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2016-12-22 02:03:17李維維陳朝儒曲娟娟頓寶慶李桂英
生物技術(shù)進(jìn)展 2016年6期
李維維, 張 驥, 陳朝儒, 王 智, 曲娟娟, 頓寶慶*, 李桂英, 路 明
1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程, 北京 100081;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030
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CIT2基因?qū)ν蛔冡劸平湍改咎抢糜绊懙难芯?/p>
李維維1,2, 張 驥1, 陳朝儒1, 王 智1, 曲娟娟2*, 頓寶慶1*, 李桂英1, 路 明1
1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程, 北京 100081;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030
木糖利用困難是秸稈燃料乙醇產(chǎn)業(yè)化的制約因素，改造釀酒酵母使其能夠代謝木糖生成乙醇是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。為了研究CIT2基因?qū)z傳改良釀酒酵母C5D-P-M菌株中葡萄糖與木糖共發(fā)酵過(guò)程中木糖利用的影響，設(shè)計(jì)引物并應(yīng)用重疊PCR技術(shù)獲得敲除CIT2基因的敲除組件，通過(guò)同源重組的方法將C5D-P-M中的CIT2基因敲除得到突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ。通過(guò)對(duì)出發(fā)菌株和突變菌株的生長(zhǎng)速率、葡萄糖利用率、木糖利用率及乙醇產(chǎn)量進(jìn)行研究，結(jié)果表明突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的上述指標(biāo)比出發(fā)菌株C5D-P-M均有一定程度的提高。因此推測(cè)，釀酒酵母中CIT2基因是影響木糖利用的因素之一，CIT2基因的敲除可提高釀酒酵母的木糖利用率。
釀酒酵母；CIT2基因；基因敲除；木糖代謝
能源短缺、氣候變化是目前全世界共同面臨的重大問(wèn)題之一[1]。因此，世界各國(guó)紛紛積極開(kāi)展新能源、可再生生物質(zhì)能的研究與開(kāi)發(fā)[2]，其中以燃料乙醇的研究開(kāi)發(fā)最為成功，也是最可能的替代能源之一[3,4]。
我國(guó)人口眾多，土地資源相對(duì)貧乏，用緊缺的糧食生產(chǎn)乙醇燃料受條件限制。然而資源豐富、價(jià)格低廉的農(nóng)作物秸稈類纖維素生物質(zhì)尚未得到有效充分利用與開(kāi)發(fā)。秸稈類纖維素物質(zhì)具有木質(zhì)纖維復(fù)合物結(jié)構(gòu)，木質(zhì)纖維素的組成和結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。半纖維素構(gòu)成了秸稈類纖維素物質(zhì)中的相當(dāng)部分，約為30%，其水解產(chǎn)物是D-木糖類的五碳糖[5～7]，其中木糖的有效利用是乙醇產(chǎn)業(yè)化利用的重要限制因素之一[8]。
生產(chǎn)燃料乙醇用到的最主要的微生物是釀酒酵母，但是釀酒酵母不能直接代謝利用木糖，因其沒(méi)有專一性代謝木糖生成木酮糖的酶系，并且存在細(xì)胞膜上木糖跨膜運(yùn)輸障礙[9]，只有在釀酒酵母中引入木糖代謝流[10]并利用木酮糖的代謝酶系，將其代謝分解隨后進(jìn)入磷酸戊糖途徑，才能進(jìn)入其本身的代謝流，解決釀酒酵母中葡萄糖與木糖共發(fā)酵過(guò)程中木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響[11～13]。目前已知在全基因組測(cè)序的釀酒酵母S288C中，擁有DUP多基因家族[14]。釀酒酵母的DUP基因家族包括23個(gè)成員，其中可分為兩個(gè)亞族包括DUP240和DUP380。DUP基因家族編碼的部分蛋白能夠促進(jìn)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[15]。DUP240有3個(gè)保守區(qū)域C1、C2、C3和兩個(gè)預(yù)測(cè)橫跨膜結(jié)構(gòu)H1和H2，并且在Dup380蛋白質(zhì)序列中觀察到一個(gè)直接重復(fù)的C1-H1-H2-C2模塊[16]。DUP380亞家族由11個(gè)分別命名為COS1-COS11的基因組成，還包括2個(gè)假基因，所有這些基因連同與其相關(guān)的9個(gè)基因殘基都集中分布在酵母16條染色體的端粒區(qū)域。研究表明，DUP240家族蛋白均與細(xì)胞膜有關(guān)，他們具有不同的亞細(xì)胞定位而且沒(méi)有多余的互作因子[17]。這些DUP家族蛋白可能均在細(xì)胞膜運(yùn)輸中起作用[18]。
COS12蛋白(YGL263W )為DUP380家族成員，源于釀酒酵母ATCC204508/S288c 菌株。蛋白序列全長(zhǎng)為380個(gè)氨基酸，并且已經(jīng)從蛋白水平上得到證實(shí)[19,20]。該蛋白位于細(xì)胞膜上,為跨膜蛋白，COS12與物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸有關(guān)[21]，但目前為止關(guān)于其在調(diào)控木糖利用機(jī)制方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用C5D-P-M菌株構(gòu)建COS12的缺失突變株C5D-P-M-CIT2Δ，研究共生長(zhǎng)特性，以期揭示CIT2基因?qū)︶劸平湍改咎抢玫挠绊憽?/p>
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及載體 質(zhì)粒pUG6、pSH65由實(shí)驗(yàn)室保存，釀酒酵母菌株C5D-P-M(表型為MatAura3-52，轉(zhuǎn)入含有攜帶TPI-PxylA基因的質(zhì)粒pYES2，能夠代謝木糖)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。
1.1.2 酶類及其他生化試劑TaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒RNeasy?Mini Kit (50) Cat.NO.74104、TAKARA熒光定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Omniscrippt?Reverse Transcription購(gòu)自QIAGEN公司。
1.1.3 培養(yǎng)基配方 大腸桿菌培養(yǎng)基LB：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，l% NaCl，pH 7.0。
酵母培養(yǎng)基YPD：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，平板添加2%瓊脂。
選擇培養(yǎng)基SC：0.67%YNB，2%葡萄糖，平板添加2%瓊脂。
釀酒酵母誘導(dǎo)表達(dá)YPG培養(yǎng)基：1.0%酵母膏，2.0%蛋白胨，1.34% YNB，4×10-5%生物素，1.0%甘油；10.0% 100 mmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液，水1 000 mL。
1.2 方法
1.2.1 釀酒酵母C5D-P-M中CIT2基因的敲除①敲除組件引物設(shè)計(jì)。根據(jù)已知的CIT2基因和質(zhì)粒pUG6的核甘酸序列，設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1。
表1 CIT2基因敲除及驗(yàn)證引物Table 1 CIT2 gene knockout and verified primers.
