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    鱈魚皮寡肽對人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究

    2016-12-23 03:10:15張國強(qiáng)胡曉斐續(xù)力云吳麗萍
    浙江醫(yī)學(xué) 2016年23期
    關(guān)鍵詞:寡肽鱈魚抗癌

    張國強(qiáng) 胡曉斐 續(xù)力云 吳麗萍

    鱈魚皮寡肽對人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究

    張國強(qiáng) 胡曉斐 續(xù)力云 吳麗萍

    目的 探討鱈魚皮寡肽(cod skin of oligopeptide,CSO)對人胃癌細(xì)胞(BGC-823)增殖的影響。方法 用不同濃度(20、40、60、80mg/ml)CSO處理體外培養(yǎng)的BGC-823,72h后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況;分別于24、48、72h,應(yīng)用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況并計(jì)算50%細(xì)胞抑制率(IC50);處理后24h采用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的改變情況。結(jié)果 與對照組相比,經(jīng)CSO處理后,鏡下BGC-823數(shù)目減少。CCK-8檢測結(jié)果顯示,BGC-823數(shù)目減少呈劑量、時(shí)間依懶性(均P<0.05),并且CSO對BGC-823作用24、48和72h的IC50分別是87.34、68.14、44.55mg/ml。對照組BGC-823存活率為(86.62±10.32)%,60mg/ml組BGC-823存活率為(24.18±6.59)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對照組BGC-823晚期凋亡率為(1.81±0.35)%,60mg/ml組BGC-823晚期凋亡率為(55.84±5.89)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在G1期,對照組BGC-823細(xì)胞分布為(61.13±10.32)%,60mg/ml組BGC-823細(xì)胞分布為(79.74±10.21)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在S期,對照組BGC-823細(xì)胞分布為(23.04±8.64)%,60mg/ml組BGC-823細(xì)胞分布為(10.42±5.36)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在G2期,20mg/ml組BGC-823細(xì)胞分布為(9.96±2.68)%,40mg/ml組BGC-823細(xì)胞分布為(6.93±1.25)%,60mg/ml組BGC-823細(xì)胞分布為(9.84± 3.79)%,與對照組BGC-823細(xì)胞分布(15.83±5.89)%相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論 CSO可阻滯BGC-823生長周期,促進(jìn)BGC-823凋亡,抑制增殖,從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

    鱈魚皮寡肽 人胃癌細(xì)胞 BGC-823 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡

    胃癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,很多患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期,其復(fù)發(fā)率較高,5年生存率不高[1]。晚期胃癌患者大多需要化學(xué)治療,但化療藥物無靶向性,不良反應(yīng)多,已成為影響胃癌治愈率的關(guān)鍵[2]。近年來,各國學(xué)者致力于尋找低毒、高效的新型抗癌藥物[3]。海洋生物中的活性物質(zhì)寡肽因其具有抗癌、抗氧化、降脂等多種生理功能,而逐漸成為全世界科學(xué)家研究的熱點(diǎn)[4-5]。本課題組于2015年8月,研究鱈魚皮寡肽(cod skin of oligopeptide,CSO)體外對人胃癌細(xì)胞(BGC-823)增殖的影響,并初步闡述其抑癌作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 BGC-823由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。鱈魚皮寡肽(Cod Skin of Oligopeptide,CSO)為鱈魚深加工時(shí)鱈魚皮的酶解產(chǎn)物。主要試劑:美國Gibco公司Trypsin-EDTA胰酶細(xì)胞消化液、10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基;PI染液:10×PI配制,5mg PI(美國,Sigma公司),0.1ml Triton X-100,3.7mg EDTA,10ml PBS,RNaseA 2mg;AnnexinV-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒(KGA1017)。FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國,BD公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 BGC-823培養(yǎng)及傳代 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱。待BGC-823在6cm dish中培養(yǎng)至80%~90%密度時(shí),傾去培養(yǎng)液,用3ml PBS洗滌細(xì)胞2次。加1ml Trypsin-EDTA solution,混勻后,小心吸去胰酶溶液,37℃放置5min。再加入2ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞稀釋至5×105細(xì)胞/ml。再傳代培養(yǎng)至80%~90%密度待用。

