3種檢測(cè)肺炎支原體感染方法的比較分析

曹波，郁飛，張憲偉，陳紅兵

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210008)

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·論 著·

3種檢測(cè)肺炎支原體感染方法的比較分析

曹波，郁飛，張憲偉，陳紅兵

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210008)

目的:比較3種檢測(cè)方法對(duì)肺炎支原體(MP)感染的臨床診斷效果及應(yīng)用價(jià)值。方法：對(duì)疑為呼吸系統(tǒng)MP感染的494例住院患兒留取痰液，用PCR熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行MPDNA檢測(cè)，用被動(dòng)凝集法和間接免疫熒光法進(jìn)行血清抗MP抗體檢測(cè)。結(jié)果：PCR熒光探針?lè)?yáng)性299例(60.53%)，被動(dòng)凝集法陽(yáng)性290例(58.70%)，間接免疫熒光法陽(yáng)性242例(48.99%)，PCR熒光探針?lè)ㄅc被動(dòng)凝集法的陽(yáng)性率無(wú)差別(χ2=0.341,P>0.012 5)，間接免疫熒光法與PCR熒光探針?lè)?χ2=13.274,P<0.012 5)、被動(dòng)凝集法(χ2=9.383,P<0.012 5)陽(yáng)性率相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。被動(dòng)凝集法陽(yáng)性結(jié)果中滴度為40的患兒共77例，其中70例的另2種方法結(jié)果均為陽(yáng)性。結(jié)論：間接免疫熒光法的檢測(cè)陽(yáng)性率低于PCR熒光探針?lè)ㄅc被動(dòng)凝集法。對(duì)于兒童，被動(dòng)凝集法靜脈血標(biāo)本的采集較PCR熒光探針?lè)ǖ奶禈?biāo)本采集更為簡(jiǎn)便，可將被動(dòng)凝集法作為MP感染的門(mén)診篩查項(xiàng)目；被動(dòng)凝集法應(yīng)將滴度≥40的結(jié)果判定為陽(yáng)性。

肺炎支原體；PCR熒光探針?lè)ǎ槐粍?dòng)凝集法；間接免疫熒光法

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)是兒童時(shí)期肺炎或其他呼吸道感染的重要病原體之一，并可有復(fù)雜的肺外表現(xiàn)[1]。MP感染的治療與其他細(xì)菌和病毒感染的治療方案截然不同，及時(shí)、有效地進(jìn)行MP感染的實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)指導(dǎo)臨床治療，進(jìn)而預(yù)防可能發(fā)生的醫(yī)院內(nèi)流行和并發(fā)癥十分重要[2-3]。我們采用PCR熒光探針?lè)?PCR fluorescence probing)、被動(dòng)凝集法(passive particle agglutination)、間接免疫熒光法(IFA)3種常用MP感染實(shí)驗(yàn)室診斷方法對(duì)疑似MP感染患兒做平行檢測(cè)，期望能為臨床醫(yī)師提供準(zhǔn)確的MP感染實(shí)驗(yàn)診斷方法。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

2014年11月至2015年3月我院呼吸科疑為呼吸系統(tǒng)MP感染的住院患兒共494例，其中男312例(63.16%)，女182例(36.84%)。

1.2 PCR熒光探針?lè)ǘ繖z測(cè)MP

MP核酸定量檢測(cè)試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安公司提供。使用一次性吸痰器采集患兒氣管深部分泌物1～3 ml作為痰液標(biāo)本，用4倍體積40 g·L-1的NaOH室溫消化30 min，取1 ml至離心管，15 000 r·min-1離心5 min，用生理鹽水離心洗滌1次，棄上清，加50 μl DNA提取液，混勻，沸水浴10 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液2 μl做PCR檢測(cè)。反應(yīng)管置于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司PE5700自動(dòng)熒光檢測(cè)儀，93 ℃預(yù)變性2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 120 s，40個(gè)循環(huán)。熒光激發(fā)波長(zhǎng)為487 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為525 nm。反應(yīng)結(jié)束，計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析結(jié)果，以拷貝≥5×102為陽(yáng)性。

1.3 被動(dòng)凝集法檢測(cè)抗MP抗體

按富士瑞必歐株式會(huì)社提供的抗MP抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)患兒血清進(jìn)行檢測(cè)，滴度≥40為陽(yáng)性。

1.4 間接免疫熒光法檢測(cè)抗MP抗體

按VIRCELL公司提供9項(xiàng)呼吸道感染病原體IgM抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)患兒血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行3種方法的陽(yáng)性率比較，用R×2表資料χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若有差異，再用χ2分割法(partitions ofχ2method)重新規(guī)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)，通過(guò)3個(gè)獨(dú)立的四格表資料χ2檢驗(yàn)行兩兩比較，來(lái)判斷各方法間的陽(yáng)性率是否有差別。

2 結(jié) 果

494例受檢患兒中，PCR熒光探針?lè)?yáng)性299例，陽(yáng)性率60.53%；被動(dòng)凝集法陽(yáng)性290例，陽(yáng)性率58.70%；間接免疫熒光法陽(yáng)性242例，陽(yáng)性率48.99%。對(duì)3種方法的陽(yáng)性率行R×2表資料χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.434，P<0.01)。再用χ2分割法，將檢驗(yàn)水準(zhǔn)重新規(guī)定為α′=0.012 5，通過(guò)3個(gè)獨(dú)立的四格表資料χ2檢驗(yàn)行兩兩比較，結(jié)果顯示間接免疫熒光法與PCR熒光探針?lè)?χ2=13.274，P=0.000)、被動(dòng)凝集法(χ2=9.383,P=0.002)的陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但PCR熒光探針?lè)ㄅc被動(dòng)凝集法的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.341，P=0.560)。

