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    衰老的卵巢間質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響

    2016-12-22 10:39:13高雯朱滔
    浙江醫(yī)學(xué) 2016年22期
    關(guān)鍵詞:孔板糖苷酶纖維細(xì)胞

    高雯 朱滔

    衰老的卵巢間質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響

    高雯 朱滔

    目的 探討衰老的卵巢間質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3的增殖、侵襲能力的影響。方法 原代培養(yǎng)人卵巢正常成纖維細(xì)胞(NOF),在體外持續(xù)傳代誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,用衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶染色(SA-b-gal)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生衰老。收集正常成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CMn)及衰老成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CMs)。用CMn和CMs分別處理SKOV3細(xì)胞,利用CCK8試劑盒、Transwell小室及三維培養(yǎng)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖、侵襲能力的變化。結(jié)果 卵巢正常成纖維細(xì)胞在體外持續(xù)傳代會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制性衰老,在SA-b-gal試驗(yàn)中有明顯的深藍(lán)色沉淀產(chǎn)物。用CMs處理SKOV3細(xì)胞,CCK8試驗(yàn)顯示細(xì)胞培養(yǎng)第5天的OD(2.067±0.058)高于CMn組(1.073±0.056)(t=21.19,P<0.01),表明細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。Transwell試驗(yàn)顯示CMs組穿透Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)(235.00±29.68)個(gè),較CMn組的(129.30±15.52)個(gè)明顯增多(t=5.47,P<0.01);三維培養(yǎng)中形成的克隆球CMs組較CMn組明顯增大、數(shù)量明顯增多(27.00±2.16 vs 11.67±2.50;t=8.04,P<0.01),向外侵襲能力增強(qiáng)。結(jié)論 衰老的卵巢間質(zhì)成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)中能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

    卵巢癌 衰老 間質(zhì)成纖維細(xì)胞 三維培養(yǎng)

    近年來,對(duì)腫瘤的研究熱點(diǎn)逐漸從腫瘤本身過度到腫瘤微環(huán)境,在腫瘤微環(huán)境中最主要的是基質(zhì)細(xì)胞,而成纖維細(xì)胞是最重要的一種基質(zhì)細(xì)胞[1]。癌相關(guān)成纖維細(xì)胞通過多種方式與腫瘤細(xì)胞相互作用,從而調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。在卵巢正常的微環(huán)境中,也存在著間質(zhì)成纖維細(xì)胞,幼稚的基質(zhì)可為上皮腫瘤形成提供一個(gè)抑制性的環(huán)境[2]。而隨著年齡的增長(zhǎng)及炎癥因子的刺激,間質(zhì)成纖維細(xì)胞會(huì)發(fā)生衰老[3]。本文旨在研究外源性衰老的間質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞系和培養(yǎng)基 組織標(biāo)本來自本院婦瘤科2014年10至12月收治的早期宮頸癌切除卵巢的標(biāo)本2例,經(jīng)病理證實(shí)卵巢正常。標(biāo)本獲取前均與患者簽署知情同意書,獲得本人許可。從組織標(biāo)本成功分離到2株卵巢正常成纖維細(xì)胞(NOF),體外培養(yǎng),狀態(tài)良好。人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection,ATCC);培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的DEME(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 NOF的分離和培養(yǎng) (1)細(xì)胞培養(yǎng):取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NOF細(xì)胞,用含10%FBS的DMEM基培養(yǎng),48h后細(xì)胞匯合度約80%;(2)收集條件培養(yǎng)基;取培養(yǎng)第3代的NOF(NOF3)培養(yǎng)24h后,更換無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集培養(yǎng)基即為正常條件培養(yǎng)基(CMn)。取培養(yǎng)第10代的NOF(NOF10)培養(yǎng)24h后,更換無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集培養(yǎng)基即為衰老條件培養(yǎng)基(CMs)。收集的條件培養(yǎng)基,1 500r/min,離心10min,吸取上清液并用 0.22pm一次性濾器過濾,可立即使用,也可-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 β-半乳糖苷酶染色(SA-b-gal) GENMED細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美醫(yī)藥科技有限公司。在6孔板分別接種NOF3和NOF10,37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,第2天待細(xì)胞密度達(dá)到50%~60%時(shí),按照β-半乳糖苷酶試劑盒的說明書進(jìn)行染色,之后在顯微鏡下拍照。

