抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1的遺傳穩(wěn)定性分析

劉 洋, 劉相國(guó), 汪洋洲, 趙方方, 張 艷, 肖國(guó)紅, 馮樹丹, 韓四平*, 尹悅佳*

1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所, 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)春 130033;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)所, 吉林 公主嶺 136100;3.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 哈爾濱 150025

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抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1的遺傳穩(wěn)定性分析

劉 洋1, 劉相國(guó)1, 汪洋洲2, 趙方方3, 張 艷1, 肖國(guó)紅3, 馮樹丹3, 韓四平1*, 尹悅佳1*

1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所, 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)春 130033;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)所, 吉林 公主嶺 136100;3.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 哈爾濱 150025

目的基因和目標(biāo)性狀遺傳穩(wěn)定性是轉(zhuǎn)基因植物新品種選育和產(chǎn)業(yè)化的重要前提。以進(jìn)入農(nóng)業(yè)部環(huán)境釋放的抗蟲抗除草劑雙價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1為試驗(yàn)材料，采用PCR、RT-PCR和免疫試紙條技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米連續(xù)3代目的基因cryNGc和bar整合及表達(dá)的遺傳穩(wěn)定性，采用心葉期除草劑草銨膦抗性鑒定和心葉期/穗期亞洲玉米螟抗性鑒定實(shí)驗(yàn)詳細(xì)分析了目標(biāo)性狀的遺傳穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明：CryNGc和PAT蛋白在HiII-NGc-1中連續(xù)3代遺傳穩(wěn)定，高世代穩(wěn)定耐受正常5倍大田除草劑草銨膦使用濃度，心葉期和穗期高抗亞洲玉米螟性狀穩(wěn)定，具有潛在的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1目的基因和目標(biāo)性狀遺傳穩(wěn)定性的明確為開展下一步生物安全評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)，對(duì)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因抗蟲抗除草劑玉米新品種的選育和產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。

抗蟲；抗除草劑；轉(zhuǎn)基因玉米；遺傳穩(wěn)定性

轉(zhuǎn)基因植物新品種的選育要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究、中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗(yàn)、獲批安全證書，最終才能進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化。遺傳穩(wěn)定性是各階段選育的前提，對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物育種的成功與否具有關(guān)鍵作用。遺傳穩(wěn)定性主要考察轉(zhuǎn)基因植物不同世代目的基因整合的穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)的穩(wěn)定性和目標(biāo)性狀表現(xiàn)的穩(wěn)定性等方面[1]。

目的基因片段大小、轉(zhuǎn)化方法、拷貝數(shù)、甲基化、外界環(huán)境都能影響基因遺傳和表達(dá)的穩(wěn)定性[2～4]。 Srivastava等[5]觀察到轉(zhuǎn)基因小麥轉(zhuǎn)化株系2B-2在T1代中能正常表達(dá)，在T2代中僅能檢測(cè)到，在T3中發(fā)生了丟失。Reddy等[6]觀察到在T2、T3代轉(zhuǎn)基因大豆的GUS表達(dá)水平不同，由于轉(zhuǎn)基因甲基化的水平使轉(zhuǎn)基因大豆中15 kDa的玉米蛋白基因的表達(dá)也不同。也有許多研究表明目的基因在轉(zhuǎn)基因植物中能穩(wěn)定遺傳并表達(dá)，如轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻Bar68-1、轉(zhuǎn) Btcry1Ah基因抗蟲玉米、轉(zhuǎn)cry6Aa2m基因大豆，分別對(duì)其進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因材料均可穩(wěn)定表達(dá)[7～9]，但上述研究均為轉(zhuǎn)單基因材料遺傳穩(wěn)定性分析。

近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為應(yīng)用發(fā)展最為迅速的作物育種技術(shù)。復(fù)合型轉(zhuǎn)基因玉米被大范圍推廣，2014年復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物種植面積為5 100萬(wàn)hm2。已商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因玉米主要是抗蟲和耐除草劑品種。但國(guó)內(nèi)尚無(wú)轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化[10]。具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、抗亞洲玉米螟抗草銨膦雙價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米的遺傳穩(wěn)定性分析尚未見報(bào)道。

