5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)及老年斑病理改變

陳 晨 楊翠翠 李 林 張 蘭

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室 北京市神經(jīng)藥物工程研究中心 北京腦重大疾病研究院 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

?

· 神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)研究 ·

5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)及老年斑病理改變

陳 晨 楊翠翠 李 林 張 蘭*

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室 北京市神經(jīng)藥物工程研究中心 北京腦重大疾病研究院 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

目的 評(píng)價(jià)5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及腦部病理改變。方法 5月齡APP/PS1(+/-)小鼠，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)空間學(xué)習(xí)記憶功能，免疫組織化學(xué)和剛果紅染色觀察淀粉樣斑塊沉積情況。結(jié)果 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示APP/PS1(+)小鼠逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于APP/PS1(-)小鼠，表明5月齡APP/PS1(+)小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了空間學(xué)習(xí)記憶功能的損害。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中5月齡APP/PS1(+)小鼠對(duì)新物體的分辨指數(shù)無顯著降低，免疫組化、剛果紅染色顯示5月齡APP/PS1(+)小鼠海馬及皮質(zhì)均出現(xiàn)斑塊沉積。結(jié)論 5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能損害，小鼠腦內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)相應(yīng)的病理改變。

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠；β-淀粉樣斑塊；剛果紅染色

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種老年神經(jīng)退行性疾病，是引起癡呆的最常見原因[1]。由于實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以預(yù)知，安全性難以確保，目前針對(duì)阿爾茨海默病早期藥物研究最常用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[2]，又由于疾病病因及病理機(jī)制的復(fù)雜性，針對(duì)阿爾茨海默病研究，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要選擇轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,其優(yōu)勢(shì)是模擬阿爾茨海默病相應(yīng)的病理改變[3]：APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物基于淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)假說模擬阿爾茨海默病特征性老年斑病理改變。臨床上阿爾茨海默病疾病分期包括：臨床前AD(preclinical AD,PCAD)、輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment,MCI)、早期AD(early AD,EAD)和晚期AD (late-stage AD,LAD)，目前尚缺乏動(dòng)物模型的明確疾病分期，本文主要介紹了5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的行為學(xué)改變和特征性病理改變，探討模擬早期AD的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因陽性及陰性小鼠，5月齡，體質(zhì)量25～35 g,購自南京大學(xué)模式動(dòng)物所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2010-001。根據(jù)轉(zhuǎn)基因陰性APP/PS1(-)和轉(zhuǎn)基因陽性APP/PS1(+)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組和模型組。SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，12 h光照，自由進(jìn)食和進(jìn)水，室溫20℃～25 ℃，濕度為50%～70%。

1.2 主要設(shè)備和儀器

Morris水迷宮：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；冰凍切片機(jī)：Thermo公司；剛果紅染液：上海邁新試劑；β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)一抗：Cell Signaling Technology公司；生物素標(biāo)記的抗兔IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素：Vector Laboratories公司；DAB顯色試劑盒：西雅金橋生物；生物顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮直徑120 cm,水深30 cm,水溫(20±3) ℃，水中加入奶粉，水面平均分成4個(gè)象限。根據(jù)Vorhees等[4]的方法，每天每只動(dòng)物訓(xùn)練2次，2 min/次，共6 d,平臺(tái)放置在任意象限，平臺(tái)位于水下1.5 cm,選取平臺(tái)的鄰象限和對(duì)象限作為入水點(diǎn)，對(duì)于120 s未找到平臺(tái)者，將動(dòng)物引導(dǎo)至平臺(tái)，停留15 s,記錄逃避潛伏期，游泳速度等指標(biāo)，第7天撤除平臺(tái)，小鼠于原平臺(tái)對(duì)側(cè)象限入水，觀察其60 s內(nèi)穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)(穿臺(tái)次數(shù))。測(cè)試時(shí)室內(nèi)安靜，物品陳設(shè)、照明度一致。

1.4 新物體識(shí)別

取大鼠底盒，盒長(zhǎng)45 cm,盒寬30 cm，盒高15 cm，根據(jù)Ennaceur等[5]的方法，實(shí)驗(yàn)分3部分，適應(yīng)期：第1天，將小鼠放置在大鼠底盒中，盒內(nèi)不放任何物體，10 min/只；熟悉期：第2天，取兩個(gè)相同的物體(A,A’)，記錄小鼠對(duì)兩個(gè)物體的關(guān)注時(shí)間；測(cè)試期：第3天，將其中一個(gè)物體換成新物體，記錄小鼠對(duì)新舊物體的關(guān)注時(shí)間，計(jì)算分辨指數(shù)(recognization index)，新舊物體的分辨指數(shù)等于小鼠關(guān)注新舊物體的時(shí)間比小鼠關(guān)注兩物體的時(shí)間和。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，潔爾滅消毒液清潔盒子和物品消除氣味。