    1.2.3 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 CCK8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司。分別使用CMn和CMs作用于SKOV3細(xì)胞。取2 500個(gè)/孔(100μl/孔)的濃度將處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種到96孔板,每孔設(shè)3個(gè)對(duì)照;待細(xì)胞貼壁后,加入10μl CCK8,溫育2h;用自動(dòng)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處,測(cè)定各孔的吸光度值(用OD值來表示)。連測(cè)5d,最后取各樣本的平均值進(jìn)行比較。根據(jù)OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目,進(jìn)而了解細(xì)胞的增殖能力。

    1.2.4 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 8μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司。先將Matrigel(50mg/L)膠和無血清DMEM培養(yǎng)基以1∶3比例進(jìn)行混合。小室上室鋪100 μl混合好的Matrigel,37℃無菌保持過夜,確保Matrigel充分凝固。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,分別用CMn和CMs培養(yǎng)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1× 106/ml,每孔加100μl細(xì)胞懸液于上室,設(shè)3個(gè)重復(fù)孔,下室加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)基600μl。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中溫育24h后取出小室,濾膜用4%甲醛固定20min。用棉簽小心擦去未侵襲的濾膜表面細(xì)胞,結(jié)晶紫染色,之后在顯微鏡下拍照,本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)檢測(cè)其侵襲能力。

    1.2.5 體外三維培養(yǎng)法 包被:(1)用0.02mol/L乙酸稀釋Ⅰ型鼠尾膠原(購(gòu)自美國(guó)BD公司)至50μg/ml;(2)在24孔板中每孔加入以上 300~500μl已稀釋好的Ⅰ型鼠尾膠原,室溫孵育1h;(3)將24孔板中的液體吸走,PBS清洗3次;(4)24孔板可以立即使用或無菌條件下晾干備用。接種細(xì)胞24孔板每孔最終接種250個(gè)細(xì)胞,先取2個(gè)試管(A、B),A中加入培養(yǎng)基和一定數(shù)目的細(xì)胞,B中加入培養(yǎng)基、Ⅰ型鼠尾膠原和NaOH(比例為5∶1∶0.0235)在冰上操作,A和B的比例為1∶1,在冰上混和A、B,混勻后加入到已包被好的24孔板中,每孔加入1ml,仔細(xì)操作不要有氣泡產(chǎn)生,然后放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育。10d后,熒光倒置顯微鏡下觀察克隆的形態(tài),拍照,并計(jì)數(shù)克隆數(shù)量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料以表示,比較采用t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 卵巢NOF及衰老成纖維細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn) 正常卵巢組織培養(yǎng)7d后見稀疏的NOF從組織塊周圍長(zhǎng)出,約14d鋪滿瓶底,正常上皮細(xì)胞較少見。NOF3生長(zhǎng)狀態(tài)良好,未見上皮細(xì)胞混雜生長(zhǎng)(圖1a)。NOF在體外培養(yǎng)6~10代后逐漸進(jìn)入復(fù)制性衰老(圖1b),表現(xiàn)為細(xì)胞表型改變,增殖能力喪失,但基本代謝過程仍能維持。與NOF3比較,NOF10體積增大、細(xì)胞扁平、胞核與核仁體積增加,胞質(zhì)內(nèi)顆粒明顯增多等。將成纖維細(xì)胞分為NOF3和NOF10,觀察細(xì)胞衰老情況,經(jīng)過SA-b-gal染色后,NOF10有明顯的深藍(lán)色沉淀產(chǎn)物,體外持續(xù)傳代誘導(dǎo)了成纖維細(xì)胞的復(fù)制性衰老(圖2)。

    2.2 不同培養(yǎng)基處理后對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響 細(xì)胞培養(yǎng)1、2、3、4、5d,CMs組OD值分別為:0.152±0.012、0.285±0.010、0.884±0.036、1.572±0.050、2.067±0.058;CMn組OD值分別為:0.149±0.007、0.250± 0.010、0.485±0.018、0.775±0.045、1.073±0.056(其中第5天兩組比較t=21.19,P<0.01)。以每日OD值均數(shù)繪制各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示,CMs組SKOV3的增殖能力明顯高于CMn組(圖3)。

    2.3 不同培養(yǎng)基處理后對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響 CMs組及CMn組穿過膜的細(xì)胞數(shù)分別為:235.00±29.68和129.30±15.52(t=5.47,P<0.01)。CMs處理后SKOV3細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)(圖4)。

    圖1 普通顯微鏡下觀察正常成纖維細(xì)胞和衰老成纖維細(xì)胞形態(tài)(a:正常的卵巢成纖維細(xì)胞,b:衰老的卵巢成纖維細(xì)胞;×40)

    圖2 熒光倒置顯微鏡下觀察SA-b-gal染色后正常成纖維細(xì)胞和衰老成纖維細(xì)胞形態(tài)(a:正常的卵巢成纖維細(xì)胞,b:衰老的卵巢成纖維細(xì)胞;×40)