本研究以進(jìn)入農(nóng)業(yè)部環(huán)境釋放的抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1為試驗(yàn)材料，開展目的基因cryNGc和bar的整合穩(wěn)定性、表達(dá)穩(wěn)定性、目標(biāo)性狀表現(xiàn)的穩(wěn)定性分析評(píng)價(jià)，為完成農(nóng)業(yè)部環(huán)境釋放，進(jìn)一步申請(qǐng)生產(chǎn)性試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，對(duì)我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲抗除草劑玉米的安全評(píng)價(jià)新品種選育及產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

非轉(zhuǎn)基因玉米(轉(zhuǎn)基因受體材料)為HiII，轉(zhuǎn)基因玉米為轉(zhuǎn)化體HiII-NGc-1，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供。亞洲玉米螟由北京綻諾思特生物科技有限公司提供。

1.2 不同世代轉(zhuǎn)基因材料的獲得

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1。待幼苗長(zhǎng)出1～2片新葉后移入大花盆，轉(zhuǎn)移至大型溫室，待雄穗散粉后，自交授粉，獲得T1代種子。將T1代種子種植到大田，以后按照常規(guī)方法進(jìn)行日常管理和自交授粉，以此類推獲得T2、T3、T4代材料。

1.3 連續(xù)3代目的基因整合的穩(wěn)定性

采用PCR技術(shù)研究轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1的T2、T3、T4代cryNGc和bar基因整合穩(wěn)定性。待轉(zhuǎn)基因玉米生長(zhǎng)到心葉期時(shí)，提取植株葉片基因組DNA，設(shè)計(jì)引物PCR進(jìn)行擴(kuò)增。其中空白對(duì)照為水，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因玉米HiII，陽(yáng)性對(duì)照為含有目的基因載體的質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物序列見表1。擴(kuò)增條件為：95℃，5 min；95℃ 30 s，58℃ 50 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。在1%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the study.

1.4 連續(xù)3代目的基因表達(dá)的穩(wěn)定性

采用RT-PCR、免疫試紙條檢測(cè)方法研究轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1的T2、T3、T4代cryNGc和bar基因表達(dá)的穩(wěn)定性。

1.4.1 RT-PCR 待轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)心葉期時(shí)，提取玉米植株葉片總RNA。以RNA為模板合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增目的片段。目的基因cryNGc、bar、內(nèi)參GAPDH引物見表1。

1.4.2 免疫試紙條檢測(cè) 取約1 cm2左右新鮮幼嫩葉片放在1.5 mL的離心管中，用小型研磨棒將材料研磨成粉，向管中加入500 μL純凈水，放入檢測(cè)試紙條，1 min后觀察質(zhì)控線和檢測(cè)線。

1.5 田間除草劑耐性

以玉米轉(zhuǎn)化體HiII-NGc-1的高世代T4代為試驗(yàn)材料，4～6葉期對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米材料噴施除草劑草銨膦，噴施處理分為：不處理、清水噴施、單倍劑量、2倍劑量和5倍劑量。大田除草劑正常使用濃度為0.3 mL/m2(保試達(dá)，18%)。本研究最大除草劑濃度大致相當(dāng)于大田正常使用濃度的5倍，即：1.5 mL/m2。噴灑7 d、28 d后分別觀察玉米植株藥害情況，藥害癥狀分級(jí)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17980.42執(zhí)行，級(jí)別越低說(shuō)明抗性越高。1級(jí)為玉米生長(zhǎng)正常，無(wú)任何受害癥狀；2級(jí)：玉米輕微藥害，藥害少于10%；3級(jí)：玉米中等藥害，后期能恢復(fù)，不影響產(chǎn)量；4級(jí)：玉米藥害較重，難以恢復(fù)，造成減產(chǎn)；5級(jí)：玉米藥害嚴(yán)重，不能恢復(fù)，造成明顯減產(chǎn)或絕產(chǎn)。