②敲除組件的PCR合成。以pUG6質(zhì)粒為模板，用敲除組件引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增敲除組件。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2 μL 10×ExTaqBuffer，0.4 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L)，0.4 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L)，0.4 μL 的dNTP Mix(5mmol/L each dNTP)，0.1 μL的pUG6模板，0.1 μL 的ExTaq酶，0.1 μL ddH2O。
PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?9℃蓋子預(yù)熱， 94℃預(yù)變性5 min；94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 1 min 20 s，25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃無(wú)限延伸。
③敲除組件連接pGEM-T載體。連接體系如下：目的PCR片段(可變)，pZeroBack載體(約25 ng/μL)1 μL，2×Reaction Buffer 5 μL，T4 DNA Ligase(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足到10 μL。輕輕彈動(dòng)離心管以混勻內(nèi)容物，短暫離心3～5 s，將混合反應(yīng)液放置室溫(22℃)反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上。取部分連接產(chǎn)物加到50～100 mL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30 min。將離心管置于42℃恒溫90 s，取出管后立即置于冰浴中放置2～3 min，期間不要搖動(dòng)離心管。向離心管中加入250～500 mL 37℃預(yù)熱的LB(不含抗生素)培養(yǎng)基，150 r/min 37℃振蕩培養(yǎng)45 min。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。將離心管中的菌液混勻，吸取100 mL加到含氨芐青霉素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的彎頭玻璃棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開(kāi)。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養(yǎng)12～16 h。
1.2.2 突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的構(gòu)建 出發(fā)菌株化學(xué)轉(zhuǎn)化pSH65及Kanr基因的切除：活化轉(zhuǎn)進(jìn)敲除組件的釀酒酵母C5D-P-M，用滅菌去離子水清洗兩遍后加入1 mL滅菌去離子水取100 μL備用；鮭魚(yú)精50 μL放入沸水中煮10 min備用；PEG3350取240 μL及LiAC36 μL加入以上釀酒酵母與鮭魚(yú)精和敲除組件渦懸混勻后放入30℃水浴中30 min，再放入42℃水浴45 min；加入1 mL YPD培養(yǎng)基于30℃ 120 r/min培養(yǎng)1 h；取20 μL涂于含有抗生素腐草霉素的YPD平板上48 h左右觀察：將轉(zhuǎn)進(jìn)pSH65的菌株用YPG培養(yǎng)基培養(yǎng)4～7 h，誘導(dǎo)質(zhì)粒pSH65上Cre基因表達(dá)，切除基因組上Kanr基因，去除抗性；用YPD培養(yǎng)基傳代丟失釀酒酵母中質(zhì)粒pSH65，得到CIT2缺失的C5D-P-M-CIT2Δ。
1.2.3 突變菌株木糖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平熒光定量分析 以試劑盒所提RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋100倍為模板做熒光定量PCR。按照TaKaRa公司的熒光定量試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)液及操作。
利用Primer Express 3.0軟件所設(shè)計(jì)的9對(duì)引物如表2所示。分別是參與三羧酸循環(huán)的ACO1(烏頭酸酶)基因、TCA循壞中的關(guān)鍵酶FUM1(延胡索酸酶)基因、在糖酵解第二步中GND1(6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶)基因、三羧酸循環(huán)中重要的限速酶IDH2(異檸檬酸脫氫酶)基因、在三羧酸循環(huán)中提供能量的MDH1(蘋(píng)果酸脫氫酶)基因、TCA循環(huán)中唯一一個(gè)整合于膜上的多亞基酶SDH1(琥珀酸脫氫酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，為線粒體的一種標(biāo)志酶)基因、催化糖酵解第二部分開(kāi)始的TDH3(3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因、木糖代謝進(jìn)入到戊糖磷酸途徑后的TKL1(轉(zhuǎn)酮醇酶)基因。
表2 內(nèi)參肌動(dòng)蛋白及差異基因熒光定量引物Table 2 Fluorescence quantitative primer of actin and differentially expressed genes.