    1.2.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn)(CCK-8法) 取對數(shù)生長期的BGC-823,按5×103細(xì)胞/孔的濃度接種96孔板,每孔加入培養(yǎng)基100μl。待培養(yǎng)過夜后,加入不同劑量的CSO處理,分為20、40、60、80mg/ml 4個(gè)濃度組,同時(shí)設(shè)立對照組(不加藥物),并做好標(biāo)識(shí),繼續(xù)培養(yǎng),每24h更換1次培養(yǎng)液,至72h后,傾去培養(yǎng)液,加入新鮮培養(yǎng)基100μl后,每孔避光加入CCK8試劑10μl,避光培養(yǎng)1.5h后,選擇450nm波長,用在酶標(biāo)儀上測定各孔光密度值D450,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率:腫瘤細(xì)胞抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組)×100%。使用OriginPro 8.5軟件做抑制曲線,計(jì)算IC50。

    1.2.3 細(xì)胞周期檢測(流式細(xì)胞術(shù)) 用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液消化處于對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞離心收集,在含10%FBS的Ham F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為CSO20、40、60、80mg/ml 4個(gè)濃度組,同時(shí)設(shè)立對照組(不加藥物)。細(xì)胞貼壁后,各濃度組作用24h,制成單細(xì)胞懸液,并調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1~5×106cells/ml。用100%乙醇(-20℃)1.5ml,使其終濃度為75%,4℃過夜固定。取出固定單細(xì)胞懸液在室溫下1 000r/min離心5min后棄上清液,按照150μlRNaseA重懸細(xì)胞,37℃消化30min,加入100μl PI工作液,4℃避光染色30min。用流式細(xì)胞儀分析PI熒光直方圖上細(xì)胞各周期的百分率。

    1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(流式細(xì)胞術(shù)) 細(xì)胞傳代后培養(yǎng)至24h,分別加入CSO處理,分為20、40、60、80mg/ml組,同時(shí)設(shè)立對照組(不加藥物)。作用至24h后,PBS洗3遍,用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,離心收集細(xì)胞,微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速2 000r/min,離心時(shí)間5min,棄培養(yǎng)基。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000r/min,離心時(shí)間5min收集細(xì)胞);在50μl的Binding Buffer中加入5μl7-AAD染液,混勻。在收集的細(xì)胞中加入上述7-AAD染液,混勻;室溫、避光、反應(yīng)15min。反應(yīng)后再加入450μl的Binding Buffer混勻;加入1μlAnnexin V-PE混勻,室溫、避光、反應(yīng)15min。在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以表示,多組比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 CSO對BGC-823增殖的影響 見圖1-2,表1。

    由圖1可見,經(jīng)不同濃度CSO(20、40、60、80mg/ ml)處理后各組與對照組比較,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞膜皺縮,細(xì)胞變圓,細(xì)胞碎片增多,且呈劑量依懶性。由表1及圖2可見,隨著時(shí)間與CSO濃度的增加,檢測到OD值呈降低趨勢,CSO對BGC-823的抑制率逐漸增大,作用24、48和72h的IC50分別是87.34、68.14、44.55mg/ml。

    圖1 CSO作用后BGC-823的鏡下形態(tài)(a:對照組;b:20mg/ml組;c:40mg/ml組;d:60mg/ml組;e:80mg/ml組)

    2.2 CSO對BGC-823凋亡的影響 見圖3,表2。

    由圖3、表2可見,20、40、60、80mg/ml CSO處理BGC-823,觀察24h細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn),對照組細(xì)胞存活率與60mg/ml組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對照組細(xì)胞晚期凋亡率與60mg/ml組比較差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而兩組早期凋亡率及死亡細(xì)胞率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。當(dāng)濃度為80mg/ml,24h后活細(xì)胞極少,已無法染色,故無該濃度流式細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    2.3 CSO對BGC-823增殖周期的影響 見圖4、表3。

    由圖4、表3可見,20、40、60、80mg/ml CSO處理BGC-823 24h后發(fā)現(xiàn),在G1期,對照組與60mg/ml組細(xì)胞分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在S期,對照組與60mg/ml組細(xì)胞分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在G2期,對照組與20mg/ml組、40mg/ml組、60mg/ml組細(xì)胞分布比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

    表1 CSO對BCG-823細(xì)胞增殖的抑制作用(n=5)

    圖2 CSO作用于BGC-823不同時(shí)間后IC50(a:24h;b:48h;c:72h)

