膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠在中藥作用下對其關(guān)節(jié)炎指數(shù)、IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL及OPG的影響探討

楊帆 楊勇 廉婧 彭頁 劉巍

(1. 火箭軍總醫(yī)院禮士路門診部，北京 100820；2. 火箭軍總醫(yī)院骨科，北京 100088；3. 解放軍總醫(yī)院南樓臨床部消化內(nèi)科，北京 100853；4.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院骨科，北京 100142；5.中國人民解放軍第四一三醫(yī)院麻醉科，浙江 舟山 316004)

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膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠在中藥作用下對其關(guān)節(jié)炎指數(shù)、IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL及OPG的影響探討

楊帆1楊勇2廉婧3彭頁4劉巍5△

(1. 火箭軍總醫(yī)院禮士路門診部，北京 100820；2. 火箭軍總醫(yī)院骨科，北京 100088；3. 解放軍總醫(yī)院南樓臨床部消化內(nèi)科，北京 100853；4.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院骨科，北京 100142；5.中國人民解放軍第四一三醫(yī)院麻醉科，浙江 舟山 316004)

目的 探討膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠在中藥作用下對其關(guān)節(jié)炎指數(shù)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、核因子-kB受體活化因子配體(RANKL)及護(hù)骨素(OPG)的影響。方法 取Wistar大鼠48只隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性組、A、B、C組。復(fù)制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，連續(xù)干預(yù) 4周后，各組大鼠眼眶靜脈取血，觀察關(guān)節(jié)炎指數(shù)、IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL及OPG。結(jié)果 與空白組相比，其余各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯增加(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、A、B、C組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯降低(P<0.05)。與空白組相比，模型組血清IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL、OPG及RANKL/OPG水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、A、B、C組血清IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL、OPG及RANKL/OPG水平明顯降低(P<0.05)，且A、B、C組大鼠血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平抑制作用及對RANKL、OPG及RANKL/OPG的改善情況均優(yōu)于陽性組(P<0.05)。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，A、B、C組可抑制 CIA 大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變。結(jié)論 自擬除痹湯可明顯降低CIA模型大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)及關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變，下調(diào)IL-1β、TNF-α、PGE2水平，抑制RANKL、OPG，從而可以有效防治CIA。

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎； 白細(xì)胞介素1β； 腫瘤壞死因子α； 前列腺素E2； 核因子-κB受體活化因子配體； 護(hù)骨素

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病，反復(fù)發(fā)作，其發(fā)病主要靶組織是作用于關(guān)節(jié)滑膜[1]。RA多發(fā)于30歲后患者，女性發(fā)病高于男性。對于RA的治療，西醫(yī)主要以非甾體類抗炎藥、基因免疫及外科手術(shù)治療作為基本治療方法，雖然上述方法在短期內(nèi)能夠緩解癥狀、在一定程度上能夠阻止骨關(guān)節(jié)病變的繼續(xù)進(jìn)展 ，然而長期應(yīng)用后，往往加重機(jī)體自身免疫失調(diào)[2]。中醫(yī)藥在治療RA過程中有自己獨(dú)特的優(yōu)勢，且不良反應(yīng)較少，成為目前廣大專家關(guān)注的熱點(diǎn)內(nèi)容[3]。然而，中醫(yī)藥作為規(guī)范的診療方案指導(dǎo)臨床，目前尚缺乏理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持?；诖?，筆者采用Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)法造模膠原誘導(dǎo)性(CIA)大鼠模型，給予自擬除痹湯進(jìn)行治療，觀察其對CIA大鼠關(guān)節(jié)變化的影響，以期為臨床治療RA提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑及儀器 自擬除痹湯(方藥組成：駱駝篷草、鹿含草、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、桑寄生、黃芪、續(xù)斷、白術(shù)、炒麥芽、細(xì)辛，均購自張仲景大藥房)，上述諸藥加水煎煮、抽濾、蒸發(fā)濃縮成水煎劑(相當(dāng)于生藥1.90 g/mL)。雷公藤多苷片：由浙江普洛康裕天然藥物有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z33020778。弗氏完全佐劑(FAC)、Ⅱ型膠原蛋白由上海鈺博生物科技有限公司提供。冰醋酸：由張家港保稅區(qū)明樂化工有限公司提供。TNF-α試劑盒由上海基免實(shí)業(yè)有限公司提供。IL-1β試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供。PGE2試劑盒由上海研謹(jǐn)生物科技有限公司提供。RANKL試劑盒由上海豐壽實(shí)業(yè)有限公司提供。OPG試劑盒由上海喬羽生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 Wistar大鼠, 雄性，體質(zhì)量180～200 g，由山東魯抗醫(yī)藥有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20130001。