1.2.4 突變菌株生理生化分析 ①生長(zhǎng)速率測(cè)定。從平板上挑取C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ單菌落分別接入釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC中，于30℃ 160 r/min培養(yǎng)，至培養(yǎng)基OD值約為1.0時(shí),用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確OD值。取10個(gè)已滅菌的50 mL三角瓶，分別裝入10 mL液體釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC，將C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ各接入5個(gè)三角瓶中，每個(gè)三角瓶中接入3×108個(gè)細(xì)胞(OD值為1.0時(shí)釀酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)約為3×107個(gè)，通過(guò)所測(cè)定OD值可計(jì)算出來(lái)具體每種菌株所需接種體積)，每種菌株設(shè)置5個(gè)平行，菌體濃度OD600，分別取0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、14 h、22 h、28 h、34 h、40 h培養(yǎng)液測(cè)OD600值。
②剩余葡萄糖含量測(cè)定。從平板上挑取C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ分別接入釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC中，于30℃ 160 r/min培養(yǎng)，至培養(yǎng)基OD值約為1.0時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確OD值。取10個(gè)已滅菌50 mL三角瓶，分別裝入10 mL液體釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC，將C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ各接入5個(gè)三角瓶中，每個(gè)三角瓶中接入3×108個(gè)細(xì)胞(OD值為1.0時(shí)釀酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)約為3×107個(gè)，通過(guò)所測(cè)定OD值可計(jì)算出每種菌株所需接種體積)，每種菌株設(shè)置5個(gè)平行，菌體濃度OD600，在0 h 、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、23 h、31 h、39 h、47 h、55 h、63 h、71 h分別取培養(yǎng)液1.5 mL。發(fā)酵樣品用0.45 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾，濾液放于-80℃冰箱保存用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量用高效液相色譜分析儀(HPLC)進(jìn)行分析。色譜分離柱為BioRad公司離子色譜柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)，保護(hù)柱為Micro-Guard cation H(30 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為4～12 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，折光示差檢測(cè)器SHO-DEX RI-101進(jìn)行檢測(cè)。
③剩余木糖含量測(cè)定。從平板上挑取C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ分別接入釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC中，于30℃ 160 r/min培養(yǎng)，至培養(yǎng)基OD值約為1.0時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確OD值。取10個(gè)已滅菌50 mL三角瓶，分別裝入10 mL液體釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC，將C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ各接入5個(gè)三角瓶中，每個(gè)三角瓶中接入3×108個(gè)細(xì)胞(OD值為1.0時(shí)釀酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)約為3×107個(gè)，通過(guò)所測(cè)定OD值可計(jì)算出來(lái)具體每種菌株所需接種體積)，每種菌株設(shè)置5個(gè)平行，菌體濃度OD600，在0 h 、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、23 h、31 h、39 h、47 h、55 h、63 h、71 h分別取培養(yǎng)液1.5 mL。發(fā)酵樣品用0.45 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾，濾液放于-80℃冰箱保存用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量用高效液相色譜分析儀(HPLC)進(jìn)行分析。色譜分離柱為BioRad公司離子色譜柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)，保護(hù)柱為Micro-Guard cation H(30 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為4～12 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，折光示差檢測(cè)器SHO-DEX RI-101進(jìn)行檢測(cè)。
2 結(jié)果與分析
2.1 釀酒酵母C5D-P-M中CIT2基因的敲除
通過(guò)PCR方法獲得敲除組件(1 808 bp)，擴(kuò)增測(cè)序分析，證實(shí)獲得的序列與理論設(shè)計(jì)引物序列一致。
圖1 敲除組件PCR電泳對(duì)照?qǐng)DFig.1 Knockout component PCR electrophoretogram.M:DL 2 000; 1:敲除組件1 808 bp
2.2 熒光定量PCR測(cè)定C5D-P-M-CIT2Δ菌株木糖代謝相關(guān)基因的調(diào)控作用
熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示，其中有6個(gè)基因包括ACO1、GND1、IDH2、SDH1、TDH3、TKL1在C5D-P-M-CIT2Δ中比在C5D-P-M中表達(dá)上調(diào)，2個(gè)基因包括FUM1、MDH1在C5D-P-M-CIT2Δ中比在C5D-P-M中表達(dá)下調(diào)。表達(dá)上調(diào)的基因在一定程度上可以使發(fā)酵木酮糖的乙醇得率提高，而表達(dá)下調(diào)的基因則對(duì)糖代謝的推動(dòng)作用不明顯甚至起抑制作用。
圖2 熒光定量PCR結(jié)果Fig.2 Fluorescence quantitative PCR result.
2.3 工程菌株生理生化的測(cè)定
2.3.1 生長(zhǎng)速率結(jié)果 C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ兩株菌的生長(zhǎng)速率如圖3所示。其中同一時(shí)間C5D-P-M-CIT2Δ比C5D-P-M生長(zhǎng)速度略快，尤其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)C5D-P-M-CIT2Δ比C5D-P-M的生長(zhǎng)速率更快，到達(dá)穩(wěn)定期生長(zhǎng)速率基本持平。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，突變菌株平均增速是出發(fā)菌株的1.272倍，適應(yīng)期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增速明顯。
圖3 C5D-P-M-CIT2Δ與C5D-P-M生長(zhǎng)速率比較Fig.3 The growth rate of C5D-P-M-CIT2Δ compared with C5D-P-M.
2.3.2 剩余葡萄糖含量比較結(jié)果 C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ兩株菌的剩余葡萄糖量比較如圖4所示。其中，在適應(yīng)期突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的剩余葡萄糖量略低于出發(fā)菌株；在對(duì)數(shù)期的12～31 h內(nèi)突變菌株的剩余葡萄糖量明顯低于出發(fā)菌株，且差異顯著，尤其是在15～23 h內(nèi)差異是極顯著的；隨著菌株進(jìn)入平穩(wěn)期，兩株菌的剩余葡萄糖量的差異越來(lái)越小，直到葡萄糖利用完全。
圖4 剩余葡萄糖含量Fig.4 Residual glucose quantity.
2.3.3 剩余木糖含量比較結(jié)果 C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ兩株菌的剩余木糖量比較如圖5所示。在適應(yīng)期兩株菌的木糖含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)都在減少，其中突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的木糖含量明顯低于出發(fā)菌株C5D-P-M，且差異顯著；進(jìn)入對(duì)數(shù)期后兩株菌的剩余木糖含量還是在不斷減少，突變菌株的剩余木糖含量始終低于出發(fā)菌株，但差異越來(lái)越小。
圖5 剩余木糖含量Fig.5 Residual xylose quantity.
