遮蔭處理對羅漢果果肉組織中羅漢果苷和糖分含量的影響

王海英， 馬小軍， 莫長明， 趙 歡， 涂冬萍， 白隆華， 馮世鑫

( 1. 天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院， 天津 300193； 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所， 北京 100193； 3. 廣西藥用植物園， 南寧 530023 )

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遮蔭處理對羅漢果果肉組織中羅漢果苷和糖分含量的影響

王海英1，2， 馬小軍2*， 莫長明3， 趙 歡2， 涂冬萍2， 白隆華3， 馮世鑫3

( 1. 天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院， 天津 300193； 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所， 北京 100193； 3. 廣西藥用植物園， 南寧 530023 )

該研究以羅漢果品種“永青1號”為材料，在果實(shí)發(fā)育后期進(jìn)行不同強(qiáng)度的遮蔭處理，測定遮蔭處理下果肉組織中羅漢果苷各組分含量、各種糖分的積累及其相關(guān)糖代謝酶活性、葉片光合特性的變化。結(jié)果表明：重度遮蔭(70%遮蔭)會導(dǎo)致果實(shí)中羅漢果甜苷Ⅴ含量顯著提高，遮蔭60 d(授粉后90 d)，對照與70%遮蔭處理果實(shí)中羅漢果甜苷Ⅴ含量分別為4.83%、5.79%，差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)；70%遮蔭處理下果實(shí)中葡萄糖、果糖含量也明顯高于對照(P<0.05)。與羅漢果甜苷Ⅴ、葡萄糖、果糖含量的變化不同，遮蔭60 d，70%遮蔭處理下羅漢果果實(shí)中可溶性糖、蔗糖的含量分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)低于對照。另外，遮蔭處理導(dǎo)致羅漢果葉片凈光合速率下降，遮蔭40 d，70%遮蔭處理下葉片的凈光合速率顯著低于對照(P<0.05)。綜上說明，重度遮蔭處理可以引起羅漢果果實(shí)品質(zhì)的改變；光合速率下降是遮蔭處理下可溶性糖含量降低的主要原因；SPS、AI、SSC活性的改變則是遮蔭導(dǎo)致蔗糖含量降低及葡萄糖、果糖含量上升的重要因素；重度遮蔭條件下，蔭棚中溫度降低可能是羅漢果果實(shí)中甜苷Ⅴ含量增高的關(guān)鍵誘因。該研究結(jié)果為羅漢果的生產(chǎn)及品質(zhì)調(diào)控提供了理論依據(jù)。

羅漢果， 遮蔭， 果實(shí)品質(zhì)， 糖， 羅漢果苷， 蔗糖代謝酶活性

羅漢果果實(shí)中含有糖、蛋白、維生素和氨基酸等多種營養(yǎng)成分，其中糖含量很高，干果中可溶性糖含量占全果干重的32.08%～39.18%，大果果肉和果皮組織中占干重的45%(鐘名誠等，2010；何超文等，2012)。糖類物質(zhì)是果實(shí)的重要成分，其組成與含量對果實(shí)的內(nèi)在品質(zhì)具有重要影響(龔榮高和張光倫，2003)。然而，由于羅漢果中的生物活性成分——羅漢果甜苷Ⅴ，不僅具有清熱潤肺鎮(zhèn)咳、潤腸通便之功效，而且味道極甜，甜度為蔗糖的200～350倍。因此，羅漢果的品質(zhì)優(yōu)劣主要由羅漢果甜苷Ⅴ決定，長期以來，研究者的關(guān)注點(diǎn)也主要集中在羅漢果甜苷Ⅴ上，而對羅漢果果實(shí)中的糖類物質(zhì)研究較少。盡管羅漢果果實(shí)中的甜度主要由羅漢果甜苷Ⅴ決定，但其含量較低，占果實(shí)干重的1%左右。而我們以往對羅漢果品種農(nóng)院B6的研究表明，烘干的成熟果實(shí)中，蔗糖、果糖、葡萄糖是含量最高的三類糖分，其中甜度為蔗糖1.8倍的果糖含量僅次于蔗糖而高于葡萄糖。因此，果實(shí)中這些總含量達(dá)30%的糖類的甜度應(yīng)高于相同濃度的蔗糖甜度，對于羅漢果果實(shí)總甜度也會產(chǎn)生一定的影響，在考察果品質(zhì)量時不應(yīng)完全忽略。另外，從結(jié)構(gòu)上看，羅漢果甜苷Ⅴ中含有5個葡萄糖分子。這就意味著，羅漢果果實(shí)中的糖類、尤其是葡萄糖含量的多少及其代謝過程很可能會影響羅漢果甜苷Ⅴ的生物合成。因此，研究羅漢果果實(shí)中糖的積累過程，從基礎(chǔ)上闡述果實(shí)內(nèi)糖代謝的生理機(jī)制，對于揭示羅漢果甜苷Ⅴ的生物合成具有較為重要的意義。