1.6 田間抗蟲性

以玉米轉(zhuǎn)化體HiII-NGc-1的高世代T4代為試驗(yàn)材料代表，心葉期將2個(gè)中等大小、即將孵化的玉米螟卵塊接于非轉(zhuǎn)基因玉米HiII、轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1心葉中。接蟲14 d后，參照國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1248.5-2006)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查食葉級(jí)別，評(píng)價(jià)抗蟲級(jí)別。

穗期將已經(jīng)黑頭的、即將孵化的玉米螟卵塊接于轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1、非轉(zhuǎn)基因玉米HiII的花絲叢中。每株接2～3個(gè)中等大小的卵塊，接蟲14 d后調(diào)查雌穗被害程度及植株被害情況。參照國(guó)標(biāo)(農(nóng)業(yè)部953公告-10.1-2007)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查玉米蛀孔數(shù)量、蛀孔隧道長(zhǎng)度以及存活幼蟲數(shù)量，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析方法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)3代目的基因整合的穩(wěn)定性

在轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1的T2、T3和T4代材料和非轉(zhuǎn)基因玉米材料HiII的心葉期，用PCR技術(shù)分析目的基因遺傳穩(wěn)定性。圖1研究結(jié)果表明：目的基因cryNGc和bar分別在約1 017 bp、552 bp出現(xiàn)特異性條帶，其大小與陽(yáng)性對(duì)照的特異性條帶大小一致。陰性對(duì)照和空白對(duì)照未出現(xiàn)特異性條帶。該結(jié)果說(shuō)明外源目的基因cryNGc、bar已整合到玉米基因組中且穩(wěn)定遺傳。

圖1 T2～T4代轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1 PCR檢測(cè)Fig.1 PCR identification of transgenic maize HiII-NGc-1 at T2～T4 generation.A：cryNGc基因；B：bar基因。M：DL 2000 Marker；1：陽(yáng)性對(duì)照；2：空白對(duì)照；3：陰性對(duì)照；4～6：T2～T4代轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1

2.2 連續(xù)3代目的基因表達(dá)的穩(wěn)定性

2.2.1 RT-PCR 為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米目的基因cryNGc、bar在轉(zhuǎn)錄水平上是否穩(wěn)定遺傳，提取轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米的葉片總RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用以RNA為模板合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增目的片段。圖2研究結(jié)果表明：內(nèi)參基因GADPH擴(kuò)增正確，說(shuō)明RNA質(zhì)量完好。陽(yáng)性質(zhì)粒和T2～T4代轉(zhuǎn)基因材料擴(kuò)增出特異性條帶，目的基因cryNGc和bar分別呈現(xiàn)約1 017 bp、552 bp大小的檢測(cè)條帶。陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未檢測(cè)出條帶，該結(jié)果說(shuō)明：HiII-NGc-1轉(zhuǎn)化體連續(xù)3代均有表達(dá)，外源基因cryNGc、bar已在玉米基因組中穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄。

2.2.2 免疫檢測(cè)試紙條檢測(cè) 選取T2、T3和T4代轉(zhuǎn)基因玉米材料，取幼嫩葉片利用Bt-Cry1Ab/Ac和bar免疫試紙條分別進(jìn)行測(cè)試，分析抗蟲基因cryNGc和抗除草劑基因bar表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性。圖3(彩圖見圖版一)研究結(jié)果表明，非轉(zhuǎn)基因玉米HiII出現(xiàn)質(zhì)控線，說(shuō)明免疫試紙條可用于蛋白表達(dá)的檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因材料出現(xiàn)質(zhì)控線和檢測(cè)線，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1中目的基因cryNGc和bar均有表達(dá)。T2、T3和T4代轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1的陽(yáng)性結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1連續(xù)3代穩(wěn)定表達(dá)。

圖2 T2～T4代轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1RT-PCR分析Fig.2 RT-PCR detection of transgenic maize HiII-NGc-1 at T2～T4 generation.M：DL 2 000 Marker；1,6,11：空白對(duì)照；2：陰性對(duì)照；7,12：陽(yáng)性對(duì)照；3,8,13：T2代轉(zhuǎn)基因材料；4,9,14：T3代轉(zhuǎn)基因材料；5,10,15：T4代轉(zhuǎn)基因材料。

