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      阿霉素誘導(dǎo)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原變化

      2016-12-22 06:55:23李倩曉于勤那榮妹劉百亭
      關(guān)鍵詞:光密度阿霉素膠原

      李倩曉,于勤,那榮妹,劉百亭

      阿霉素誘導(dǎo)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原變化

      李倩曉,于勤,那榮妹,劉百亭

      目的通過腹腔注射阿霉素的方法建立擴(kuò)張型心肌?。―CM)心力衰竭大鼠模型,探討其心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原的變化。方法選取體質(zhì)量220~280 g的8周齡、SPF級近交系雄性SD大鼠95只,分為DCM組(=70)和對照組(=25)。DCM組采用腹腔注射阿霉素的方法構(gòu)建DCM心力衰竭模型;對照組則注射等容積的0.9%氯化鈉注射液。給藥后第8周,兩組各取20只處死,行免疫組化檢測心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)。結(jié)果DCM組大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原平均光密度值均高于對照組(均<0.05),DCM組大鼠心?、?Ⅲ型膠原比值大于對照組(<0.05)。結(jié)論腹腔注射阿霉素誘導(dǎo)DCM心力衰竭大鼠心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原特異性增生,比例失調(diào)。

      心肌病,擴(kuò)張型;膠原,Ⅰ、Ⅲ型;阿霉素

      擴(kuò)張型心肌?。―CM)是一種以左心室擴(kuò)大伴收縮功能障礙為典型特征的心肌疾病,是射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭的常見病因之一,也是心臟移植的最常見病因[1-2]。DCM發(fā)病率約4‰,5年生存率約50%,大多數(shù)DCM患者最終發(fā)展為充血性心力衰竭,并出現(xiàn)室性及室上性心律失常、血栓栓塞甚至猝死等[3-4]。研究認(rèn)為,DCM是遺傳因素、自身免疫異常、病毒感染、毒物或藥物等多因素共同作用所致[5-6]。DCM起病隱匿,呈進(jìn)行性惡化,預(yù)后差,臨床誤診率高,故提高對該病的認(rèn)識、早期診斷及早期治療對改善預(yù)后至關(guān)重要。本研究通過腹腔注射阿霉素的方法,誘導(dǎo)制備DCM心力衰竭動物模型,探討其心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原的變化。報道如下。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑動物為體質(zhì)量為220~280g的8周齡、SPF級近交系雄性SD大鼠95只,購于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。試劑:阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司),0.9%氯化鈉注射液(青島華仁藥業(yè)股份有限公司),兔抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體(廣州華拓生物科技有限公司),即用型免疫組織化學(xué)EliVisionTM plus廣譜試劑盒(試劑A:聚合物增強(qiáng)劑,試劑B:酶標(biāo)羊抗鼠/兔ⅠgG聚合物,福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

      1.2 實(shí)驗(yàn)分組將SD大鼠分為DCM組(=70)和對照組(=25),置于同等條件下飼養(yǎng)。DCM組予腹腔注射阿霉素,每次2.5 mg/kg,1次/周,共6周,使阿霉素累積劑量達(dá)到15 mg/kg。對照組腹腔注射等容積的0.9%氯化鈉注射液。

      1.3 免疫組化檢測至給藥后第8周,DCM組大鼠死亡29只,存活41只;正常對照組大鼠全部存活。兩組任取20只,予以斷頸處死,并取厚2~3 mm的左室中段心肌組織,行免疫組化檢測心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)EliVisionTM plus兩步法檢測心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)。切片脫蠟至蒸餾水;3%H2O2室溫孵育10 min;磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4)沖洗,3 min×3次;檸檬酸抗原修復(fù)液高壓加熱至沸騰后放入玻片,持續(xù)蒸汽5 min,自然冷卻至室溫;PBS沖洗,3min×2次;分別滴加1∶200稀釋的一抗(兔抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體),置濕盒中4℃過夜,陰性對照滴加PBS代替一抗;PBS沖洗,3 min ×3次;滴加聚合物增強(qiáng)劑(試劑A),室溫孵育20 min;PBS沖洗,3min×3次;滴加酶標(biāo)羊抗鼠/兔ⅠgG聚合物(試劑B),室溫孵育30 min;PBS沖洗,3 min×3次;DAB顯色,觀察標(biāo)本染色程度(細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒沉著為陽性反應(yīng));純凈水終止顯色,蘇木素復(fù)染l min;自來水沖洗,1%鹽酸酒精分化,自來水沖洗;梯度酒精脫水(90%、95%、100%、100%各3 min);二甲苯透明,5 min×2次;中性樹膠封片。每張切片選取10個不相互重疊的視野,測定標(biāo)本陽性區(qū)的平均光密度值,計算Ⅰ、Ⅲ型膠原比值。