遮蔭是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的調(diào)控措施之一，遮蔭對植物體中的初生代謝產(chǎn)物(王洋等，2004；齊欣等，2004)和次生代謝產(chǎn)物(Bargali & Tewari，2004；Liu & St Tzel，2004；Coelho et al，2007)都會產(chǎn)生顯著影響。因此，利用遮蔭處理羅漢果，有可能同時引起果實(shí)中糖類及羅漢果苷含量的變化，便于研究其積累規(guī)律及相關(guān)機(jī)制。本研究以羅漢果品種“永青1號”為材料，測定了不同遮蔭處理對羅漢果果實(shí)中葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性總糖、淀粉及羅漢果苷含量的影響，并分析了相關(guān)糖代謝酶：包括轉(zhuǎn)化酶(invertase，EC3.2.1.26，又分為酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)和中性轉(zhuǎn)化酶(NI)，主要作用是催化蔗糖分解為單糖、蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS，EC2.4.1.13，又分為蔗糖合成方向SSS(in synthesis direction)和分解方向(in cleavage direction)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS，EC2.4.1.14)活性的變化。通過上述研究，探討羅漢果果實(shí)中糖含量與羅漢果苷合成之間可能的相關(guān)性，為今后農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上羅漢果的品質(zhì)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于廣西南寧廣西藥用植物內(nèi)(2010年)進(jìn)行。選用“永青1號”當(dāng)年栽種健壯無性組培苗為實(shí)驗(yàn)材料，所有材料均經(jīng)收集鑒定，由桂林亦元生現(xiàn)代生物技術(shù)有限公司提供。按隨機(jī)區(qū)組進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計，重復(fù)3次，每小區(qū)10株。每年4月定植，7月下旬左右開花，8月初授粉掛牌。生長期間田間管理均按杭玲等(2005)的方法進(jìn)行。

1.2 遮蔭方法

授粉后30～90 d，對羅漢果植株進(jìn)行遮蔭處理。選取長勢一致的品種“永青1號”植株，冠層采取不同的遮蔭率設(shè)4種處理：輕度遮蔭(標(biāo)記為遮蔭30%)，中度遮蔭(標(biāo)記為遮蔭50%)，重度遮蔭(標(biāo)記為遮蔭70%)，100%全光照(標(biāo)記為CK)，每處理重復(fù)3次，其它日常管理相同。不同遮蔭處理的蔭棚間距在3.0 m以上，遮蔭棚為東西朝向，頂部及東西面遮蔭，南北面打開，棚頂遮陽網(wǎng)距冠層高1.0 m的高架，遮陽網(wǎng)的透光率用照度計反復(fù)測量確定，遮蔭材料為黑色遮陽網(wǎng)和白色尼龍網(wǎng)。

分別在授粉后30、50、70、90 d(即遮蔭0、20、40、60 d)采樣。每次取樣每個小區(qū)從不同單株隨機(jī)取果3個，采果后迅速將果實(shí)剝開取出果肉，組成混合樣，一部分液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱用于測定蔗糖代謝相關(guān)酶活性，另一部分低溫凍干混勻后用于測定糖及羅漢果苷含量。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 果實(shí)中可溶性糖的提取 稱羅漢果干燥果肉凍干粉0.1 g，80%的乙醇提取，離心，將裝有上清液混合液的蒸發(fā)皿置于85 ℃沸水浴中蒸干，再加2 mL蒸餾水溶解，離心后，上清液再經(jīng)過SEP-C18萃取柱 (Supelclean ENVI C18 SPE)和0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液用于接下來利用高效液相色譜(HPLC)鑒定可溶性糖的組分及其含量。

1.3.2 高效液相色譜-示差折光檢測法分析果肉中糖的含量 液相色譜儀采用Waters測定系統(tǒng)，色譜柱為Waters Sugar-Pak-Ⅰ(6.5 mm×300 mm)，柱溫75 ℃，示差折光檢測器，流動相為脫氣后的重蒸水，流速0.5 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 酶液制備 參照Keller & Ludlow(1993)的方法：稱取0.5 g果肉的冷凍樣品，5 mL提取液提取。提取液成分：50 mmol·L-1HEPES-NaOH (pH7.5)，10 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1EDTA，2.5 mmol·L-1DTT，0.1%(w/v)BSA和0.05% (v/v) Triton X-100。4 ℃，10 000 g離心10 min。上清液移入透析袋中，用稀釋10倍的提取緩沖液 [不含0.05%(v/v)Triton X-100] 4 ℃下透析18 h以去除可溶性糖，透析后的酶液用于相關(guān)酶活性的測定。