3 討論
木糖異構(gòu)酶是木糖利用中的關(guān)鍵酶[22]。本研究利用轉(zhuǎn)入木糖異構(gòu)酶基因的重組釀酒酵母C5D-P-M，以DUP240家族中的CIT2基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)基因敲除技術(shù)將CIT2基因去除，獲得缺失CIT2基因的釀酒酵母C5D-P-M-CIT2Δ后，以出發(fā)菌株C5D-P-M為對(duì)照，研究其生長(zhǎng)速率、剩余葡萄糖含量及剩余木糖含量生理生化指標(biāo)及進(jìn)行熒光定量PCR分析。在生長(zhǎng)速率測(cè)定中前期選擇每2 h取樣一次，后期每隔12 h取樣一次，根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)做圖所得，在接種量相同的情況下，已經(jīng)敲除CIT2基因的釀酒酵母C5D-P-M-CIT2Δ比未敲除基因的對(duì)照菌株C5D-P-M增速明顯，且實(shí)驗(yàn)菌株是對(duì)照菌株前期每2 h平均增速的3.2倍，后期平均增速為1.6倍，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，平均增速為1.3倍，前期增速約是后期的2倍，前期增速明顯大于后期。由此可知當(dāng)敲除釀酒酵母中CIT2基因后，加強(qiáng)了釀酒酵母本身的糖運(yùn)輸或糖代謝過(guò)程，當(dāng)釀酒酵母有充足的能源時(shí)，其生長(zhǎng)速率明顯提高，但當(dāng)糖運(yùn)輸或糖代謝達(dá)到一定水平時(shí)其生長(zhǎng)速率增加相對(duì)緩慢。
根據(jù)剩余葡萄糖含量可知兩株菌對(duì)葡萄糖的利用率都是100%，但是葡萄糖要比木糖先利用完，這在葡萄糖與木糖共發(fā)酵過(guò)程中是普遍存在的[20]，在48～60 h之間完全用完。實(shí)驗(yàn)菌株C5D-P-M-CIT2Δ比對(duì)照菌株C5D-P-M利用葡萄糖的效率要略高，這是因?yàn)樵谇贸鼵IT2基因后，實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)糖的運(yùn)輸能力比對(duì)照菌株略有加強(qiáng)，因此帶動(dòng)了糖代謝的加速進(jìn)行，最終表現(xiàn)在時(shí)間上就是實(shí)驗(yàn)菌株比對(duì)照菌株到48 h對(duì)葡萄糖的利用量多約0.2 g/mL。木糖剩余量與葡萄糖剩余量在趨勢(shì)上是相同的，總體都是實(shí)驗(yàn)菌株比對(duì)照菌株利用的能力要略強(qiáng)，說(shuō)明到后期兩株菌對(duì)木糖的利用率是相當(dāng)?shù)?，由此可知釀酒酵母中CIT2基因的敲除主要影響的是糖運(yùn)輸過(guò)程，并且此基因?qū)μ沁\(yùn)輸過(guò)程是抑制與阻礙作用，對(duì)于糖代謝過(guò)程是受糖運(yùn)輸過(guò)程影響，當(dāng)有豐富糖源供給時(shí)會(huì)增強(qiáng)糖代謝流向下游，但當(dāng)糖代謝過(guò)程達(dá)到一定程度后糖運(yùn)輸對(duì)糖代謝的推動(dòng)作用就會(huì)不明顯。綜上所述CIT2基因?qū)︶劸平湍咐媚咎蔷哂胸?fù)調(diào)控作用。
根據(jù)Thomas等[23]進(jìn)行的研究結(jié)果，針對(duì)釀酒酵母中糖代謝過(guò)程中所涉及到的相關(guān)8個(gè)基因進(jìn)行熒光定量PCR分析，所得結(jié)果中6個(gè)相關(guān)基因ACO1、GND1、IDH2、SDH1、TDH3、TKL1的表達(dá)量均增加。根據(jù)這6個(gè)基因表達(dá)量的提高可知在糖運(yùn)輸作用加強(qiáng)后，釀酒酵母本身的糖代謝過(guò)程的底物量充足，促使其代謝過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)加強(qiáng)，由于木糖代謝的加入，使得糖酵解本身向戊糖磷酸途徑加多，與木糖代謝一致轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油，因此TDH3(3-磷酸甘油醛脫氫酶)的表達(dá)量增加，隨之加強(qiáng)了糖代謝過(guò)程，轉(zhuǎn)向乙醇發(fā)酵。
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Research on the Effects ofCIT2 Gene on Xylose Utilization of the RecombinantSaccharomycescerevisiae
LI Wei-wei1,2, ZHANG Ji1, CHEN Chao-ru1, WANG Zhi1, QU Juan-juan2*, DUN Bao-qing1*, LI Gui-ying1, LU Ming1
1.CropGeneticResourcesandGeneticImprovementofMajorNationalScienceandEngineering,InstituteofCropScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China;2.College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Xylosefermentationisoneofthebottleneckofcellulosicethanolindustry.ThetransformationofSaccharomyces cerevisiaeforxylosemetabolismhasbecomeoneoftheresearchhotspotatpresent.InordertostudytheinfluenceofCIT2geneonxyloseutilizationofSaccharomyces cerevisiaestrainC5D-P-Mforglucoseandxyloseco-fermentation,theCIT2genedisruptioncassetteproducedbyoverlappingPCRtechnology,transformedintoC5D-P-MforknockoutofCIT2byhomologousrecombinationandmutantstrainC5D-P-M-CIT2Δwasgainedfinally.IncontrastwithC5D-P-M,thegrowthrate,glucoseutilization,xyloseutilization,andethanolproductionofC5D-P-M-CIT2Δhadimprovedtosomeextent.TheresultsuggestedCIT2geneisonefactorthatcaninfluencethexyloseutilizationanditsknockoutcanimprovexyloseutilizationofSaccharomyces cerevisiae.