      1.4 統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組比較檢驗(yàn)。<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      對照組:心肌細(xì)胞間質(zhì)中僅見少量棕褐色的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá),且顏色較淺(封二彩圖1~2);DCM組:心肌細(xì)胞間質(zhì)中可見大量棕褐色的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá),且顏色較深(封二彩圖3~4)。DCM組大鼠心?、瘛ⅱ笮湍z原平均光密度值顯著高于對照組(均<0.05),心肌Ⅰ/Ⅲ型膠原比值亦大于對照組(<0.05),見表1。

      3 討論

      DCM的典型特征包括心肌細(xì)胞肥大、變性及心肌纖維化[7]。心肌纖維化以心肌細(xì)胞增殖和心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積為主要表現(xiàn)[8-9]。ECM成分主要包括膠原、彈性蛋白及蛋白聚糖等,在維持心臟正常結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用,與心肌肥厚、心肌纖維化有直接關(guān)系[10]。DCM導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程,以ECM異常增多和過度沉積為主要病理基礎(chǔ),其中最明顯的表現(xiàn)是Ⅰ、Ⅲ型膠原的變化,即膠原含量升高,比例增大。Ⅰ型膠原主要為粗纖維,在成人心肌中占膠原總量的85%,是構(gòu)成心肌膠原的主體成分,其僵硬度大,而伸展與回彈性小,主要維持心肌張力,對抗?fàn)坷?;Ⅲ型膠原主要為細(xì)纖維,約占11%,其伸展與回彈性較大,主要使心肌彈性回縮,儲備能量[11]。因此,Ⅰ、Ⅲ型膠原比值可反映心肌纖維化程度,兩者共同維持膠原纖維網(wǎng)絡(luò)的完整性,保證心臟的正常舒縮功能。若兩者比例失調(diào),勢必影響心肌舒縮功能,從而導(dǎo)致心功能下降。正常心肌膠原含量為2%~4%,當(dāng)增至8%~12%時,室壁順應(yīng)性降低,出現(xiàn)舒張功能下降;當(dāng)超過20%時,則由于心肌細(xì)胞被阻隔,影響了力的產(chǎn)生與傳導(dǎo),導(dǎo)致收縮功能障礙。本研究免疫組化檢測顯示,對照組大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)中僅見少量棕褐色的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá),而DCM組大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)中可見大量棕褐色的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)。DCM組大鼠心?、?、Ⅲ型膠原平均光密度值均顯著高于對照組(均<0.05),心?、?Ⅲ型膠原比值亦大于對照組(<0.05)。提示腹腔注射阿霉素誘導(dǎo)DCM心力衰竭大鼠心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原特異性增生,比例失調(diào)。

      表1 兩組大鼠心?、?、Ⅲ型膠原平均光密度值比較

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      10.3969/j.issn.1671-0800.2016.11.019

      R542.2

      A

      1671-0800(2016)11-1445-02

      2016-05-05

      (本文編輯:孫海兒)

      杭州市醫(yī)療衛(wèi)生及重點(diǎn)??茖2】蒲许?xiàng)目(20140733Q26)

      310000杭州,杭州市紅十字會醫(yī)院(李倩曉);大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院(于勤、那榮妹、劉百亭)

      李倩曉,Email:lqx786 @163.com

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