1.3.4 酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)，中性轉(zhuǎn)化酶(NI) 酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)活性測定參照Miron & Scaffer(1991)的方法并加以改進(jìn)。500 μL 反應(yīng)體系。AI反應(yīng)混合液成分為800 mmol·L-1磷酸二氫鉀(pH4.8)、1 mol·L-1蔗糖、酶液；NI應(yīng)混合液成分為800 mmol·L-1磷酸氫二鉀(pH7.5)、1 mol·L-1蔗糖、酶液。37 ℃水浴保溫30 min后，加500 μL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5 min，冷卻后在540 nm處測OD值，測定從蔗糖釋放還原糖的量。對照用蒸餾水代替酶液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的兩種轉(zhuǎn)化酶活性。

1.3.5 淀粉酶 淀粉酶活性測定按照Merlo & Passera(1991)的方法并加以改進(jìn)。500 μL 反應(yīng)體系中包括1 mol·L-1乙酸鈉-乙酸(pH6.5)、15 mmol·L-1NaF、50 mmol·L-1Ca(NO3)2、5%可溶性淀粉和酶的提取液。反應(yīng)液37 ℃保溫30 min后，加500 μL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5 min，冷卻后在540 nm處測OD值。對照用蒸餾水代替酶液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的淀粉酶活性。

1.3.6 蔗糖合成酶(SS)活性測定 參照Zhu et al(1997)的方法并加以改進(jìn)。70 μL反應(yīng)體系包括 500 mmol·L-1HEPES-NaOH (pH7.5)、150 mmol·L-1MgCl2、100 mmol·L-1果糖、30 mmol·L-1UDPG(最后加)、酶提取液。混合液37 ℃保溫40 min后，加70 μL的5 mol·L-1NaOH終止反應(yīng)，沸水浴10 min，冷卻后加入1 mL 0.14%的蒽酮(溶解在13.8 mol·L-1的硫酸中)，40 ℃下反應(yīng)20 min，冷卻后在620 nm下測定OD值，通過測定從UDPG生成的蔗糖來定量。對照反應(yīng)體系中不含UDPG，用蒸餾水代替酶液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的蔗糖合成酶活性。

1.3.7 蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性測定 參照Zhu et al(1997)的方法并加以改進(jìn)。70 μL反應(yīng)體系包括500 mmol·L-1HEPES-NaOH(pH7.5)、150 mmol·L-1MgCl2、40 mmol·L-1F6P，200 mmol·L-1G6P、30 mmol·L-1UDPG(最后加入)、酶提取液?；旌弦?7 ℃保溫40 min后，加70 μL 5 mol·L-1NaOH終止反應(yīng)。后面步驟同1.3.6 SS活性測定。

圖 1 不同遮蔭處理在授粉后30 d(a)、50 d(b)、70 d(c)、 90 d(d)對羅漢果果肉組織中羅漢果苷組分及含量的影響 不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)； 不同 大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。數(shù)據(jù) 均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (n=3)。下同。Fig. 1 Effects of different shading treatments on the compositions and contents of mogrosides in the fruit flesh of S. grosvenori 30 d(a)，50 d(b)，70 d(c)and 90 d(d) after pollination Different small letters indicate significant differences (P<0.05)， and different capital letters indicate extremely significant differences (P<0.01) between different shading treatments. Each). The same below.

圖 2 不同遮蔭處理下羅漢果果肉組織中 可溶性糖(a)及淀粉(b)含量變化Fig. 2 Levels of soluble total carbohydrates (a) and starch (b) in the fruit flesh of two cultivars of S. grosvenori at different developmental stages under full sunlight and different shade treatments

圖 3 不同遮蔭處理對羅漢果果肉組織中 葡萄糖(a)、果糖(b)、蔗糖(c)含量變化的影響Fig. 3 Effects of shading treatments on the levels of glucose (a)， fructose (b) and sucrose (c) in fruit flesh of S. grosvenori over the course of fruit development

圖 4 不同遮蔭處理對羅漢果果肉組織中 SSS(a)、SPS(b)活性的影響Fig. 4 Effects of shading treatments on sucrose synthesizing enzyme SSS (a) and SPS (b)activities in fruit flesh of S. grosvenori over the course of fruit development

圖 5 不同遮蔭處理對羅漢果果肉組織中 AI(a)、NI(b)、SSC(c)活性的影響Fig. 5 Effects of shading treatments on sucrose cleavage enzymes AI (a)， NI (b) and SSC (c) activities in fruit flesh of S. grosvenori over the course of fruit developments