1.3 方法 取大鼠48只，采用隨機(jī)數(shù)字分組法將其分為空白組、模型組、陽性組、自擬除痹湯大計(jì)量組(A組)、自擬除痹湯中計(jì)量組(B組)、自擬除痹湯小計(jì)量組(C組)，每組8只。除空白組外，將Ⅱ型膠原蛋白用弗氏完全佐劑(FAC)配成3.0 mg/mL的乳劑，在大鼠左后足跖皮內(nèi)注射,110 μL/只，復(fù)制CIA大鼠模型。其中，空白組大鼠左后足跖皮內(nèi)注射同體積的生理鹽水。連續(xù)造模10 d。空白組、模型組大鼠給予同容積生理鹽水，A組、B組、C組給予自擬除痹湯(生藥38.0 g/kg，19.0 g/kg，9.5 g/kg)，陽性組給予雷公藤多苷片混懸液5.0 g/kg，連續(xù)給藥4周。所有大鼠每周稱重1次。

1.4 指標(biāo)測定 (1)采用0～4級評分法對關(guān)節(jié)炎指數(shù)進(jìn)行評分，滿分為18分：①0分，趾關(guān)節(jié)未見紅腫；②1分，趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫；③2分，趾關(guān)節(jié)及足趾均出現(xiàn)腫脹；④3分，趾關(guān)節(jié)以下足爪出現(xiàn)腫脹；⑤4分，全部足爪均出現(xiàn)腫脹且嚴(yán)重變形。(2)TNF-α、IL-1β、PGE2水平測定：采用ELISA法對大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2水平進(jìn)行測定。(3)RANKL及OPG表達(dá)測定：采用ELISA法對RANKL及OPG進(jìn)行測定。(4)病理學(xué)檢查：處死大鼠，取關(guān)節(jié)滑膜組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察各組大鼠病理組織變化。

2 結(jié) 果

2.1 不同組別大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)對比 與空白組相比，其余各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、A、B、C組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 不同組別大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)對比

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05。

2.2 不同組別大鼠TNF-α、IL-1β、PGE2水平影響對比 與空白組相比，模型組血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、A、B、C組血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平明顯降低(P<0.05)，且A、B、C組大鼠血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平抑制作用優(yōu)于陽性組(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 不同組別大鼠對TNF-α、IL-1β、PGE2水平影響對比

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05。

2.3 不同組別大鼠RANKL及OPG表達(dá)的對比 與空白組相比，模型組血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、A、B、C組血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均顯著降低(P<0.05)，且A、B、C組大鼠血清RANKL、OPG及RANKL/OPG的改善情況均優(yōu)于陽性組(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 不同組別大鼠RANKL及OPG表達(dá)的對比

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05。

2.4 不同組別大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理組織結(jié)果對比 病理學(xué)結(jié)果顯示，空白組關(guān)節(jié)腔滑膜結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，滑膜內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨及滑膜下細(xì)小血管均未見異常。模型組關(guān)節(jié)腔滑膜細(xì)胞增生明顯、呈散亂性排列、且大小不一、間隙狹窄，部分細(xì)胞已纖維化，漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等大量炎性細(xì)胞充斥于滑膜內(nèi)，滑膜組織廣泛水腫，可見多發(fā)的細(xì)小血管，嚴(yán)重部分己形成管黯，關(guān)節(jié)軟骨表面剝脫，侵蝕嚴(yán)重。陽性組病變程度與自擬除痹湯各組基本相同，表現(xiàn)為：關(guān)節(jié)腔滑膜增生不明顯，僅有部分鏡下存在細(xì)胞間隙和排列不齊，可見部分組織水腫，并可見少量炎性細(xì)胞，其中，A組滑膜下可見散片的毛細(xì)血管，但較模型組明顯減少，未見血管黯，關(guān)節(jié)軟骨仍有表面侵蝕，較模型組略有減輕。結(jié)果見圖1。

3 討 論

RA是臨床常見的慢性自身免疫性疾病，對于RA的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，至今尚無定論[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子在RA的發(fā)病過程占據(jù)重要地位，尤其是IL-1β、TNF-α在RA的發(fā)病中扮演舉足輕重的地位。TNF-α是產(chǎn)生于滑膜及軟骨血管翳的巨噬細(xì)胞，屬于炎癥分子，能夠向上調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞中的細(xì)胞因子、PGE2等。研究[8]認(rèn)為，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生時， IL-1基因在CD14+巨噬細(xì)胞中具有優(yōu)勢表達(dá)。IL-1對于滑膜細(xì)胞及浸潤的淋巴細(xì)胞具有增殖和分化作用，有助于促進(jìn)花生四烯酸的生成，可導(dǎo)致PGE2及膠原酶的合成與釋放[6]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，RANKL可介導(dǎo)破骨細(xì)胞的增殖活化，這在RA骨質(zhì)破壞進(jìn)程中起著重要的作用。OPG是腫瘤壞死因子受體超家族中一員[7]，是一種可溶性蛋白質(zhì)，是RANKL的天然阻斷受體，能夠阻斷與RANK的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的增殖活化。