1.5 取材

每組取6只小鼠，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛4 mL/kg,麻醉后開胸，剪開心胞膜，暴露心臟和主動(dòng)脈弓。用 7號(hào)鈍頭針頭插入左心室至主動(dòng)脈弓，灌注0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化納注射液100 mL，經(jīng)體循環(huán)和肺循環(huán)沖洗全身血管，待右心耳流出液無色透明時(shí)，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛(pH=7.4)100 mL灌注固定，至動(dòng)物四肢僵直。灌注2 h后開顱取腦固定于后固定液中，冰凍切片，取冠狀位，片厚20 μm，連續(xù)切片。

1.6 剛果紅染色

每組3只，每只取3張皮質(zhì)及海馬部位腦組織切片，撈至載玻片上，晾干，滴加飽和剛果紅染液10 min，滴加分化液，數(shù)秒，鏡下控制，水洗5 min，蘇木精淺染，乙醇脫色，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.7 免疫組織化學(xué)

每組3只，每只取3張腦片，所選切片于3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2室溫孵育30 min,PBST洗3次，每次5 min,加入10%(體積分?jǐn)?shù))羊血清，室溫孵育30 min，傾去；滴加Aβ一抗稀釋液(1∶200)，4 ℃過夜；PBST洗3次，每次5 min；加生物素標(biāo)記抗兔IgG工作液，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；加適量的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；DAB顯色，自來水終止顯色，晾干后，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測(cè)試

隨訓(xùn)練時(shí)間增加，逃避潛伏期呈逐漸縮短趨勢(shì)，第5天，與對(duì)照組相比，模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果說明模型組小鼠與對(duì)照組相比出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙(P<0.05)詳見表1。第7天，穿越平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組(2.00±0.26)相比，模型組(1.00±0.68)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 新物體識(shí)別

實(shí)驗(yàn)中熟悉期所有動(dòng)物對(duì)兩物體的方位沒有偏好，測(cè)試期結(jié)果表明對(duì)照組對(duì)新物體的分辨指數(shù)稍高于舊物體，模型組對(duì)新物體的分辨指數(shù)稍低于舊物體，但兩組之間對(duì)新物體的分辨指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

表1 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果

Tab.1 Morris water maze test result

GroupNumberofcaseEscapelatency/s3d4d5d6dFPControl642．26±14．1234．06±15．0326．41±7．0321．34±4．136．9110．025Model681．40±18．6873．34±18．5481．16±16．3451．14±18．03--

圖1 新物體識(shí)別結(jié)果

Fig.1 New object recognition test result

A：sample phase; B:test phase.

2.3 剛果紅染色

5月齡APP/PS1(+)小鼠皮質(zhì)和海馬散在分布呈紅色或磚紅色點(diǎn)狀斑塊，與阿爾茨海默細(xì)胞外斑塊沉積病理改變一致，而APP/PS1(-)小鼠腦片皮質(zhì)和海馬均無剛果紅染色陽性部位(圖2)。

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)β-淀粉樣斑塊

光鏡下APP/PS1(+)小鼠腦組織切片，顯示皮層和海馬部位均已出現(xiàn)褐色團(tuán)塊狀淀粉樣斑塊沉積，而APP/PS1(-)小鼠腦組織切片并無此種改變(圖3)。

圖2 APP/PS1(+/-)小鼠皮質(zhì)和海馬淀粉樣斑塊剛果紅染色

Fig.2 Amyloid plaques in the cortex and hippocampus of APP/PS1(+/-) mice(Congo red staining, 20×)

A： in the cortex of APP/PS1(-) mouse； B: in the cortex of APP/PS1(+)mouse； C: in the hippocampus of APP/PS1(-) mouse；D: in the hippocampus of APP/PS1(+) mouse.