2 結(jié)果與分析

2.1 遮蔭對果肉組織中羅漢果苷含量的影響

不同遮蔭處理對羅漢果果肉組織中各種羅漢果苷單體含量的影響不同。遮蔭0 d(授粉后30 d)，果實(shí)中羅漢果苷主要由苷Ⅱ(M-Ⅱ)、苷Ⅲ(M-Ⅲ)組成，各處理中兩種苷的含量無顯著差異(圖1:a)。遮蔭處理20 d(授粉后50 d)，果肉組織中檢測出羅漢果苷Ⅱ、苷Ⅲ，苷Ⅳ(M-Ⅳ)和苷Ⅴ(M-Ⅴ)四種單體，且不同遮蔭處理下各種羅漢果苷單體的含量有顯著不同：對照(CK)和30%遮蔭處理的果實(shí)中苷Ⅱ含量顯著低于苷Ⅳ和苷Ⅴ含量則顯著高于中度與重度遮蔭處理(圖1:b)。之后隨著果實(shí)發(fā)育時間的延長，羅漢果苷Ⅱ、苷Ⅲ、苷Ⅳ消失，羅漢果苷只由甜苷Ⅴ一種單體組成。遮蔭40 d(授粉后70 d)、70%遮蔭處理下果實(shí)中的甜苷Ⅴ顯著高于對照(P<0.05)(圖1:c)；遮蔭60 d(授粉后90 d)、對照與70%遮蔭處理果實(shí)中甜苷Ⅴ含量分別為4.83%和5.79%，呈極顯著差異(P<0.01)(圖1:d)。

2.2 遮蔭對果肉組織中各種糖含量的變化

2.2.1 遮蔭對可溶性總糖與淀粉含量的影響 圖2顯示，遮蔭0 d與20 d，三種遮蔭處理果實(shí)中的可溶性糖含量與對照相比無顯著差異，但隨著果實(shí)的發(fā)育，70%遮蔭處理下果實(shí)中可溶性糖含量顯著下降；遮蔭60 d，對照與70%遮蔭果實(shí)中的可溶性糖含量分別為654.57和460.99 mg·g-1DW，達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)。這表明70%遮蔭處理引起了羅漢果果實(shí)中可溶性糖含量的降低，30%與50%遮蔭處理雖然也降低了果實(shí)中可溶性糖的積累，但與對照相比無顯著差異(圖2:a)。

2.2.2 遮蔭對葡萄糖、果糖及蔗糖含量的影響 由圖3可知，與對照相比，30%遮蔭與50%遮蔭對果實(shí)中葡萄糖含量影響不大，但70%遮蔭導(dǎo)致果實(shí)中葡萄糖含量的顯著提高；遮蔭40 d與60 d，70%遮蔭處理下果實(shí)中的葡萄糖含量顯著高于對照(P<0.05)(圖3:a)。果實(shí)發(fā)育中果糖含量的變化趨勢與葡萄糖相似，70%遮蔭處理導(dǎo)致果實(shí)中果糖含量的顯著上升(圖3:b)。蔗糖含量的變化與上述兩種還原糖不同。圖3：c顯示，遮蔭0 d和20 d，果肉組織中蔗糖含量很低，且與對照相比三種遮蔭處理也未對蔗糖含量造成顯著影響。隨著發(fā)育時間的延長，果實(shí)中蔗糖含量急劇上升。與對照相比，70%遮蔭處理導(dǎo)致果肉組織中蔗糖含量的顯著降低。授粉后90 d，50%(P<0.05)、70%(P<0.01)遮蔭處理下果肉組織中的蔗糖含量顯著低于對照，但30%遮蔭處理未對果實(shí)中蔗糖含量產(chǎn)生顯著影響(圖3:c)。

2.3 遮蔭處理對果實(shí)中相關(guān)糖代謝酶活性的影響

2.3.1 遮蔭處理對SPS、SSS活性的影響 從圖4可以看出，與對照相比，遮蔭處理下SSS和SPS活性都有不同程度的降低，SSS活性下降較少，三種遮蔭強(qiáng)度下SSS活性與對照相比均未達(dá)到顯著差異(圖4:a)。不同遮蔭強(qiáng)度對SPS活性的影響不同：輕度遮蔭未引起SPS活性的顯著變化；中度遮蔭雖導(dǎo)致SPS活性下降，但只在授粉后70 d就達(dá)到顯著差異。重度遮蔭處理對SPS活性的影響最為明顯：遮蔭40、60 d，對照果肉組織中SPS活性分別為10.84、9.71 μmol蔗糖·g-1FW·h-1，顯著高于70%遮蔭果實(shí)中的7.77、7.52 μmol蔗糖·g-1FW·h-1(圖4：b)。