研究[8]發(fā)現(xiàn)，一些中藥能夠有效抑制炎癥因子，阻止破骨細(xì)胞增殖活化，使RANKL降低、護(hù)骨素升高、調(diào)節(jié)RANKL/OPG比值[9]，發(fā)揮其抑制關(guān)節(jié)破壞及骨吸收的作用。本研究所用自擬除痹湯具有補(bǔ)益肝腎、滋養(yǎng)氣血、散寒祛瘀通絡(luò)之功效。方中駱駝蓬草能夠堅(jiān)固筋骨、散寒除濕；配伍鹿含草以養(yǎng)肝補(bǔ)腎、強(qiáng)筋壯骨、祛風(fēng)、除濕、止血；合用當(dāng)歸以補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便；配伍補(bǔ)骨脂以溫腎助陽、止瀉；桑寄生具有除風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、益血、安胎之功效，黃芪具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、祛毒排膿、生肌之功效；續(xù)斷具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋健骨、止血安胎、療傷續(xù)折之功效；白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎之功效；炒麥芽具有行氣消食、健脾開胃、退乳消脹之功效；細(xì)辛具有祛風(fēng)散寒、通竅止痛、溫肺化飲之功效[9]。本方配伍合理，諸藥相合共奏補(bǔ)益肝腎、滋養(yǎng)氣血、散寒、祛瘀、通絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理研究[10-11]表明，當(dāng)歸、黃芪能夠抑制IL-1β、IL-2及TNF-α，發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛的作用；補(bǔ)骨脂抑制過高的免疫球蛋白IgA、IgG及IgM恢復(fù)正常。

本組研究結(jié)果顯示，與空白組相比，其余各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯增加。與模型組相比，陽性組、A、B、C組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯降低。與空白組相比，模型組血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平均明顯升高。與模型組相比，陽性組、自擬除痹湯大、中、小劑量組血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平明顯降低，且A、B、C組大鼠血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平抑制作用優(yōu)于陽性組。與空白組相比，模型組血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均明顯升高。與模型組相比，陽性組、A、B、C組血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均顯著降低，且A、B、C組大鼠血清RANKL、OPG及RANKL/OPG的改善情況均優(yōu)于陽性組。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，A、B、C組下可抑制 CIA 大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變。上述結(jié)果提示，自擬除痹湯能夠明顯改善CIA模型大鼠引起的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

綜上所述，自擬除痹湯可明顯降低CIA模型大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)及關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變，下調(diào)IL-1β、TNF-α、PGE2，抑制RANKL、OPG，從而達(dá)到有效防治CIA的目的。

(本文圖1見封三)

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Effect of arthritis index, IL-1β, TNF-α and PGE2level, RANKL and osteoprotegerin by collagen induced arthritis in rats under the action of traditional Chinese Medicine

YangFan1,YangYong2,LianJing3,PengYe4,LiuWei5.

1.DepartmentofClinicinLishiRoad,GeneralHospitalofRocketArmy,Beijing100820,China. 2.DepartmentofOrthopedics,GeneralHospitalofRocketArmy,Beijing100088,China. 3.DepartmentofDigestionMedicineofClinic,GeneralHospitalofChinesePeopleLiberationArmy,Beijing100853,China. 4.DepartmentofOrthopedics,AirForceGeneralHospitalofChinesePLA,Beijing100142,China. 5.DepartmentofAnesthesiology,the413HospitalofChinesePLA,Zhoushan316004,China.

Objective To discuss the effect of arthritis index, IL-1β, TNF-α and PGE2level, RANKL and OPG by collagen induced arthritis in rats under the action of traditional Chinese Medicine. Methods According to the random number table, 48 wistar rats were divided into the normal control group, model group, positive control group, group A, B, C. All rats were copied the model of collagen induced arthritis, after 4 weeks of continuous intervention, each rat were orbital venous blood, and then were observed arthritis index,IL-1β,TNF-α and PGE2, RANKL and OPG. Results Compared with the control group, arthritis index of rats in other groups were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the arthritis index of the positive group and group A，B，C were decreased significantly (P<0.05). Compared with the blank group, the levels of IL-1β，TNF-α，PGE2，RANKL,OPG and RANKL/OPG of serum of the model group rats were significantly increased (P<0.05).The levels of IL-1β，TNF-α，PGE2，RANKL, OPG and RANKL/OPG of serum in the positive group, group A, B, C were significantly decreased than that of the model group (P<0.05), and the inhibition of the levels of IL-1β, TNF-α, PGE2and the improvement of the RANKL,OPG and RANKL/OPG of serum in the group A, B, C were better than the positive group (P<0.05). Histopathological results showed that the group A, B, C could inhibit the pathological changes of articular tissue in CIA rats. Conclusion The ZI NI CHU BI TANG can significantly reduce arthritis index and the histological change of articular tissue pathology, reduce the level of the IL-1β, TNF-α, PGE2, inhibit the RANKL, OPG, and then can effectively prevent CIA.

Collagen-Induced Arthritis； IL-1β； TNF-α； PGE2； RANKL； Osteoprotegerin

國家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號81403451)

R285.5

A

1000-744X(2016)09-0902-03

2016-04-13)

△通信作者，E-mail:1039331979@qq.com