圖3 轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1 T2～T4代免疫試紙條檢測(cè)Fig.3 Strip test of transgenic maize HiII-NGc-1 at T2～T4 generation.A:Bt-Cry1Ab/Ac試紙條；1:非轉(zhuǎn)基因玉米；2:T2代轉(zhuǎn)基因玉米；3:T3代轉(zhuǎn)基因玉米；4:T4代轉(zhuǎn)基因玉米；B: bar試紙條；1:非轉(zhuǎn)基因玉米；2:T2代轉(zhuǎn)基因玉米；3:T3代轉(zhuǎn)基因玉米；4:T4代轉(zhuǎn)基因玉米(彩圖見圖版一)

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1耐除草劑性

在心葉期，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1的T4代材料和非轉(zhuǎn)基因玉米HiII進(jìn)行除草劑草銨膦噴施處理，結(jié)果見表2。本試驗(yàn)使用的最高草銨膦劑量大致相當(dāng)于大田正常使用濃度的5倍，噴灑7 d后調(diào)查藥害情況發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米在不進(jìn)行任何處理和清水處理均可正常生長(zhǎng)，且無(wú)明顯變化。而在噴施1倍除草劑處理中，非轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)藥害，且受害率100%。轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1在5倍劑量除草劑噴施后，生長(zhǎng)正常，無(wú)受害情況發(fā)生，仍具有較高抗性。

圖4(彩圖見圖版一)研究結(jié)果表明：噴施草銨膦7 d后轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1沒(méi)有觀察到明顯藥害，非轉(zhuǎn)基因材料HiII出現(xiàn)明顯藥害，葉子枯黃萎蔫。28 d后田間雜草基本被殺滅，非轉(zhuǎn)基因玉米HiII全部萎蔫，甚至死亡。轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1正常生長(zhǎng)。繼續(xù)觀察28 d后轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1仍正常生長(zhǎng)。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1在高世代T4代仍可遺傳抗除草劑特性，與前期T2和T3代抗除草劑性狀結(jié)果一致(詳見環(huán)境釋放報(bào)告)，且至少抗5倍大田正常使用濃度的除草劑草銨膦。

2.4 轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1抗蟲性

心 葉期將已經(jīng)黑頭的、即將孵化的玉米螟卵塊接于非轉(zhuǎn)基因玉米HiII、轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1的T4代心葉中。接蟲14 d后調(diào)查食葉級(jí)別，計(jì)算蟲害級(jí)別，對(duì)抗蟲性評(píng)價(jià)結(jié)果見表3。

表2 田間轉(zhuǎn)基因玉米T4代對(duì)除草劑的抗性Table 2 Herbicide-tolerance of transgenic maize at T4 generation in the field.

圖4 噴施5倍除草劑后田間抗除草劑性Fig.4 Herbicide-tolerance of transgenic maize after 5 times glufosinate-ammonium in the field.A、B:噴施7 d后田間生長(zhǎng)情況; C、D:噴施28 d后田間生長(zhǎng)情況(彩圖見圖版一)

表3和圖5(彩圖見圖版一)中結(jié)果顯示，接蟲14 d后，轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1沒(méi)有表現(xiàn)出受害癥狀，沒(méi)有存活亞洲玉米螟；非轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出明顯的受害癥狀，葉片有排孔，被玉米螟咬食嚴(yán)重，有存活的亞洲玉米螟。參照國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1248.5-2006)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得出：非轉(zhuǎn)基因植株抗蟲級(jí)別為感蟲，轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1抗蟲級(jí)別為高抗。

穗期接蟲14 d后調(diào)查玉米蛀孔數(shù)量、蛀孔隧道長(zhǎng)度以及存活幼蟲數(shù)量，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析方法進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果(表4)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1和非轉(zhuǎn)基因玉米差異顯著。轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1蛀孔數(shù)較少，隧道長(zhǎng)度<1 cm，幾乎無(wú)活蟲。而非轉(zhuǎn)基因玉米HiII蛀孔數(shù)較多，且存在活蟲。

表3 T4代轉(zhuǎn)基因玉米心葉期田間抗蟲性Table 3 Insect-resistant of transgenic maize at T4generation at whorl stage in the field.