2.3.2 遮蔭處理對AI、NI和SSC活性的影響 隨著果實(shí)發(fā)育，遮蔭處理和對照果實(shí)中的AI活性都呈現(xiàn)下降趨勢，但不同遮蔭處理對AI活性的影響有所不同：與對照相比，30%遮蔭未引起AI活性的顯著變化；50%遮蔭只在授粉后50 d顯著延緩了AI活性的降低；70%遮蔭處理對AI活性的影響最為明顯：從授粉后50 d到授粉后90 d，70%遮蔭處理下果實(shí)中的AI活性始終顯著高于對照(圖5：a)。SSC活性的變化與AI相似，70% 遮蔭跟對照相比顯著延緩了SSC活性的下降，但30%和50%遮蔭未引起顯著變化(圖5：c)。與AI和SSC活性變化趨勢相反，NI活性在果實(shí)發(fā)育期間逐漸上升，但各遮蔭處理與對照之間無顯著差異(圖5：b)。

2.3.3 遮蔭處理對α-淀粉酶活性的影響 圖6所示，隨著果實(shí)發(fā)育時間的延長，α-淀粉酶活性迅速升高，但與對照相比，30%遮蔭、50%遮蔭及70%遮蔭處理均未對果實(shí)中的α-淀粉酶活性造成顯著影響。

圖 6 不同遮蔭處理對羅漢果果肉組織中 α-淀粉酶活性的影響Fig. 6 Effects of shading treatments on α-amylase activities in fruit flesh of S. grosvenori over the course of fruit development

圖 7 不同遮蔭處理下羅漢果葉片Pn的變化Fig. 7 Changes in net photosynthetic rate Pn of S. grosvenori leaves grown under full sunlight and partital shading treatments

2.4 遮蔭對羅漢果葉片凈光合速率的影響

圖7顯示，遮蔭20 d，50%遮蔭處理下的葉片凈光合速率最高，30%遮蔭次之，對照和70%遮蔭處理下葉片的凈光合速率最低。但隨著植株的生長及遮蔭時間的延長，葉片光合速率發(fā)生了極大改變。遮蔭40 d，對照葉片的光合速率高于3個遮蔭處理，且與70%遮蔭處理達(dá)到顯著差異(P<0.05)。授粉后90 d(遮蔭60 d)，三種遮蔭處理下羅漢果葉片的凈光合速率與對照相比下降更為顯著，30%遮蔭、50%遮蔭和70%遮蔭與對照相比分別達(dá)到顯著(P<0.05)、極顯著差異水平(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

3.1 遮蔭處理對羅漢果葉片光合速率的影響

羅漢果是喜光植物，但光照過強(qiáng)又會抑制其正常生長。正是由于羅漢果的這種生長習(xí)性，才使得遮蔭處理對不同生長期的葉片凈光合速率產(chǎn)生了不同影響。授粉后50 d是2010年9月20日，此時南寧還是夏季，氣候炎熱、光照強(qiáng)烈。在這樣的氣候條件下，生長在全光照環(huán)境中的對照植株葉片可能由于不耐受長時間強(qiáng)光照射產(chǎn)生了光抑制，從而導(dǎo)致凈光合速率較低。30%與50%遮蔭處理可降低直射到葉片上的光強(qiáng)，也在一定程度上降低了光抑制作用。與30% 遮蔭使用的白色遮陽網(wǎng)相比，50%遮蔭處理采用的黑色單層遮陽網(wǎng)能吸收更多的光能，因此對光抑制的解除作用強(qiáng)于30%遮蔭，凈光合速率最高；而70%遮蔭處理由于雙層黑色遮陽網(wǎng)吸收了大部分光能，使到達(dá)葉片的光強(qiáng)很弱，葉片無法獲得充足光能進(jìn)行光合作用，從而凈光合速率也處于較低水平。授粉后70 d和90 d分別是2010年10月10日和10月30日，此時南寧氣候已逐漸轉(zhuǎn)涼，光強(qiáng)較9月有了明顯減弱，成為光合作用的限制因子。因此，葉片凈光合速率與環(huán)境中光照強(qiáng)度顯著相關(guān)，對照植株葉片凈光合速率高于遮蔭處理，且遮蔭強(qiáng)度越大，光合速率降低幅度越大。