圖3 APP/PS1(+/-)小鼠皮質(zhì)和海馬淀粉樣斑塊免疫組化

Fig.3 Amyloid plaques in the cortex and hippocampus of APP/PS1(+/-) mice(SP，20×)

A：β-amyloid plaques immunohistochemical staining inthe cortex of APP/PS1(-) mouse; B: β-amyloid plaques immunohistochemical staining inthe cortex of APP/PS1(+) mouse; C:β-amyloid plaques immunohistochemical staining in the hippocampus of APP/PS1(-) mouse; D: β-amyloid plaques immunohistochemical staining in the hippocampus of APP/PS1(+) mouse.

3 討論

阿爾茨海默病是最常見的神經(jīng)退行性疾病，主要的臨床表現(xiàn)包括進(jìn)行性記憶減退、精神障礙、言語功能失調(diào)、個(gè)性和行為改變、定向和判斷能力減弱，疾病末期喪失生活能力[6]，對(duì)于AD疾病，目前尚無有效的治療藥物，隨著病情進(jìn)展，在疾病的終末期嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，臨床治療一直認(rèn)為疾病早期干預(yù)具有重要意義。

β-淀粉樣蛋白聚集形成的老年斑是AD典型病理改變之一，老年斑的主要成分為β-淀粉樣蛋白40/42[7],老年斑即淀粉樣斑塊，淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)假說一直被認(rèn)為是癡呆發(fā)病基礎(chǔ)[8]，β-淀粉樣蛋白是通過淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)代謝過程產(chǎn)生的，APP主要包括兩大代謝過程：淀粉樣蛋白生成途徑和非淀粉樣蛋白生成途徑。其中淀粉樣蛋白生成途徑是Aβ生成過程，淀粉樣蛋白生成途徑為APP經(jīng)β-分泌酶(β-secretase cleaving enzyme 1，BACE-1)代謝，產(chǎn)生β-sAPP,再經(jīng)γ-分泌酶作用，產(chǎn)生Aβ和γ-CTF(C99)。BACE-1是此途徑的限速關(guān)鍵[9]。APP/PS1是目前常用阿爾茨海默病動(dòng)物模型[10]，能夠較好模擬疾病發(fā)生過程中Aβ生成。

Morris水迷宮是評(píng)價(jià)空間學(xué)習(xí)記憶功能的重要手段，在本研究中發(fā)現(xiàn)5月齡APP/PS1(+)小鼠與APP/PS1(-)對(duì)照組相比已經(jīng)出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙。但是新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中5月齡APP/PS1(+)小鼠與APP/PS1(-)小鼠對(duì)新物體的分辨指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所以在此階段APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能損害較輕。本研究結(jié)果使我們對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物認(rèn)知功能狀態(tài)有了明確的認(rèn)識(shí)，為疾病干預(yù)提供明確的支撐。

剛果紅染色能顯示腦內(nèi)淀粉樣斑塊沉積，其主要原理是淀粉樣蛋白聚集，形成淀粉樣變性的病理改變，而剛果紅染色是診斷淀粉樣變性最簡(jiǎn)便易行的方法[11],所以剛果紅也被用于淀粉樣蛋白示蹤劑研究[12-15]，剛果紅染色可見5月齡APP/PS1(+)小鼠皮質(zhì)及海馬部位均出現(xiàn)磚紅色斑塊。

淀粉樣斑塊免疫組化是通過免疫學(xué)原理使特定抗原實(shí)現(xiàn)組織內(nèi)定位與定量，本實(shí)驗(yàn)中使用的抗體特異識(shí)別Aβ40/42，5月齡APP/PS1(+)在皮質(zhì)和海馬部位均可見褐色斑塊沉積。這一結(jié)果也印證了Aβ40/42是老年斑主要成分。

綜上所述，5月齡APP/PS1(+)小鼠已經(jīng)出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能改變，這一階段的認(rèn)知功能變化比較輕微。與早期AD記憶功能障礙變化一致。剛果紅染色，淀粉樣斑塊免疫組化染色可見斑塊沉積，斑塊主要成分為Aβ40/42，斑塊數(shù)量不多，面積尚小，這一結(jié)果說明5月齡APP/PS1(+)小鼠行為學(xué)與腦部病理變化呈現(xiàn)一致性。

[1] Konietzko U. Gains and losses on the road to understanding Alzheimer’s disease[J]. Swiss Med Weekly, 2015,14S:W14233.

[2] De Felice F G, Munoz D P. Opportunities and challenges in developing relevant animal models for Alzheimer’s disease[J]. Age Res Rev, 2016,26:112-114.