Saccharomyces cerevisiae; CIT2gene;geneknockout;xylosemetabolism
2016-07-20; 接受日期：2016-09-30
公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201503135-16)資助。
李維維，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail: zhangji1140@126.com。*通信作者：曲娟娟,教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸镞z傳育種。E-mail:juanjuanqu@126.com；頓寶慶，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物質(zhì)能源及秸稈的綜合利用研究。E-mail：dunbaoqing@caas.cn
10.3969/j.issn.2095-2341.2016.06.11
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李維維, 張 驥, 陳朝儒, 王 智, 曲娟娟, 頓寶慶*, 李桂英, 路 明
1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程, 北京 100081;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030
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CIT2基因?qū)ν蛔冡劸平湍改咎抢糜绊懙难芯?/p>
李維維1,2, 張 驥1, 陳朝儒1, 王 智1, 曲娟娟2*, 頓寶慶1*, 李桂英1, 路 明1
1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程, 北京 100081;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030
木糖利用困難是秸稈燃料乙醇產(chǎn)業(yè)化的制約因素，改造釀酒酵母使其能夠代謝木糖生成乙醇是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。為了研究CIT2基因?qū)z傳改良釀酒酵母C5D-P-M菌株中葡萄糖與木糖共發(fā)酵過(guò)程中木糖利用的影響，設(shè)計(jì)引物并應(yīng)用重疊PCR技術(shù)獲得敲除CIT2基因的敲除組件，通過(guò)同源重組的方法將C5D-P-M中的CIT2基因敲除得到突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ。通過(guò)對(duì)出發(fā)菌株和突變菌株的生長(zhǎng)速率、葡萄糖利用率、木糖利用率及乙醇產(chǎn)量進(jìn)行研究，結(jié)果表明突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的上述指標(biāo)比出發(fā)菌株C5D-P-M均有一定程度的提高。因此推測(cè)，釀酒酵母中CIT2基因是影響木糖利用的因素之一，CIT2基因的敲除可提高釀酒酵母的木糖利用率。
釀酒酵母；CIT2基因；基因敲除；木糖代謝
能源短缺、氣候變化是目前全世界共同面臨的重大問(wèn)題之一[1]。因此，世界各國(guó)紛紛積極開(kāi)展新能源、可再生生物質(zhì)能的研究與開(kāi)發(fā)[2]，其中以燃料乙醇的研究開(kāi)發(fā)最為成功，也是最可能的替代能源之一[3,4]。
我國(guó)人口眾多，土地資源相對(duì)貧乏，用緊缺的糧食生產(chǎn)乙醇燃料受條件限制。然而資源豐富、價(jià)格低廉的農(nóng)作物秸稈類纖維素生物質(zhì)尚未得到有效充分利用與開(kāi)發(fā)。秸稈類纖維素物質(zhì)具有木質(zhì)纖維復(fù)合物結(jié)構(gòu)，木質(zhì)纖維素的組成和結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。半纖維素構(gòu)成了秸稈類纖維素物質(zhì)中的相當(dāng)部分，約為30%，其水解產(chǎn)物是D-木糖類的五碳糖[5～7]，其中木糖的有效利用是乙醇產(chǎn)業(yè)化利用的重要限制因素之一[8]。
生產(chǎn)燃料乙醇用到的最主要的微生物是釀酒酵母，但是釀酒酵母不能直接代謝利用木糖，因其沒(méi)有專一性代謝木糖生成木酮糖的酶系，并且存在細(xì)胞膜上木糖跨膜運(yùn)輸障礙[9]，只有在釀酒酵母中引入木糖代謝流[10]并利用木酮糖的代謝酶系，將其代謝分解隨后進(jìn)入磷酸戊糖途徑，才能進(jìn)入其本身的代謝流，解決釀酒酵母中葡萄糖與木糖共發(fā)酵過(guò)程中木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響[11～13]。目前已知在全基因組測(cè)序的釀酒酵母S288C中，擁有DUP多基因家族[14]。釀酒酵母的DUP基因家族包括23個(gè)成員，其中可分為兩個(gè)亞族包括DUP240和DUP380。DUP基因家族編碼的部分蛋白能夠促進(jìn)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[15]。DUP240有3個(gè)保守區(qū)域C1、C2、C3和兩個(gè)預(yù)測(cè)橫跨膜結(jié)構(gòu)H1和H2，并且在Dup380蛋白質(zhì)序列中觀察到一個(gè)直接重復(fù)的C1-H1-H2-C2模塊[16]。DUP380亞家族由11個(gè)分別命名為COS1-COS11的基因組成，還包括2個(gè)假基因，所有這些基因連同與其相關(guān)的9個(gè)基因殘基都集中分布在酵母16條染色體的端粒區(qū)域。研究表明，DUP240家族蛋白均與細(xì)胞膜有關(guān)，他們具有不同的亞細(xì)胞定位而且沒(méi)有多余的互作因子[17]。這些DUP家族蛋白可能均在細(xì)胞膜運(yùn)輸中起作用[18]。
COS12蛋白(YGL263W )為DUP380家族成員，源于釀酒酵母ATCC204508/S288c 菌株。蛋白序列全長(zhǎng)為380個(gè)氨基酸，并且已經(jīng)從蛋白水平上得到證實(shí)[19,20]。該蛋白位于細(xì)胞膜上,為跨膜蛋白，COS12與物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸有關(guān)[21]，但目前為止關(guān)于其在調(diào)控木糖利用機(jī)制方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用C5D-P-M菌株構(gòu)建COS12的缺失突變株C5D-P-M-CIT2Δ，研究共生長(zhǎng)特性，以期揭示CIT2基因?qū)︶劸平湍改咎抢玫挠绊憽?/p>
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及載體 質(zhì)粒pUG6、pSH65由實(shí)驗(yàn)室保存，釀酒酵母菌株C5D-P-M(表型為MatAura3-52，轉(zhuǎn)入含有攜帶TPI-PxylA基因的質(zhì)粒pYES2，能夠代謝木糖)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。
1.1.2 酶類及其他生化試劑TaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒RNeasy?Mini Kit (50) Cat.NO.74104、TAKARA熒光定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Omniscrippt?Reverse Transcription購(gòu)自QIAGEN公司。
1.1.3 培養(yǎng)基配方 大腸桿菌培養(yǎng)基LB：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，l% NaCl，pH 7.0。
酵母培養(yǎng)基YPD：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，平板添加2%瓊脂。
選擇培養(yǎng)基SC：0.67%YNB，2%葡萄糖，平板添加2%瓊脂。
釀酒酵母誘導(dǎo)表達(dá)YPG培養(yǎng)基：1.0%酵母膏，2.0%蛋白胨，1.34% YNB，4×10-5%生物素，1.0%甘油；10.0% 100 mmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液，水1 000 mL。
1.2 方法
1.2.1 釀酒酵母C5D-P-M中CIT2基因的敲除①敲除組件引物設(shè)計(jì)。根據(jù)已知的CIT2基因和質(zhì)粒pUG6的核甘酸序列，設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1。
表1 CIT2基因敲除及驗(yàn)證引物Table 1 CIT2 gene knockout and verified primers.
