實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在解脲脲原體檢測(cè)中的應(yīng)用

陳小波，朱慶文，徐愛(ài)萍，蘇良香，費(fèi)倩倩

(江蘇省南通市婦幼保健院：1.產(chǎn)前診斷中心；2.生殖助孕中心 226001)

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·臨床研究·

實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在解脲脲原體檢測(cè)中的應(yīng)用

陳小波1，朱慶文1，徐愛(ài)萍1，蘇良香1，費(fèi)倩倩2△

(江蘇省南通市婦幼保健院：1.產(chǎn)前診斷中心；2.生殖助孕中心 226001)

目的 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(SAT)對(duì)不孕不育癥患者的泌尿生殖道拭子及尿液進(jìn)行解脲脲原體(UU)檢測(cè)，并評(píng)價(jià)其敏感性和特異度。方法 對(duì)452例不孕不育癥患者的泌尿生殖道拭子標(biāo)本，采用SAT檢測(cè)法、培養(yǎng)法、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行UU檢測(cè)，同時(shí)再對(duì)同一患者的尿液標(biāo)本進(jìn)行SAT檢測(cè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)估SAT在拭子及尿液標(biāo)本UU檢測(cè)中的靈敏度和特異度；同時(shí)UU培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本經(jīng)過(guò)臨床UU規(guī)范治療后，仍采用上述方法對(duì)患者進(jìn)行UU復(fù)查，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)估SAT在UU檢測(cè)中的判斷預(yù)后效果。結(jié)果 初檢時(shí)與UU培養(yǎng)結(jié)果作比較，UU-SAT拭子標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度為97.1%(170/175)，特異度為97.8%(271/277)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.010 2，P=0.919 7)；UU-SAT尿液標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度為96.0%(168/175)，特異度為98.9%(274/277)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.163 5，P=0.686 0)。結(jié)論 SAT檢測(cè)泌尿生殖道患者拭子及尿液UU檢測(cè)具有很高的靈敏度和特異性，同時(shí)又有很好的判愈效果，為UU的臨床實(shí)驗(yàn)室診斷提供了新的檢測(cè)手段。

實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)； 解脲脲原體； 尿液檢測(cè)； 聚合酶鏈反應(yīng)

解脲脲原體(UU)是一類(lèi)原核細(xì)胞型微生物，是泌尿生殖道感染的常見(jiàn)病原體之一，它不僅引起非淋菌性尿道炎，還可引起多種泌尿生殖道疾病，如前列腺炎、附睪炎、宮頸炎、輸卵管炎及其導(dǎo)致的輸卵管妊娠等，是導(dǎo)致不孕不育癥的重要原因之一。近年來(lái)，隨著不孕不育癥發(fā)病率的逐漸上升，UU引起的生殖道感染日益受到關(guān)注。本文采用實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(SAT)對(duì)患者的泌尿生殖道拭子及尿液標(biāo)本進(jìn)行UU的RNA檢測(cè)。SAT技術(shù)是建立在RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上的第二代核酸檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 所有452例患者標(biāo)本均為2015年9月至2016年2月來(lái)本院生殖助孕中心就診并計(jì)劃行體外受精聯(lián)合胚胎移植(IVF)手術(shù)的患者，其中男125例，女327例，年齡23～45歲，男性取尿道拭子及尿樣,女性取宮頸拭子及尿樣。

1.2 標(biāo)本采集 拭子標(biāo)本采集：用醫(yī)用棉拭子伸入男性尿道口或女性宮頸口約1～2 cm，旋轉(zhuǎn)1周，停留10 s后取出，并將拭子頭放入1 mL生理鹽水浸泡貼管壁擠干，取0.5 mL加入0.5 mL專(zhuān)用尿液保存液混勻，立即檢測(cè)或-20 ℃保存待測(cè)。尿液標(biāo)本采集：取清晨首次尿，或長(zhǎng)時(shí)間(至少1 h)不排尿后的首段尿1 mL加入1 mL專(zhuān)用尿液保存液混勻，立即檢測(cè)或-20 ℃保存待測(cè)。

1.3 試劑與儀器 UU核酸檢測(cè)試劑盒(RNA恒溫?cái)U(kuò)增)和專(zhuān)用磁珠分離裝置(上海仁度生物科技有限公司)；UU核酸擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)；UU培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒(珠海麗珠試劑有限公司)；ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.4 方法 同一患者拭子用培養(yǎng)法檢測(cè)，尿液用SAT進(jìn)行檢測(cè)，若同一患者培養(yǎng)和SAT檢測(cè)結(jié)果不一致，用PCR法對(duì)留存的拭子標(biāo)本進(jìn)行復(fù)測(cè)，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 標(biāo)本檢測(cè) 同一患者收集到的3份拭子標(biāo)本分別做UU培養(yǎng)、UU-PCR及UU-SAT，尿液標(biāo)本只做UU-SAT。若培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性，根據(jù)臨床規(guī)范化治療后，再次采集治療后患者的生殖道拭子及尿液標(biāo)本，采用初檢時(shí)檢測(cè)的方法和步驟進(jìn)行復(fù)檢。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 452例初檢結(jié)果 與UU培養(yǎng)結(jié)果作比較，UU-SAT拭子標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度為97.1%(170/175)，特異度為97.8%(271/277)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.010 2，P=0.919 7)；UU-SAT尿液標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度為96.0%(168/175)，特異度為98.9%(274/277)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.163 5，P=0.686 0)，見(jiàn)表1。