3.2 遮蔭對羅漢果果實(shí)中淀粉、葡萄糖、果糖和蔗糖含量的影響

遮蔭處理對羅漢果果實(shí)中的淀粉含量無明顯影響，但葡萄糖、果糖、蔗糖含量發(fā)生顯著改變，SPS活性下降、AI和SSC活性上升是引起3種糖含量改變的重要原因。羅漢果果肉組織中前期大量積累淀粉，隨著果實(shí)逐漸成熟，α-淀粉酶活性增高，將淀粉水解，果肉逐漸變軟，淀粉含量下降，可溶性糖含量迅速上升。遮蔭處理對淀粉含量與淀粉酶活性沒有明顯影響。

遮蔭處理可引起植物組織或器官中可溶性糖含量的改變。紅茅草(Rhynchelytrumrepens)在遮蔭條件下植株中的可溶性糖含量降低(Souza et al，2004)，但蘆薈滲出液中可溶性糖含量則沒有明顯變化(Paez et al，2000)。本研究中，通過分析不同生長期、不同遮蔭強(qiáng)度下羅漢果果實(shí)中可溶性糖含量變化，我們發(fā)現(xiàn)不同遮蔭強(qiáng)度對羅漢果果實(shí)中可溶性糖含量的影響不同。輕度(30%)與中度(50%)遮蔭對可溶性糖含量影響較小，但重度(70%)遮蔭則導(dǎo)致了果實(shí)中可溶性糖含量的顯著降低。果實(shí)中可溶性糖主要來源于葉片光合產(chǎn)物的輸送。在一定的光強(qiáng)范圍內(nèi)，植物的光合速率隨光照的增強(qiáng)而增加，合成碳水化合物也會相應(yīng)增多。本研究中，在重度遮蔭條件下，由于環(huán)境中光照強(qiáng)度大幅度減弱(為正常條件下的30%)，使得羅漢果植株葉片光合速率降低，向果實(shí)中輸送的碳水化合物減少，最終導(dǎo)致了可溶性糖含量的顯著下降。

除可溶性總糖含量之外，遮蔭條件下羅漢果果實(shí)中幾種重要糖分的含量也發(fā)生了顯著改變。與對照相比，70%遮蔭處理下果實(shí)中的葡萄糖和果糖兩種還原糖含量顯著升高，而蔗糖含量則顯著降低。這一結(jié)果與Geromel et al(2008)在咖啡中的研究結(jié)果相似。與糖含量變化相對應(yīng)的是遮蔭條件下相關(guān)糖代謝酶活性也發(fā)生了改變。70%遮蔭處理下，SPS活性與對照相比顯著降低，但AI和SSC活性則明顯升高。這些結(jié)果表明了重度遮蔭改變了羅漢果果實(shí)中SPS、AI和SSC的活性：SPS活性下降抑制了蔗糖的合成；而AI和SSC活性的上升則促進(jìn)了蔗糖的降解，兩類酶的共同作用最終導(dǎo)致了果實(shí)中葡萄糖和果糖含量的上升和蔗糖含量的下降。

3.3 在果實(shí)發(fā)育后期，甜苷Ⅴ以幼果中低糖苷作為前體，經(jīng)過數(shù)次糖基化修飾而形成

本研究表明，授粉后30 d，果實(shí)中只含有二糖苷(M-IIE)和三糖苷(M-Ⅲ)兩種低糖苷。之后隨著果實(shí)發(fā)育的進(jìn)行，三糖苷含量下降，到授粉后50 d時，二糖苷和三糖苷含量顯著下降，且伴隨著它們含量的降低，四糖苷(M-Ⅳ)和五糖苷(M-Ⅴ)出現(xiàn)。至授粉后70 d，二糖苷、三糖苷、四糖苷已檢測不到，五糖苷M-Ⅴ成為果實(shí)中主要苷類且含量較高，這種情況持續(xù)到授粉后90 d羅漢果完全成熟。由于本研究著重檢測的是果實(shí)發(fā)育后期羅漢果苷的積累規(guī)律，授粉后30 d以前幼果中的羅漢果苷組成未能詳細(xì)檢測。但李典鵬等(2004)報道在授粉5 d 后即有羅漢果二糖苷出現(xiàn)，且隨著座果生長日齡增加，二糖苷會逐漸減少；向秋等(2009)則在授粉后10 d的果實(shí)中檢測到大量的二糖苷(約占總苷量的99%)和少量的三糖苷(約占總苷量的1%)。本研究還發(fā)現(xiàn)，羅漢果果實(shí)發(fā)育初期最早形成的是二糖苷M-IIE，隨著果實(shí)發(fā)育時間延長，三糖苷、四糖苷、五糖苷依次出現(xiàn)，且伴隨著高糖苷形成，低糖苷含量持續(xù)下降，直至低到無法檢測。這提示成熟羅漢果果實(shí)中的甜苷Ⅴ可能是以幼果中低糖苷為前體，經(jīng)數(shù)次糖基化修飾作用，連接數(shù)個新的葡萄糖基而產(chǎn)生的，而葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶無疑應(yīng)是催化這一轉(zhuǎn)化過程完成的關(guān)鍵酶。這與向秋等(2009)的研究結(jié)果一致。