    圖3 不同濃度CSO作用于BGC-823后細(xì)胞凋亡圖(a:對照組;b:20mg/ml組;c:40mg/ml組;d:60mg/ml組)

    表2 BGC-823細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(%)

    3 討論

    上世紀(jì)50年代各國開始進(jìn)行海洋生物抗腫瘤活性物質(zhì)的研究,目前已有多項(xiàng)研究提示海洋生物寡肽具有抗癌的作用。Huang等[6]證實(shí)烏賊墨寡肽能顯著抑制人前列腺癌DU-145細(xì)胞的增殖。Bach等[7]在鹽場中發(fā)現(xiàn)一種嗜鹽鏈霉菌屬放線菌(Salternamide A,SA),能誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和凋亡。Costa等[8]對208株海洋藍(lán)藻的抗癌作用研究后,認(rèn)為海洋藍(lán)藻具有一定的細(xì)胞毒性,是一類很有前途的具有潛在抗癌活性的海洋生物。

    圖4 不同濃度CSO作用BGC-823后各組細(xì)胞周期圖(a:對照組;b:20mg/ml組;c:40mg/ml組;d:60mg/ml組)

    表3 BGC-823分布周期比較(%)

    CSO是以水解、酶解蛋白和蛋白質(zhì)多肽吸收理論為基礎(chǔ)研發(fā)的一種全新海洋功能性食品,產(chǎn)品不僅實(shí)現(xiàn)了邊角料高附加值利用的產(chǎn)業(yè)化問題,而且針對人體營養(yǎng)學(xué)需要,利用細(xì)胞和基因技術(shù),研究魚皮膠原蛋白肽在抗癌作用和增強(qiáng)免疫力生理功能,在滿足人體氨基酸需求的同時(shí)又滿足對腫瘤患者在放療、化療、術(shù)后恢復(fù)的抗癌輔助作用提供理論依據(jù)。為了研究開發(fā)新型海洋生物抗癌藥物,充分利用海洋深加工下腳料,本課題組從深海鱈魚皮中提取寡肽,并通過體外細(xì)胞培養(yǎng)、顯微鏡觀察、CCK-8法檢測、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法,研究不同濃度(20、40、60、80mg/ml)CSO體外對BGC-823增殖及細(xì)胞周期與凋亡情況的影響。結(jié)果顯示,CSO能抑制BGC-823增殖,且隨著CSO濃度增高,增殖抑制更加明顯。采用CCK-8法檢測CSO作用后BGC-823 24、48、72h增殖情況變化,發(fā)現(xiàn)OD值隨著CSO的濃度增加而降低,24、48、72h的 IC50分別是 87.34、68.14、44.55mg/ml,可見藥物對細(xì)胞的抑制率隨著濃度增加而增高,上述結(jié)果表明,CSO對BGC-823的增殖有抑制作用,且呈時(shí)間、量效關(guān)系。CSO細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),BGC-823細(xì)胞隨著CSO濃度增加,晚期凋亡細(xì)胞的比率增加,而活細(xì)胞比率則降低。60mg/ml的CSO加藥后,細(xì)胞的晚期凋亡率平均值甚至從對照組的1.81%達(dá)到55.84%,活細(xì)胞比率平均值從對照組的86.62%降低至24.18%,說明高濃度CSO對于BGC-823細(xì)胞凋亡進(jìn)展有顯著影響。同時(shí)CSO的細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),當(dāng)CSO藥物濃度達(dá)到60mg/ml時(shí),G1期細(xì)胞分布由對照組的61.13%提升至79.74%,而S期和G2期細(xì)胞分布則由對照組的23.04%和15.83%降低至10.42%和9.84%。表明隨著藥物濃度的增大,S期細(xì)胞的數(shù)量明顯降低,細(xì)胞均被抑制在G1期,導(dǎo)致了細(xì)胞增殖的停滯。

    課題組應(yīng)用酶法從鱈魚皮中提取CSO,通過BGC-823體外加藥實(shí)驗(yàn),來研究CSO體外抗胃癌作用,結(jié)果證實(shí)CSO能抑制BGC-823增殖,促進(jìn)凋亡,且呈時(shí)間、量效關(guān)系;同時(shí)能將細(xì)胞周期抑制在S/G2期,雖其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究,但本研究結(jié)果為海洋生物應(yīng)用價(jià)值和新型抗癌藥物的開發(fā)利用提供了新的思路。

    [1]Zhang H,Sun L L,Meng YL,et al.Survival trends in gastric cancer patients of Northeast China[J].World J Gastroenterol,2011, 17(27):3257-3262.