2.2 療效判愈實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)分析 對(duì)175例UU-培養(yǎng)陽(yáng)性患者進(jìn)行臨床規(guī)范治療后再次采集標(biāo)本，按原方法進(jìn)行復(fù)檢，與UU培養(yǎng)結(jié)果作比較，UU-SAT拭子標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度為97.8%(44/45)，特異度為99.2%(129/130)；UU-SAT尿液標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度為93.3%(42/45)，特異度為98.5%(128/130)，見(jiàn)表2。

表1 452例患者初檢3種方法的檢測(cè)結(jié)果(n)

表2 175例“培養(yǎng)初檢陽(yáng)性”患者規(guī)范治療后的復(fù)檢結(jié)果(n)

3 討 論

UU是一類(lèi)大小介于細(xì)菌和病毒之間的沒(méi)有細(xì)胞壁的原核細(xì)胞微生物，是人類(lèi)泌尿生殖道的常見(jiàn)病原體之一，也是育齡夫婦不孕不育的重要原因之一[1-3]。目前，UU臨床檢測(cè)主要有培養(yǎng)法和熒光定量PCR法，兩種檢測(cè)方法的標(biāo)本來(lái)源均取自患者的泌尿生殖道分泌物，侵入式取樣，容易增加患者的抵觸情緒。同時(shí)培養(yǎng)法檢測(cè)對(duì)標(biāo)本的采集和保存要求都很高，存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、主觀(guān)判讀，靈敏度和特異度都有所不足。SAT是采用RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的一種新的RNA檢測(cè)技術(shù)。本文使用SAT技術(shù)對(duì)患者拭子及尿液標(biāo)本進(jìn)行UU RNA檢測(cè)，結(jié)果顯示SAT法具有很高的靈敏度和特異度，同時(shí)又有很好的判愈效果。實(shí)驗(yàn)表明該檢測(cè)可以使用尿液作為標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)取樣，改變目前UU檢測(cè)大多用泌尿生殖道拭子標(biāo)本的現(xiàn)狀，優(yōu)化了取樣流程。

在初檢結(jié)果中，與UU培養(yǎng)結(jié)果作比較，UU-SAT拭子標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度為97.1%(170/175)，特異度為97.8%(271/277)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.010 2，P=0.919 7)；UU-SAT尿液標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度為96.0%(168/175)，特異度為98.9%(274/277)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.163 5，P=0.686 0)。對(duì)于SAT檢測(cè)陽(yáng)性而PCR法或培養(yǎng)法檢出陰性的情況，作者認(rèn)為原因可能是：采集的試紙中病原菌含太少，培養(yǎng)靈敏性不足，也可能是患者正處于感染初期，病原體DNA量較少，RNA量相對(duì)較多，則以檢測(cè)RNA的SAT能檢測(cè)到病原體的存在。SAT法核酸提取過(guò)程中，反應(yīng)抑制物少，可有效減少假陰性，提高檢測(cè)靈敏度[4-5]；對(duì)于SAT檢測(cè)陰性而PCR法或培養(yǎng)法檢出陽(yáng)性的情況，可能是標(biāo)本保存不當(dāng)引起檢測(cè)的RNA丟失；尿液中存在著抑制核酸擴(kuò)增的物質(zhì)或者UU特異度序列突變；也很可能是操作過(guò)程中受到RNase的作用使得RNA降解，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須使用專(zhuān)用加樣器，離心管、洗頭等一次性耗材實(shí)驗(yàn)前必須全部高壓滅菌。但正是RNA容易降解的特點(diǎn)，使得SAT實(shí)驗(yàn)后擴(kuò)增的RNA能迅速降解，大大降低了PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)交叉污染引起的假陽(yáng)性問(wèn)題[6]。近年來(lái)研究認(rèn)為，PCR法雖然有較高的靈敏度和特異度，但不能區(qū)分所檢測(cè)的DNA是來(lái)自活菌還是死菌，患者治療后病菌死亡，但病菌DNA仍在體內(nèi)繼續(xù)存在一段時(shí)間，PCR檢測(cè)陽(yáng)性，容易導(dǎo)致過(guò)度治療[7-11]。本文復(fù)查175例UU培養(yǎng)陰性患者中仍有8例PCR檢測(cè)顯示陽(yáng)性，作者認(rèn)為可能和上述原因有關(guān)，因而PCR法在判斷愈后方面有所不足。此外，對(duì)175例UU-培養(yǎng)陽(yáng)性患者進(jìn)行臨床規(guī)范治療后再次采集標(biāo)本，按原方法進(jìn)行復(fù)檢，與UU培養(yǎng)結(jié)果作比較，UU-SAT拭子標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度為97.8%(44/45)，特異度為99.2%(129/130)；UU-SAT尿液標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度為93.3%(42/45)，特異度為98.5%(128/130)；在復(fù)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然經(jīng)過(guò)了規(guī)范的治療但仍有45例患者標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，作者認(rèn)為這可能和患者對(duì)藥物治療的個(gè)體差異、耐藥性或針對(duì)特殊人群的治療方案有關(guān)，具體原因有待探討。

需要強(qiáng)調(diào)的是，現(xiàn)在認(rèn)為UU也是正常人泌尿生殖道中寄居的微生物之一，UU檢測(cè)陽(yáng)性并不完全表示泌尿生殖感染，只提示泌尿生殖道UU的存在，診斷還需與患者的臨床癥狀相結(jié)合。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)作為新一代的核酸檢測(cè)技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室生殖道UU檢測(cè)中，既具備了PCR的高靈敏度和高特異度，又具有很好的判斷預(yù)后效果，同時(shí)又可采用尿液作為檢測(cè)標(biāo)本，方便患者及醫(yī)務(wù)人員，適合臨床實(shí)驗(yàn)室泌尿生殖道患者UU的檢測(cè)，是值得推廣的一種檢測(cè)方法。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.045

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1673-4130(2016)23-3348-03

2016-06-15

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