    圖3 CCK-8法檢測(cè)不同培養(yǎng)基處理后SKOV3細(xì)胞的增殖能力

    圖4 Transwell小室檢測(cè)不同培養(yǎng)基處理后SKOV3細(xì)胞穿過膜到達(dá)下室的細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量圖(×100)

    2.4 三維培養(yǎng)中觀察不同培養(yǎng)基對(duì)SKOV3細(xì)胞的作用 CMs組和CMn組形成的克隆球數(shù)量分別為27.00± 2.16和11.67±2.50(t=8.04,P<0.01)。與CMn組比較,CMs組形成的克隆球明顯增大(圖5),數(shù)量增多。

    圖5 三維培養(yǎng)觀察不同培養(yǎng)基處理后SKOV3的克隆球形態(tài)(×100)

    3 討論

    20世紀(jì)60年代初,美國(guó)科學(xué)家Leonard Hayflick在體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種特殊的細(xì)胞生命活動(dòng)狀態(tài),并將其命名為細(xì)胞衰老[5]。最初衰老被認(rèn)為能阻止癌細(xì)胞的增殖潛能,從而在對(duì)抗癌癥中發(fā)揮重要作用,近來研究認(rèn)為衰老還能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。越來越多的證據(jù)表明:細(xì)胞衰老不僅僅是簡(jiǎn)單的細(xì)胞生長(zhǎng)中止現(xiàn)象,此外細(xì)胞衰老還涉及腫瘤抑制、腫瘤進(jìn)展、組織修復(fù)及炎癥反應(yīng)等復(fù)雜的生理活動(dòng)[7]。細(xì)胞衰老分為三大類:復(fù)制性衰老、癌基因誘導(dǎo)的衰老和應(yīng)激因素誘導(dǎo)的衰老。復(fù)制性衰老是指體外連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞在有限次數(shù)的細(xì)胞分裂后,喪失合成DNA及分裂的能力,最后導(dǎo)致增殖能力的喪失,但基本代謝過程仍能維持[8]。衰老細(xì)胞進(jìn)入一種既不同于靜止又不同于終末分化的獨(dú)特的生存狀態(tài)。此時(shí)衰老的成纖維細(xì)胞可使一種分泌型蛋白譜表達(dá)增加,并將其定義為衰老相關(guān)分泌因子或SASP[9]。通過cDNA微點(diǎn)陣分析,Bavik等[10]發(fā)現(xiàn)SASP由大量的旁分泌介質(zhì)組成,如Gro-1、IL-8和MMP2等,這些介質(zhì)在衰老的間質(zhì)成纖維細(xì)胞中與未衰老的成纖維細(xì)胞相比呈過度表達(dá)狀態(tài)。且這些因子又可以反過來促進(jìn)細(xì)胞的衰老。

    本研究對(duì)人體正常卵巢組織中分離的NOF進(jìn)行了研究,通過持續(xù)傳代發(fā)現(xiàn):正常卵巢成纖維細(xì)胞在傳代過程中逐漸進(jìn)入衰老,最多傳10代。衰老的細(xì)胞衰老相關(guān)beta半乳糖苷酶活性上升[11],表現(xiàn)為細(xì)胞有明顯的深藍(lán)色沉淀物。衰老成纖維分泌的條件培養(yǎng)基CMs對(duì)比于CMn明顯促進(jìn)卵巢腫瘤SKOV3的增殖和侵襲能力,在體外二維和三維培養(yǎng)都得到了證實(shí)。這可能在一定程度上解釋了卵巢癌易腹腔播散種植的生物學(xué)特性。由于三維培養(yǎng)更接近于體內(nèi)生長(zhǎng)模式,形成類似體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu),可以動(dòng)態(tài)觀察到腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移狀況。相較于一維的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及二維的Transwell實(shí)驗(yàn)具有明顯的優(yōu)勢(shì)[12-13]。三維培養(yǎng)模型中觀察到的克隆球?qū)τ隗w外研究腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移具有重要的價(jià)值。CMs促進(jìn)卵巢腫瘤SKOV3的增殖和侵襲能力,可能是由于衰老相關(guān)的分泌表型(SASP)發(fā)揮的作用。SASP包含一系列的炎癥細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,這些因子相互作用,在局部形成復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[9,14]。SASP還具有潛在的導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用[15],而EMT在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中都是至關(guān)重要的一步,最終促進(jìn)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。這將是我們下一步的研究?jī)?nèi)容。

    [1]Mao Y,Keller E T,Garfield D H,et al.Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer[J].Cancer Metastasis Rev, 2013,32(1-2):303-315.