    [2]Wu L P,Hu X F.Cod skin peptide reduces chemotherapy induced toxicity in gastric cancer patients[J].World J Gastroenterol,2016,25(4):760-766.

    [3]Hyun Ji Eo,Tae-Hyung Kwon,Gwang Hun Park,et al.In Vitro Anticancer Activity of Phlorofucofuroeckol A via Upregulation of Activating Transcription Factor 3 against Human Colorectal Cancer Cells[J].Marine Drugs,2016,14(4):69-82.

    [4]Ruiyue Yang,Junbo Wang,Zhigang Liu,et al.Antioxidant Effect of a Marine Oligopeptide Preparation from Chum Salmon(Oncorhynchus keta)by Enzymatic Hydrolysis in Radiation Injured Mice.Marine Drugs[J].Marine Drugs,2011,9(11):2304-2315.

    [5]Han-Ning Huang,Venugopal Rajanbabu,Chieh-Yu Pan,et al. Enhanced Control of Bladder-Associated Tumors Using Shrimp Anti-Lipopolysaccharide Factor(SALF)Antimicrobial Peptide as a Cancer Vaccine Adjuvant in Mice.Mar[J].Drugs,2015,13 (4):3241-3258.

    [6]Fangfang Huang,Zuisu Yang,DiYu,et al.Sepia Ink Oligopeptide Induces Apoptosis in Prostate Cancer Cell Lines via Caspase-3 Activation and Elevation of Bax/Bcl-2 Ratio[J].Marine Drugs, 2012,10(10):2153-2165.

    [7]Duc-Hiep Bach,Seong-Hwan Kim,Ji-Young Hong,et al.Salternamide A Suppresses Hypoxia-Induced Accumulation of HIF-1αand Induces Apoptosis in Human Colorectal Cancer Cells[J].Drugs,2015,13(6):6962-6976.

    [8]Costa M,Garcia M,Costa-Rodrigues J,et al.Exploring bioactive properties of marine cyanobacteria isolated from the Portuguese coast:high potential as a source of anticancer compounds[J]. Marine Drugs,2014,12(1):98-114.

    Effect of cod skin oligopeptide on proliferation of human gastric carcinoma BGC-823 cells

    ZHANG Guoqiang,HU Xiaofei,XU Liyun,et al.Department of Gastrointestinal Surgery,Zhoushan Hospital,Zhoushan 316021,China

    【 Abstract】 Objective To explore the effect of cod skin oligopeptide (CSO)on the proliferation of human gastric carcinoma BGC-823 cells. Methods BGC-823 cells were treated with different concentrations(20,40,60,80mg/mL)of CSO. Cell morphology was observed under the microscope,cell viability was determined by CCK-8 assay,and ell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry. Results CSO significantly suppressed the proliferation of BGC-823 cells in a time-and dose-dependent manner.IC50of CSO with 24h,48h and 72h were 87.34mg/ml,68.14mg/ml and 44.55mg/ml,respectively.The early apoptosis rate of BGC-823 cells was(17.55±5.48)%and the late apoptosis rate was(55.84±5.89)%,when the cells were treated with 80mg/ml CSO.After BGC-823 cells were treated with CSO for 24h,the cell cycle arrested at S/G2stage.The number of G1cells increased with the increasing of CSO concentration,peaked at(79.74±10.21)%when CSO concentration was 60mg/ml,the number of S/G2cells were decreased with the increasing of CSO concentration,reached the lowest value of(9.84± 3.79)%when CSO was 60mg/ml. Conclusion CSO can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of human gastric cancer BGC-823 cells.

    Cod skin of oligopeptide Human gastric carcinoma cellBGC-823 Cell cycle Apoptosis

    2016-06-21)

    (本文編輯:馬雯娜)

    浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY12C20002);浙江省科技廳公益類項(xiàng)目(2011C23034)

    316021 舟山醫(yī)院胃腸外科

    吳麗萍:E-mail:13605800815@126.com

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    抗癌新聞
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