片作為基底介質(zhì)。在AFM掃描過(guò)程中，即使掃描到了云母的層狀邊界，云母單層的高度分辨率<1 nm，也能減少誤差。云母片的片層結(jié)構(gòu)使它易于替換，取走云母表層后剩余的云母就是一個(gè)新鮮干凈的表面。本研究結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)α-syn小鼠皮質(zhì)(TG組)線粒體長(zhǎng)度增加，可能是α-syn過(guò)表達(dá)引起線粒體腫脹，但是由于多聚甲醛后固定的原因，線粒體出現(xiàn)了固縮，因此長(zhǎng)寬比與WT組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。WT及TG兩組線粒體在云母片上的高度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能是因?yàn)闃悠放c云母片結(jié)合的原因，隨著接觸面積增大，所以高度基本保持一致。2 μm×2 μm的掃描面積時(shí)，TG組線粒體表面出現(xiàn)明顯孔道樣改變，膜孔的個(gè)數(shù)與同窩野生組相比也顯著增加，孔道深度約9 nm，筆者推測(cè)，此孔道能造成線粒體通透性增加，線粒體膜電勢(shì)減低，cyto c的釋放增加，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷，結(jié)果也顯示與同窩對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)基因組小鼠線粒體表面粗糙度增加(P<0.05)，這與Biasutto等[11]的研究結(jié)果一致。作為PD模型的α-syn轉(zhuǎn)基因小鼠，能模擬PD的發(fā)病機(jī)制，包括早期的嗅覺(jué)功能減低、晚期的運(yùn)動(dòng)功能障礙等[12-15]，這些表型都是與線粒體的結(jié)構(gòu)功能改變密切相關(guān)，本研究結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)α-syn能引起線粒體膜電勢(shì)的減低，這與其結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。AFM結(jié)果也證實(shí)了過(guò)表達(dá)α-syn能引起線粒體變大，孔道樣結(jié)構(gòu)增加。因此，使用AFM能觀察到離體線粒體微觀結(jié)構(gòu)的變化，是一種直觀準(zhǔn)確的應(yīng)用于PD研究中線粒體結(jié)構(gòu)的觀察手段。但是，這種在線粒體上觀察到的孔道樣變化的原因可能是α-syn與mPTP的蛋白發(fā)生相互作用造成的，也可能是增多的α-syn由于其親膜的結(jié)構(gòu)進(jìn)而在膜上直接形成孔道。下一步將尋找α-syn與線粒體膜發(fā)生直接相互作用的關(guān)鍵蛋白，并對(duì)其進(jìn)行保護(hù)性干預(yù)后，線粒體微觀形態(tài)的變化，以期為線粒體功能變化找到直觀的佐證，為PD的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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編輯 慕 萌

Topographic images analysis of mitochondria from α-synuclein transgenic mice utilizing atomic force microscopy

Gao Ge, Wang Zhipeng, Duan Chunli, Lu Lingling, Yang Hui*

(DepartmentofNeurobiology,CapitalMedicalUniversity,CenterforParkinson’sDisease,BeijingInstituteforBrainDisorders,BeijingCenterofNeuralDegenerationandRepairing,KeyLaboratoryforNeurodegenerativeDiseases,MinistryofEducation,Beijing100069,China)

Objective To investigate the mitochondrial topographic images and nanostructural changes in isolated cortex mitochondria from mice overexpressing human wild-type α-synuclein (Thy1-α-synuclein mice, Tg/α-syn) via atomic force microscopy (AFM). Methods Via JC-1 staining to exam the mitochondrial membrane potential of mitochondria isolated from wild type mice(WT) and transgenic mice(TG). The topographic images and nanostructural changes of mitochondria were detected by AFM between the two groups. Results The mitochondrial membrane potential of mitochondria isolated from transgenic mice was decreased by 20.4% compared with the wild type mice (P< 0.01). And the topographic images and nanostructure results showed that the length, roughness and number of pore-like structure were increased in mitochondria isolated from TG group (P<0.05). Conclusion Overexpressing α-syn could attenuate mitochondrial membrane potential (Δψm) and the mitochondrial membrane was destroyed. The AFM could show the topographic images and nanostructural changes in the isolated mitochondria using tapping mode.

atomic force microscopy (AFM); mitochondria; α-synuclein (α-syn); mitochondrial membrane potential(Δψm)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81371398)，北京市自然科學(xué)基金(7131001)，北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)提升計(jì)劃 (IDHT20140514)，首都醫(yī)科大學(xué)?；?2015JS21)，北京腦重大疾病研究院項(xiàng)目(BIBD-PXM2013 014226 07 000084)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81371398), Natural Science Foundation of Beijing (7131001)，Project of Construction of Innovative Teams and Teacher Career Development for Universities and Colleges Under Beijing Municipality (IDHT20140514)，Principal Fund of Capital Medical University(2015JS21)，Beijing Institute for Brain Disorder-PXM(BIBD-PXM2013 014226 07 000084).

時(shí)間：2016-12-14 20∶23

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2023.046.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.017]

R 742.5

2016-06-22)

*Corresponding author， E-mail：huiyang@ccmu.edu.cn