    [2]Salameh T S,Le T T,Nichols M B,et al.An ex vivo co-culture model system to evaluate stromal-epithelial interactions in breast cancer[J].Int J Cancer,2013,132(2):288-296.

    [3]SMarthandan S,Priebe S,Hemmerich P,et al.Long-term quiescent fibroblast cells transit into senescence[J].PLoS One,2014,9 (12):e115597.

    [4]DePinho R A.The age of cancer[J].Nature,2000,408(6809):248-254.

    [5]Hayflick L.The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains[J].Exp CellRes,1965,37:614-636.

    [6]Campisi J.Cellular senescence:putting the paradoxes in perspective[J].Curr Opin Genet Dev,2011,21(1):107-112.

    [7]Rodier F,Campisi J.Four faces of cellular senescence[J].J Cell Biol,2011,192(4):547-556.

    [8]Wang M C,Oakley H D,Carr C E,et al.Gene pathways that delay Caenorhabditis elegans reproductive senescence[J].PLoS Genet, 2014,10(12):e1004752.

    [9]Canino C,Mori F,Cambria A,et al.SASP mediates chemoresistanceand tumor-initiating-activity of mesotheliomacells[J]. Oncogene,2012,31(26):3148-3163.

    [10]Ruhland M K,Loza A J,Capietto A H,et al.Stromal senescence establishes an immunosuppressive microenvironmentthat drives tumorigenesis[J].Nat Commun,2016,7:11762.

    [11]Endt H,Sprung C N,Keller U,et al.Detailed analysis of DNA repair and senescence marker kinetics over the life span of a human fibroblast cellline[J].J GerontolABiolSciMed Sci,2011,66 (4):367-375.

    [12]Frith J E,Thomson B,Genever P G.Dynamic three-dimensional culture methods enhancemesenchymalstem cellproperties and increase therapeutic potential[J].Tissue Eng Part C Methods, 2010,16(4):735-749.

    [13]Charwat V,Schutze K,Holnthoner W,et al.Potentialand limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3Dcellcultures[J].J Biotechnol,2015,205:70-81.

    [14]汪春年,吳曉英,呂輝,等.VEGF通過影響CXCR4的表達(dá)調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞侵襲性的研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2010,32(2):226-229.

    [15]Laberge R M,Awad P,Campisi J,et al.Epithelial-mesenchymal transition induced by senescent fibroblasts[J].Cancer Microenviron,2012,5(1):39-44.

    Senescent ovarian stromal fibroblasts promotes the proliferation and invasion ability of human ovarian cancer cells

    GAO Wen,ZHU Tao.Department of Gynecological Oncology, Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou 310022,China

    【 Abstract】 Objective To investigate the effect of senescent ovarian stromal fibroblasts on tumor growth and invasive ability of human ovarian cancer cells. Methods Normal human ovarian fibroblasts(NOF)were primarily cultured and senescence was induced by replicative exhaustion.Senescence associated beta-galactosidase staining was used to detect cell senescence of normal ovarian fibroblasts after serial subcultivation.Normal stromal fibroblasts conditioned mediums(CMn)and senescent stromal fibroblasts conditioned mediums(CMs)were collected.Ovarian cancer SKOV3 cells were treated with CMn or CMs.The cell proliferation and invasion were measured by cell counting kit 8(CCK8)and Transwell assay and three-dimensional cell culture,respectively. Results Replicative senescence was induced in NOF after serial subcultivation.Beta-galactosidase staining showed blue granules within cytoplasm of the senescent ovarian stromal fibroblasts.CCK8 assay showed that the proliferation of SKOV3 cells in CMs group was markedly increased compared to CMn group (OD value:2.067±0.058 vs 1.073± 0.056,t=21.19,P<0.01).Transwell assay that the migration and invasion of SKOV3 cells in CMs group were markedly increased compared with CMn group (235.00±29.68 vs 129.30±15.52,t=5.47,P<0.01).Three-dimensional culture showed that the clone spheres of SKOV3 cells in CMs group were larger and more aggressive than those in CMn group;and the number of clone spheres in CMS group were significantly increased compared with CMn group(27.00±2.16 vs 11.67±2.50,t=8.04,P<0.01). Conclusion Our results indicates that senescent ovarian stromal fibroblasts may enhance proliferation and invasion of human ovarian cancer cells.

    Ovarian cancer Senescence Stromal fibroblasts Three-dimensional cell culture

    2016-05-15)

    (本文編輯:馬雯娜)

    310022 杭州,浙江省腫瘤醫(yī)院婦瘤科

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