被動(dòng)凝集法陽(yáng)性結(jié)果中滴度為40的患兒共77例，占此方法所有陽(yáng)性標(biāo)本的26.6%，其中70例的另2種方法結(jié)果均為陽(yáng)性。

各年齡段3種方法所測(cè)MP或抗MP抗體陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各方法不同年齡段MP或抗MP抗體陽(yáng)性 例

3 討 論

MP的分離培養(yǎng)和鑒定可客觀反映MP感染的存在，作為傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，至今仍是支原體鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但費(fèi)時(shí)耗力。MP對(duì)培養(yǎng)條件要求苛刻，生長(zhǎng)緩慢，做出判定需3～4周。當(dāng)標(biāo)本中MP數(shù)量極少、培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)不夠或操作不當(dāng)時(shí)，均會(huì)出現(xiàn)假陰性[3]。目前臨床實(shí)驗(yàn)室診斷多采用血清學(xué)方法和PCR方法。由于PCR技術(shù)的不斷進(jìn)步，以標(biāo)記特異性熒光探針為特點(diǎn)的熒光定量PCR技術(shù)，完全閉管式操作，大大減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)，使其同時(shí)具備良好的靈敏度和特異性，并可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確定量[4-6]。本實(shí)驗(yàn)中熒光定量PCR方法的陽(yáng)性率高于其他兩種方法。被動(dòng)凝集法的陽(yáng)性率與熒光定量PCR的相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也是一種高效方法。兒童咳痰能力較差，PCR法多采用吸痰方式來(lái)采集標(biāo)本，而吸痰操作要求高，只適用于癥狀較重有吸痰需要的住院患兒。被動(dòng)凝集法以取樣較為容易的靜脈血清作為標(biāo)本，且實(shí)驗(yàn)用時(shí)僅3 h，可單個(gè)標(biāo)本檢測(cè)，更適合用于門(mén)診疑似MP感染患兒的篩查。與這兩種方法相比，間接免疫熒光法的陽(yáng)性率較低，將影響其對(duì)MP感染的診斷效率。

在使用被動(dòng)凝集法來(lái)檢測(cè)支原體抗體時(shí)，由于兒童抽血依從性差，較難實(shí)現(xiàn)雙份血清恢復(fù)期抗體滴度上升4倍或下降為原來(lái)的1/4的診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床上多用單份血清來(lái)檢測(cè)。黃海輝等[7-8]認(rèn)為應(yīng)將單份血清抗體滴度≥80或≥160作為血清學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn);而本實(shí)驗(yàn)被動(dòng)凝集法滴度為40的陽(yáng)性標(biāo)本共77例，占所有陽(yáng)性標(biāo)本的26.6%，其中70例得到本實(shí)驗(yàn)另2種方法的驗(yàn)證，7例呈陰性。用被動(dòng)凝集法測(cè)定抗MP抗體時(shí)，須注意其所測(cè)得的抗體90%為抗MP-IgM，但也包含了10%左右的抗MP-IgG。故我們認(rèn)為，對(duì)于被動(dòng)凝集法抗體滴度為40陽(yáng)性的標(biāo)本，應(yīng)引起臨床重視并結(jié)合患兒臨床癥狀、既往感染情況、影像學(xué)檢查、PCR及其他血清學(xué)檢查結(jié)果綜合判斷，不能簡(jiǎn)單地將滴度為40作為排除MP感染依據(jù)。

與其他MP感染的流行病學(xué)報(bào)道相似，本項(xiàng)調(diào)查顯示隨著年齡的增加，MP陽(yáng)性率明顯增加(P<0.01)，但由于研究對(duì)象均為住院疑似MP感染并同時(shí)進(jìn)行3種方法檢查的患兒，所以整體陽(yáng)性率較高，能印證兒童MP感染率隨年齡增高的趨勢(shì)，但不能作為流行病學(xué)研究依據(jù)。

目前國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)的MP感染檢測(cè)方法包括培養(yǎng)法、血清學(xué)方法和PCR方法。由于培養(yǎng)法的局限性，臨床并不常用，故臨床應(yīng)結(jié)合血清學(xué)和PCR方法的優(yōu)缺點(diǎn)，聯(lián)合用于臨床診斷。若血清學(xué)檢測(cè)陰性而PCR陽(yáng)性，可能血清學(xué)檢查時(shí)間過(guò)早，患者體內(nèi)抗體尚未產(chǎn)生，甚至部分患者不能產(chǎn)生抗體；當(dāng)血清學(xué)方法陽(yáng)性而PCR陰性時(shí)，須考慮近期是否已發(fā)生過(guò)支原體感染以及血清學(xué)檢測(cè)假陽(yáng)性的可能?？傊?，在診斷MP感染時(shí)，可將被動(dòng)凝集法作為MP感染的病原學(xué)篩查項(xiàng)目，將PCR方法作為補(bǔ)充，并結(jié)合臨床癥狀和治療效果綜合判斷，爭(zhēng)取較早的明確診斷。

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2016-01-20

2016-05-23

曹波(1982-)，男，江蘇南京人，主管檢驗(yàn)師。E-mail:22309437@qq.com

曹波，郁飛，張憲偉，等.3種檢測(cè)肺炎支原體感染方法的比較分析[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2016，35(5)：770-772.

R563.15

A

1671-6264(2016)05-0770-03

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．027