②敲除組件的PCR合成。以pUG6質(zhì)粒為模板，用敲除組件引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增敲除組件。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2 μL 10×ExTaqBuffer，0.4 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L)，0.4 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L)，0.4 μL 的dNTP Mix(5mmol/L each dNTP)，0.1 μL的pUG6模板，0.1 μL 的ExTaq酶，0.1 μL ddH2O。
PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?9℃蓋子預(yù)熱， 94℃預(yù)變性5 min；94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 1 min 20 s，25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃無(wú)限延伸。
③敲除組件連接pGEM-T載體。連接體系如下：目的PCR片段(可變)，pZeroBack載體(約25 ng/μL)1 μL，2×Reaction Buffer 5 μL，T4 DNA Ligase(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足到10 μL。輕輕彈動(dòng)離心管以混勻內(nèi)容物，短暫離心3～5 s，將混合反應(yīng)液放置室溫(22℃)反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上。取部分連接產(chǎn)物加到50～100 mL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30 min。將離心管置于42℃恒溫90 s，取出管后立即置于冰浴中放置2～3 min，期間不要搖動(dòng)離心管。向離心管中加入250～500 mL 37℃預(yù)熱的LB(不含抗生素)培養(yǎng)基，150 r/min 37℃振蕩培養(yǎng)45 min。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。將離心管中的菌液混勻，吸取100 mL加到含氨芐青霉素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的彎頭玻璃棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開(kāi)。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養(yǎng)12～16 h。
1.2.2 突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的構(gòu)建 出發(fā)菌株化學(xué)轉(zhuǎn)化pSH65及Kanr基因的切除：活化轉(zhuǎn)進(jìn)敲除組件的釀酒酵母C5D-P-M，用滅菌去離子水清洗兩遍后加入1 mL滅菌去離子水取100 μL備用；鮭魚(yú)精50 μL放入沸水中煮10 min備用；PEG3350取240 μL及LiAC36 μL加入以上釀酒酵母與鮭魚(yú)精和敲除組件渦懸混勻后放入30℃水浴中30 min，再放入42℃水浴45 min；加入1 mL YPD培養(yǎng)基于30℃ 120 r/min培養(yǎng)1 h；取20 μL涂于含有抗生素腐草霉素的YPD平板上48 h左右觀察：將轉(zhuǎn)進(jìn)pSH65的菌株用YPG培養(yǎng)基培養(yǎng)4～7 h，誘導(dǎo)質(zhì)粒pSH65上Cre基因表達(dá)，切除基因組上Kanr基因，去除抗性；用YPD培養(yǎng)基傳代丟失釀酒酵母中質(zhì)粒pSH65，得到CIT2缺失的C5D-P-M-CIT2Δ。
1.2.3 突變菌株木糖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平熒光定量分析 以試劑盒所提RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋100倍為模板做熒光定量PCR。按照TaKaRa公司的熒光定量試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)液及操作。
利用Primer Express 3.0軟件所設(shè)計(jì)的9對(duì)引物如表2所示。分別是參與三羧酸循環(huán)的ACO1(烏頭酸酶)基因、TCA循壞中的關(guān)鍵酶FUM1(延胡索酸酶)基因、在糖酵解第二步中GND1(6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶)基因、三羧酸循環(huán)中重要的限速酶IDH2(異檸檬酸脫氫酶)基因、在三羧酸循環(huán)中提供能量的MDH1(蘋(píng)果酸脫氫酶)基因、TCA循環(huán)中唯一一個(gè)整合于膜上的多亞基酶SDH1(琥珀酸脫氫酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，為線粒體的一種標(biāo)志酶)基因、催化糖酵解第二部分開(kāi)始的TDH3(3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因、木糖代謝進(jìn)入到戊糖磷酸途徑后的TKL1(轉(zhuǎn)酮醇酶)基因。
表2 內(nèi)參肌動(dòng)蛋白及差異基因熒光定量引物Table 2 Fluorescence quantitative primer of actin and differentially expressed genes.