3.4 重度遮蔭顯著提高了羅漢果甜苷Ⅴ的含量

植物的次生代謝是植物在長期進(jìn)化中與環(huán)境(生物的和非生物的)相互作用的結(jié)果，其產(chǎn)生和變化比初生代謝產(chǎn)物與環(huán)境有著更強(qiáng)的相關(guān)性和對應(yīng)性(閻秀峰等，2007)。遮蔭處理是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用的一種栽培措施，可以改變植物生長小環(huán)境中光強(qiáng)、溫度甚至濕度等因子。遮蔭處理可以引起植物體組織或器官中次生代謝產(chǎn)物含量改變。在遮蔭條件下，喜樹中喜樹堿(王博文等，2006)和延胡索中生物堿(許翔鴻等，2004)含量增加，但高山紅景天中紅景天苷含量降低(閻秀峰等，2004)。本研究中，作為羅漢果果實(shí)中最重要的次生代謝產(chǎn)物，羅漢果甜苷Ⅴ含量在重度(70%)遮蔭條件下明顯上升，與對照相比達(dá)到顯著差異。

遮蔭處理不僅改變環(huán)境中的光照條件，還影響蔭棚下植株的生長溫度。程孝(2008)報道在高溫時段(13:00-15:00)，遮蔭可顯著降低茶園溫度，單層遮陽網(wǎng)降溫在4 ℃以上，雙層遮陽網(wǎng)則在8 ℃左右。本研究在授粉后60 d、遮蔭30 d測定了不同遮蔭處理下蔭棚內(nèi)的溫度。從早上8:00開始，隨時間推移溫度逐漸升高，在12:00時達(dá)到峰值，對照、30%遮蔭、50%遮蔭和70%遮蔭的溫度分別為29.54 ℃、27.89 ℃、26.63 ℃、24.68 ℃，18：00以后溫度逐漸下降。與對照組相比，不同遮蔭處理分別降低了4.86 ℃(遮蔭70%)、2.91 ℃(遮蔭50%)和1.65 ℃(遮蔭30%)，以遮蔭70%降低幅度最大。

溫度與植物體內(nèi)多種代謝酶的活性密切相關(guān)。本課題組在2007年曾發(fā)現(xiàn)，當(dāng)年11月桂林雨水很多，氣溫較正常年份偏低，但采收的羅漢果中甜苷Ⅴ含量明顯高于往年，提示羅漢果發(fā)育晚期低溫可能促進(jìn)甜苷Ⅴ的積累。本研究雖然只測定了授粉后60 d即遮蔭30 d的溫度變化，但也可以看出，不同遮蔭處理均降低了蔭棚下的溫度，尤其是重度遮蔭降低了近5 ℃。因此，對于重度遮蔭引起的羅漢果果實(shí)中“低光合、高甜苷Ⅴ含量”現(xiàn)象，我們推測：雖然重度遮蔭引起了葉片光合功能的下降，但果實(shí)發(fā)育后期溫度對甜苷Ⅴ合成關(guān)鍵酶活性的影響更為關(guān)鍵。羅漢果果實(shí)中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可能是溫敏型酶類，對環(huán)境溫度的變化非常敏感，高溫會抑制其活性，而在低溫條件下活性則可明顯提高。重度遮蔭可能是通過降低蔭棚中的溫度，提高了糖基轉(zhuǎn)移酶活性，最終促進(jìn)了甜苷Ⅴ的積累。

3.5 糖與羅漢果甜苷Ⅴ積累的相關(guān)性探討

重度遮蔭條件下，羅漢果果實(shí)中葡萄糖含量、果糖含量與對照相比顯著上升，蔗糖含量下降，甜苷Ⅴ含量則明顯上升。葡萄糖、果糖兩種還原糖含量與甜苷Ⅴ含量之間都存在“高葡萄糖含量、高甜苷Ⅴ含量”與“高果糖含量、高甜苷Ⅴ含量”現(xiàn)象。葡萄糖為羅漢果甜苷Ⅴ后期生物合成的重要底物，因此遮蔭處理下，甜苷Ⅴ含量增加有兩種可能的原因：第一，遮蔭改變了相關(guān)糖代謝酶的活性，使底物葡萄糖供應(yīng)增多，甜苷Ⅴ生成量增大；第二，除作為結(jié)構(gòu)物質(zhì)外，糖類物質(zhì)還可作為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)調(diào)節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物生成。Julie & Oksana(2004)報道，擬南芥pho3突變體與對照相比可積累大量蔗糖，蔗糖作為信號分子，調(diào)控多個與花色素苷合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，最終增加了花青素苷的含量。本研究中，重度遮蔭處理下，葡萄糖、果糖含量均顯著高于對照，是否也有可能是上述兩種糖中的一種或幾種以信號分子的方式在轉(zhuǎn)錄水平上刺激了與甜苷Ⅴ合成相關(guān)的某些基因的表達(dá)，從而最終使得甜苷Ⅴ積累量增加呢？這一問題還需要深入研究。