注：同一列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖5 玉米田間抗蟲性Fig.5 Insect resistance performance at whorl stage in the field.A：非轉(zhuǎn)基因玉米HiII； B：T4代轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1(彩圖見圖版一)

圖6(彩圖見圖版一)研究結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1穗和莖稈無(wú)蟲害，非轉(zhuǎn)基因玉米HiII在莖稈均有蟲害和隧道，在玉米穗上出現(xiàn)被咬食痕跡和活蟲，玉米螟蟲達(dá)到兩齡。參照國(guó)標(biāo)(農(nóng)業(yè)部953公告-10.1-2007)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1在穗期抗蟲性級(jí)別為高抗。

綜上所述，轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1經(jīng)過(guò)不斷自交和培育，在高世代T4代在心葉期和穗期仍表現(xiàn)高抗亞洲玉米螟的性狀，且抗蟲性與T2和T3代抗蟲性表現(xiàn)一致(詳見環(huán)境釋放報(bào)告)。研究結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1目標(biāo)性狀抗蟲性穩(wěn)定遺傳，在心葉期和穗期抗蟲性級(jí)別均達(dá)到高抗級(jí)別。

表4 穗期田間抗蟲性Table 4 Insect resistance performance at heading stage in the field.

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示P<0.05水平上差異顯著。

3 討論

外源基因在無(wú)性培養(yǎng)階段和有性繁殖階段的遺傳穩(wěn)定性，直接影響著轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。評(píng)價(jià)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳穩(wěn)定性對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物新品種產(chǎn)業(yè)化至關(guān)重要。外源基因在植物基因組的整合具有一定的隨機(jī)性，可以插入到一個(gè)單一位點(diǎn)，也可以插入到同一染色體或不同染色體的多個(gè)位置，且插入拷貝數(shù)也是隨機(jī)的[11]。外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳具有復(fù)雜性和多樣性的特點(diǎn)，外源基因片段大小、插入位點(diǎn)、拷貝數(shù)、受體基因組染色體的結(jié)構(gòu)等都會(huì)影響插入基因穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，甚至同一轉(zhuǎn)化體的不同轉(zhuǎn)基因株系和不同世代間，目的基因的表達(dá)也可能具有顯著差異[12,13]。Bhomkar等[14]對(duì)轉(zhuǎn)glyoxalaseI基因豇豆T1代的遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果表明：8個(gè)株系中，4個(gè)株系glyoxalaseI基因丟失。簡(jiǎn)玉瑜等[15]對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的bar基因和抗菌肽B基因分子檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)，bar能夠在T1～T5代保持3∶1的遺傳比率，而抗菌肽B基因檢測(cè)顯著低于3∶1比率，存在明顯的基因丟失的特點(diǎn)，證實(shí)插入基因組的特定位置對(duì)基因穩(wěn)定遺傳存在不利影響。

圖6 穗期田間玉米抗蟲性Fig.6 Insect resistance performance at heading stage in the field.A、B：玉米穗的抗蟲性；C、D：玉米莖稈抗蟲性(彩圖見圖版一)

商業(yè)化的植物轉(zhuǎn)化體均具有外源基因遺傳穩(wěn)定性好的生物學(xué)特征。杜邦、陶氏益農(nóng)公司研發(fā)的已商業(yè)化轉(zhuǎn)化體TC1507、孟山都公司研發(fā)的商業(yè)化轉(zhuǎn)化體Mon89034均可穩(wěn)定遺傳，且表現(xiàn)較高的抗蟲性[16]；吳剛等[17]對(duì)不同世代的轉(zhuǎn)cry1Ab基因克螟稻研究證實(shí)目的基因在不同后代中能夠穩(wěn)定遺傳，且維持較高的目的蛋白表達(dá)量。本研究以進(jìn)入農(nóng)業(yè)部環(huán)境釋放階段的，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1為實(shí)驗(yàn)材料，開展了目的基因整合和目的基因表達(dá)兩個(gè)方面的基因遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)研究工作。研究結(jié)果表明抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米HiⅡ-NGc-1與成熟的轉(zhuǎn)化體研究結(jié)果一致，插入的外源T-DNA均表現(xiàn)為多世代遺傳穩(wěn)定性高的生物學(xué)特征，具有潛在的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