1.2.4 突變菌株生理生化分析 ①生長(zhǎng)速率測(cè)定。從平板上挑取C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ單菌落分別接入釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC中，于30℃ 160 r/min培養(yǎng)，至培養(yǎng)基OD值約為1.0時(shí),用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確OD值。取10個(gè)已滅菌的50 mL三角瓶，分別裝入10 mL液體釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC，將C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ各接入5個(gè)三角瓶中，每個(gè)三角瓶中接入3×108個(gè)細(xì)胞(OD值為1.0時(shí)釀酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)約為3×107個(gè)，通過(guò)所測(cè)定OD值可計(jì)算出來(lái)具體每種菌株所需接種體積)，每種菌株設(shè)置5個(gè)平行，菌體濃度OD600，分別取0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、14 h、22 h、28 h、34 h、40 h培養(yǎng)液測(cè)OD600值。
②剩余葡萄糖含量測(cè)定。從平板上挑取C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ分別接入釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC中，于30℃ 160 r/min培養(yǎng)，至培養(yǎng)基OD值約為1.0時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確OD值。取10個(gè)已滅菌50 mL三角瓶，分別裝入10 mL液體釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC，將C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ各接入5個(gè)三角瓶中，每個(gè)三角瓶中接入3×108個(gè)細(xì)胞(OD值為1.0時(shí)釀酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)約為3×107個(gè)，通過(guò)所測(cè)定OD值可計(jì)算出每種菌株所需接種體積)，每種菌株設(shè)置5個(gè)平行，菌體濃度OD600，在0 h 、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、23 h、31 h、39 h、47 h、55 h、63 h、71 h分別取培養(yǎng)液1.5 mL。發(fā)酵樣品用0.45 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾，濾液放于-80℃冰箱保存用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量用高效液相色譜分析儀(HPLC)進(jìn)行分析。色譜分離柱為BioRad公司離子色譜柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)，保護(hù)柱為Micro-Guard cation H(30 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為4～12 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，折光示差檢測(cè)器SHO-DEX RI-101進(jìn)行檢測(cè)。
③剩余木糖含量測(cè)定。從平板上挑取C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ分別接入釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC中，于30℃ 160 r/min培養(yǎng)，至培養(yǎng)基OD值約為1.0時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確OD值。取10個(gè)已滅菌50 mL三角瓶，分別裝入10 mL液體釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基SC，將C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ各接入5個(gè)三角瓶中，每個(gè)三角瓶中接入3×108個(gè)細(xì)胞(OD值為1.0時(shí)釀酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)約為3×107個(gè)，通過(guò)所測(cè)定OD值可計(jì)算出來(lái)具體每種菌株所需接種體積)，每種菌株設(shè)置5個(gè)平行，菌體濃度OD600，在0 h 、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、23 h、31 h、39 h、47 h、55 h、63 h、71 h分別取培養(yǎng)液1.5 mL。發(fā)酵樣品用0.45 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾，濾液放于-80℃冰箱保存用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量用高效液相色譜分析儀(HPLC)進(jìn)行分析。色譜分離柱為BioRad公司離子色譜柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)，保護(hù)柱為Micro-Guard cation H(30 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為4～12 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，折光示差檢測(cè)器SHO-DEX RI-101進(jìn)行檢測(cè)。
2 結(jié)果與分析
2.1 釀酒酵母C5D-P-M中CIT2基因的敲除
通過(guò)PCR方法獲得敲除組件(1 808 bp)，擴(kuò)增測(cè)序分析，證實(shí)獲得的序列與理論設(shè)計(jì)引物序列一致。
圖1 敲除組件PCR電泳對(duì)照?qǐng)DFig.1 Knockout component PCR electrophoretogram.M:DL 2 000; 1:敲除組件1 808 bp
2.2 熒光定量PCR測(cè)定C5D-P-M-CIT2Δ菌株木糖代謝相關(guān)基因的調(diào)控作用
熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示，其中有6個(gè)基因包括ACO1、GND1、IDH2、SDH1、TDH3、TKL1在C5D-P-M-CIT2Δ中比在C5D-P-M中表達(dá)上調(diào)，2個(gè)基因包括FUM1、MDH1在C5D-P-M-CIT2Δ中比在C5D-P-M中表達(dá)下調(diào)。表達(dá)上調(diào)的基因在一定程度上可以使發(fā)酵木酮糖的乙醇得率提高，而表達(dá)下調(diào)的基因則對(duì)糖代謝的推動(dòng)作用不明顯甚至起抑制作用。
圖2 熒光定量PCR結(jié)果Fig.2 Fluorescence quantitative PCR result.
2.3 工程菌株生理生化的測(cè)定
2.3.1 生長(zhǎng)速率結(jié)果 C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ兩株菌的生長(zhǎng)速率如圖3所示。其中同一時(shí)間C5D-P-M-CIT2Δ比C5D-P-M生長(zhǎng)速度略快，尤其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)C5D-P-M-CIT2Δ比C5D-P-M的生長(zhǎng)速率更快，到達(dá)穩(wěn)定期生長(zhǎng)速率基本持平。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，突變菌株平均增速是出發(fā)菌株的1.272倍，適應(yīng)期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增速明顯。
圖3 C5D-P-M-CIT2Δ與C5D-P-M生長(zhǎng)速率比較Fig.3 The growth rate of C5D-P-M-CIT2Δ compared with C5D-P-M.
2.3.2 剩余葡萄糖含量比較結(jié)果 C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ兩株菌的剩余葡萄糖量比較如圖4所示。其中，在適應(yīng)期突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的剩余葡萄糖量略低于出發(fā)菌株；在對(duì)數(shù)期的12～31 h內(nèi)突變菌株的剩余葡萄糖量明顯低于出發(fā)菌株，且差異顯著，尤其是在15～23 h內(nèi)差異是極顯著的；隨著菌株進(jìn)入平穩(wěn)期，兩株菌的剩余葡萄糖量的差異越來(lái)越小，直到葡萄糖利用完全。
圖4 剩余葡萄糖含量Fig.4 Residual glucose quantity.
2.3.3 剩余木糖含量比較結(jié)果 C5D-P-M與C5D-P-M-CIT2Δ兩株菌的剩余木糖量比較如圖5所示。在適應(yīng)期兩株菌的木糖含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)都在減少，其中突變菌株C5D-P-M-CIT2Δ的木糖含量明顯低于出發(fā)菌株C5D-P-M，且差異顯著；進(jìn)入對(duì)數(shù)期后兩株菌的剩余木糖含量還是在不斷減少，突變菌株的剩余木糖含量始終低于出發(fā)菌株，但差異越來(lái)越小。
圖5 剩余木糖含量Fig.5 Residual xylose quantity.