綜上表明，重度遮蔭(70%遮蔭)導(dǎo)致了果實(shí)品質(zhì)的改變：葡萄糖、果糖、甜苷Ⅴ含量的顯著提高，但可溶性總糖、蔗糖含量明顯下降。SPS、AI、SSC活性的改變是蔗糖含量降低及葡萄糖、果糖含量上升的主要原因。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可能是對溫度敏感的酶類，重度遮蔭條件下蔭棚中溫度的降低促進(jìn)了其活性提高，進(jìn)而提高了甜苷Ⅴ含量。

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Effects of shading on contents of mogrosides and sugars in fruit flesh ofSiraitiagrosvenorii

WANG Hai-Ying1，2， MA Xiao-Jun2*， MO Chang-Ming3， ZHAO Huan2，TU Dong-Ping2， BAI Long-Hua3， FENG Shi-Xin3

( 1.CollegeofTraditionalChinesePharmacy，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine， Tianjin 300193， China;2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing 100193， China; 3.GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlant， Nanning 530023， China )

With the commonSiraitiagrosvenoriivariety of “Yongqing 1” as experimental material， we measured the changes of concentrations of mogrosides monomers, soluble sugars, glucose, fructose, sucrose and starch in the fruit flesh, as well as the activities of sucrose metabolism enzymes, including acid invertase(AI), neutral invertase (NI), sucrose synthase (in synthesis direction, SSS；in cleavage direction SSC), sucrose phosphate synthase (SPS) and the net photosynthetic rates, during the late development stage of fruit under different shading treatments. The results indicated that in comparison with control, severe shading (70% shading) resulted in significant increase of mogroside V content: 60 d after shading (90 d after pollination), the content of mogroside V in the fruit flesh of 70% shading treatment was 5.79%, significantly higher than that of control group (4.83%,P<0.01). Meanwhile, the concentrations of glucose, fructose were also much higher than those of controls (P<0.05). On the contary, the changes of concentrations of total soluble carbohydrates and sucrose were far different from those of mogroside V, glucose and fructose: 60 d after shading, the levels of total soluble carbohydrates, sucrose in the fruit flesh of 70% shading treatment were significantly (P<0.05 ), extremely significantly (P<0.01) lower than those of controls, respectively. On the other hand, shading treatment led to a decrease of net photosynthetic rate (Pn): 40 d after shading,Pnof leaves under 70% shading treatment was significantly (P<0.05) lower than that of controls. The above results implied that severe shading treatment could result in the improvement of fruit quality ofS.grosvenorii. In additon, under shading treatment, the decrease of photosynthetic rate could be the major reason for the decline of soluble sugar content, while changes of sucrose, fructose and glucose contents should be mainly resulted from the changes of activities of SPS, AI and SSC. In addition, under severe shading treatment, fall of temperature could be regarded as the probable cause for the increase of mogroside V content. The research provides the theoretical basis for the production techniques and the quality control ofS.Grosvenoriifruit. Key words:Siraitiagrosvenorii, shading, fruit quality, sugars, mogroside, activity of sucrose metabolic enzymes

10.11931/guihaia.gxzw201405062

2015-06-29

2015-12-11

國家自然科學(xué)基金(30860379)；國家科技支撐計劃項(xiàng)目(2011BA101B03)；廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013GXNSFDA019021) [Supported by the National Natural Science Foundation of China(30860379); National Key Technology R & D Program of China(2011BA101B03); the Natural Science Foundation of Guangxi(2013GXNSFDA019021)]。

王海英(1972-)，女，河北唐山人，博士，副教授，主要從事藥用植物生理與分子生物學(xué)研究，(E-mail)haiyingwang-99@163.com。

*通訊作者： 馬小軍，博士，研究員，研究方向?yàn)樗幱弥参锷锛夹g(shù)，(E-mail)mayixuan10@163.com。

Q945.1

A

1000-3142(2016)11-1344-09

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36(11):1344-1352