外源基因在受體染色體上的穩(wěn)定整合和高效表達(dá)僅僅是實(shí)現(xiàn)基因功能的第一步，轉(zhuǎn)基因植株目標(biāo)性狀是否突出是評(píng)價(jià)其是否具有應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵。本研究獲得的抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米材料HiII-NGc-1，其心葉期和穗期抗亞洲玉米螟級(jí)別均為高抗，葉片或莖干被咬食較輕，活蟲數(shù)較少。與戴軍等[18]轉(zhuǎn)cry1Ah基因玉米的抗蟲性均為高抗水平。本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1耐5倍正常濃度的草銨膦，較朱常香等[19]研究的耐除草劑草銨膦結(jié)果顯著提高。

綜上，為抗蟲抗除草劑雙價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1 連續(xù)3代具有目標(biāo)基因cryNGc和bar均整合穩(wěn)定，且表達(dá)穩(wěn)定。轉(zhuǎn)基因玉米HiII-NGc-1可耐受5倍除草劑草銨膦大田施用濃度，心葉期和穗期高抗亞洲玉米螟，上述研究結(jié)果為培育抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米新品種的研究及產(chǎn)業(yè)化提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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Genetic Stability Analysis of Insect-resistant and Herbicide-tolerance Transgenic Maize HiII-NGc-1

LIU Yang1, LIU Xiang-guo1, WANG Yang-zhou2, ZHAO Fang-fang3, ZHANG Yan1, XIAO Guo-hong3, FENG Shu-dan3, HAN Si-ping1*, YIN Yue-jia1*

1.JilinProvincialKeyLaboratoryofAgriculturalBiotechnology,InstituteofAgriculturalBiotechnology,JilinAcademyofAgriculturalSciences,Changchun130033,China;2.Institute of Plant Protection, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Jilin Gongzhuling 130124, China;3.College of Life Science and Technology, Harbin Nomal University, Harbin 150025, China

Thegeneticstabilityoftargetgenesisthepremiseforthebreedingoftransgenicplants.WeanalyzedthegeneticstabilityoftransgenicmaizeHiII-NGc-1,whichapprovedenvironmentalreleaseinJilinprovince,suchasintegrationofthetargetgene,expressionofthetargetgene,stabilityofthetargettraits. cryNGcandbargeneweredemonstratedco-integratedintothemaizegenomeDNAatT2～T4generationbyPCRmethod.RT-PCRandImmunostriptestsdemonstratedthatCryNGcandPATproteinswereexpressedintransgenicmaizeHiII-NGc-1atT2～T4generation.Bioassayforinsectresistanceandherbicide-toleranceanalysisinfieldshowedthattransgenicmaizeHiII-NGc-1had5timesglufosinatetolerance,andhighresistanceagainstOstrinia furnacalisatwhorlstageandheadingstage.GeneticstabilityoftransgenicmaizeHiII-NGc-1isthebasisforfurtherresearchofitsbiologicalsafetyevaluation.Theresultsofthisstudyareimportantforthesafetyevaluationandindustrializationoftransgenicinsectresistantmaize.

insect-resistant;herbicide-tolerance;transgenicmaize;geneticstability

2016-09-26; 接受日期：2016-11-03

吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(吉財(cái)教[2012]1072);吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20160520060JH)資助。

劉洋，研究實(shí)習(xí)員，主要從事作物生物技術(shù)研究。E-mail:liuyang_20045894@163.com。*通信作者：韓四平，副研究員，研究方向?yàn)樽魑锷锛夹g(shù)。E-mail:hansp@jlu.edu.cn。尹悅佳，助理研究員，研究方向?yàn)樽魑锷锛夹g(shù)。E-mail:yyjqishi@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.06.07