[3] Puzzo D, Lee L, Palmeri A, et al. Behavioral assays with mouse models of Alzheimer’s disease: practical considerations and guidelines[J]. Biochem Pharmacol, 2014,88(4):450-467.

[4] Vorhees C V, Williams M T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J]. Nature Protocols, 2006,1(2):848-858.

[5] Ennaceur A, Delacour J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data[J]. Behav Brain Res, 1988,31(1):47-59.

[6] Cummings J L, Isaacson R S, Schmitt F A, et al. A practical algorithm for managing Alzheimer’s disease: what, when, and why?[J]. Ann Clin Translational Neurol, 2015,2(3):307-323.

[7] Zoltowska K M, Maesako M, Berezovska O. Interrelationship between changes in the amyloid beta 42/40 ratio and presenilin 1 conformation[J]. Mol Med, 2016,5:22.

[8] Reitz C. Alzheimer’s disease and the amyloid cascade hypothesis: a critical review[J]. Int J Alzheimer’s Dis, 2012,2012(369808):1-11.

[9] Baranello R J, Bharani K L, Padmaraju V, et al. Amyloid-beta protein clearance and degradation (ABCD) pathways and their role in Alzheimer’s disease[J].Curr Alzheimer Res,2015,12(1):32-46.

[10]Duyckaerts C, Potier M, Delatour B. Alzheimer disease models and human neuropathology: similarities and differences[J]. Acta Neuropathol, 2007,115(1):5-38.

[11]李玉蓮, 袁宏偉, 徐曉艷. 剛果紅染色在臨床病理診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014，45(7):661-662.

[12]Willander H, Askarieh G, Landreh M, et al. High-resolution structure of a BRICHOS domain and its implications for anti-amyloid chaperone activity on lung surfactant protein C[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012,109(7):2325-2329.

[13]Eisenmenger L B, Huo E J, Hoffman J M, et al. Advances in PET imaging of degenerative, cerebrovascular, and traumatic causes of dementia[J]. Semin Nucl Med,2016,46(1):57-87.

[14]潘濤, 么作義,趙英,等. 阿爾茨海默病患者血漿淀粉樣變與脂質(zhì)及血液流變學(xué)的相關(guān)性[J]. 中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2015，18(5) ：791-793.

[15]吳翊馨, 蘇勝林. 水迷宮訓(xùn)練對(duì)抑郁大鼠齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[J]. 中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014,43(1) ：59-63.

編輯 慕 萌

Five-month-old APP/PS1 double transgenic mice behavior and pathology of senile plaques

Chen Chen, Yang Cuicui, Li Lin, Zhang Lan*

(DepartmentofPharmacology,XuanwuHospital，CapitalMedicalUniversity,BeijingEngineeringResearchCenterforNerveSystemDrugs,BeijingInstituteforBrainDisorders,KeyLaboratoryforNeurodegenerativeDiseasesofMinistryofEducation,Beijing100053，China)

Objective To explore behavior related to learning and memory ability of 5-month-old APP/PS1 double transgenic mice and pathology in the brain. Methods Five-month- old APP/PS1(+/-) double transgenic mice were tested with Morris water maze. β-amyloid plaques were studied with immunohistochemical staining and Congo red staining to observe -amyloid plaques deposition. ResultsAPP/PS1(+) mice escape latency was significantly longer than that of APP/PS1(-) mice, 5-month-oldAPP/PS1(+) mice learning and memory ability were damaged. β-amyloid plaques immunohistochemical staining and Congo red staining showed senile plaques in 5-month-old APP/PS1(+) mice. Conclusion Five-month-old APP/PS1 (+) mice learning and memory ability were damaged, a part of Alzheimer disease pathology was shown in the brain of 5-month-old APP/PS1(+) mice.

APP/PS1 double transgenic mouse;β-amyloid plaques;Congo red stain

國家自然科學(xué)基金(81473373),北京市自然科學(xué)基金(7132110),北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才(2014-2-014),北京市教委新醫(yī)藥學(xué)科群(XK100270569)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81473373),Natural Science Foundation of Beijing (7132110),Beijing Health and Technical High-level Person Plan (2014-2-014),New Medical Disciplines Project of Beijing Education Committee(XK100270569).

時(shí)間：2016-12-14 20∶21

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2021.042.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.013]

R 592

2016-10-14)

*Corresponding author， E-mail：lanizhg@hotmail.com