3 討論
木糖異構(gòu)酶是木糖利用中的關(guān)鍵酶[22]。本研究利用轉(zhuǎn)入木糖異構(gòu)酶基因的重組釀酒酵母C5D-P-M，以DUP240家族中的CIT2基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)基因敲除技術(shù)將CIT2基因去除，獲得缺失CIT2基因的釀酒酵母C5D-P-M-CIT2Δ后，以出發(fā)菌株C5D-P-M為對(duì)照，研究其生長(zhǎng)速率、剩余葡萄糖含量及剩余木糖含量生理生化指標(biāo)及進(jìn)行熒光定量PCR分析。在生長(zhǎng)速率測(cè)定中前期選擇每2 h取樣一次，后期每隔12 h取樣一次，根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)做圖所得，在接種量相同的情況下，已經(jīng)敲除CIT2基因的釀酒酵母C5D-P-M-CIT2Δ比未敲除基因的對(duì)照菌株C5D-P-M增速明顯，且實(shí)驗(yàn)菌株是對(duì)照菌株前期每2 h平均增速的3.2倍，后期平均增速為1.6倍，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，平均增速為1.3倍，前期增速約是后期的2倍，前期增速明顯大于后期。由此可知當(dāng)敲除釀酒酵母中CIT2基因后，加強(qiáng)了釀酒酵母本身的糖運(yùn)輸或糖代謝過(guò)程，當(dāng)釀酒酵母有充足的能源時(shí)，其生長(zhǎng)速率明顯提高，但當(dāng)糖運(yùn)輸或糖代謝達(dá)到一定水平時(shí)其生長(zhǎng)速率增加相對(duì)緩慢。
根據(jù)剩余葡萄糖含量可知兩株菌對(duì)葡萄糖的利用率都是100%，但是葡萄糖要比木糖先利用完，這在葡萄糖與木糖共發(fā)酵過(guò)程中是普遍存在的[20]，在48～60 h之間完全用完。實(shí)驗(yàn)菌株C5D-P-M-CIT2Δ比對(duì)照菌株C5D-P-M利用葡萄糖的效率要略高，這是因?yàn)樵谇贸鼵IT2基因后，實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)糖的運(yùn)輸能力比對(duì)照菌株略有加強(qiáng)，因此帶動(dòng)了糖代謝的加速進(jìn)行，最終表現(xiàn)在時(shí)間上就是實(shí)驗(yàn)菌株比對(duì)照菌株到48 h對(duì)葡萄糖的利用量多約0.2 g/mL。木糖剩余量與葡萄糖剩余量在趨勢(shì)上是相同的，總體都是實(shí)驗(yàn)菌株比對(duì)照菌株利用的能力要略強(qiáng)，說(shuō)明到后期兩株菌對(duì)木糖的利用率是相當(dāng)?shù)?，由此可知釀酒酵母中CIT2基因的敲除主要影響的是糖運(yùn)輸過(guò)程，并且此基因?qū)μ沁\(yùn)輸過(guò)程是抑制與阻礙作用，對(duì)于糖代謝過(guò)程是受糖運(yùn)輸過(guò)程影響，當(dāng)有豐富糖源供給時(shí)會(huì)增強(qiáng)糖代謝流向下游，但當(dāng)糖代謝過(guò)程達(dá)到一定程度后糖運(yùn)輸對(duì)糖代謝的推動(dòng)作用就會(huì)不明顯。綜上所述CIT2基因?qū)︶劸平湍咐媚咎蔷哂胸?fù)調(diào)控作用。
根據(jù)Thomas等[23]進(jìn)行的研究結(jié)果，針對(duì)釀酒酵母中糖代謝過(guò)程中所涉及到的相關(guān)8個(gè)基因進(jìn)行熒光定量PCR分析，所得結(jié)果中6個(gè)相關(guān)基因ACO1、GND1、IDH2、SDH1、TDH3、TKL1的表達(dá)量均增加。根據(jù)這6個(gè)基因表達(dá)量的提高可知在糖運(yùn)輸作用加強(qiáng)后，釀酒酵母本身的糖代謝過(guò)程的底物量充足，促使其代謝過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)加強(qiáng)，由于木糖代謝的加入，使得糖酵解本身向戊糖磷酸途徑加多，與木糖代謝一致轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油，因此TDH3(3-磷酸甘油醛脫氫酶)的表達(dá)量增加，隨之加強(qiáng)了糖代謝過(guò)程，轉(zhuǎn)向乙醇發(fā)酵。
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Research on the Effects ofCIT2 Gene on Xylose Utilization of the RecombinantSaccharomycescerevisiae
LI Wei-wei1,2, ZHANG Ji1, CHEN Chao-ru1, WANG Zhi1, QU Juan-juan2*, DUN Bao-qing1*, LI Gui-ying1, LU Ming1
1.CropGeneticResourcesandGeneticImprovementofMajorNationalScienceandEngineering,InstituteofCropScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China;2.College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Xylosefermentationisoneofthebottleneckofcellulosicethanolindustry.ThetransformationofSaccharomyces cerevisiaeforxylosemetabolismhasbecomeoneoftheresearchhotspotatpresent.InordertostudytheinfluenceofCIT2geneonxyloseutilizationofSaccharomyces cerevisiaestrainC5D-P-Mforglucoseandxyloseco-fermentation,theCIT2genedisruptioncassetteproducedbyoverlappingPCRtechnology,transformedintoC5D-P-MforknockoutofCIT2byhomologousrecombinationandmutantstrainC5D-P-M-CIT2Δwasgainedfinally.IncontrastwithC5D-P-M,thegrowthrate,glucoseutilization,xyloseutilization,andethanolproductionofC5D-P-M-CIT2Δhadimprovedtosomeextent.TheresultsuggestedCIT2geneisonefactorthatcaninfluencethexyloseutilizationanditsknockoutcanimprovexyloseutilizationofSaccharomyces cerevisiae.
Saccharomyces cerevisiae; CIT2gene;geneknockout;xylosemetabolism
2016-07-20; 接受日期：2016-09-30
公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201503135-16)資助。
李維維，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail: zhangji1140@126.com。*通信作者：曲娟娟,教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸镞z傳育種。E-mail:juanjuanqu@126.com；頓寶慶，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物質(zhì)能源及秸稈的綜合利用研究。E-mail：dunbaoqing@caas.cn
10.3969/j.issn.2095-2341.2016.06.11
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