何首烏藥效成分3種提取方法比較

楊勸生

甘肅天水岐黃藥業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅 天水 741018

何首烏藥效成分3種提取方法比較

楊勸生

甘肅天水岐黃藥業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅 天水 741018

目的：研究中藥材何首烏的不同提取方法，比較所提取的成分，探索優(yōu)化何首烏的提取工藝。方法：采用高效液相色譜法(H PLC)分析測定何首烏滲漉提取、75℃回流提取、89℃回流提取的提取液的二苯乙烯苷、蒽醌類化合物含量，并進(jìn)行3種不同提取方法的提取液化學(xué)成分指紋圖譜相似度及所得干物質(zhì)考察。結(jié)果：3種提取方法提取的二苯乙烯苷、蒽醌類化合物的含量基本接近。結(jié)合蒽醌的含量89℃回流提取略高于滲漉提?。?5℃回流提取略低于滲漉提取。何首烏3種不同提取方法制備的供試品溶液的特征指紋圖譜與共有模式的相似度均大于0.95，符合國家對藥材指紋圖譜研究的技術(shù)要求（大于0.9）。結(jié)論：3種不同提取方法制備的指紋圖譜相似程度高，其提取液化學(xué)成分差異不大。

何首烏；高效液相色譜法；滲漉；回流；指紋圖譜

蓯蓉通便口服液是甘肅天水岐黃藥業(yè)有限責(zé)任公司獨(dú)家研制的專利產(chǎn)品，以肉蓯蓉、何首烏、枳實(shí)、蜂蜜科學(xué)組方，具有滋陰補(bǔ)腎，潤腸通便的功效。其處方中何首烏可解毒消癰，潤腸通便，主要成分有二苯乙烯苷類、蒽醌類、磷脂類化合物，以二苯乙烯苷類成分含量最高，其次為蒽醌類成分［1］。本文在何首烏提取采用溶媒及用量一致的情況下，比較回流法和滲漉法提取液的化學(xué)成分相似程度、含量等，為蓯蓉通便口服液生產(chǎn)中何首烏回流提取替代滲漉提取提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司提供)。對照品：2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品(批號：110844-200908)、大黃素(批號：110756-200110)、大黃素甲醚(批號：110758-201013)等由中國藥品生物制品檢定所提供。乙腈為色譜純，試劑與試藥為分析純，水為重蒸餾水。

1.2 色譜條件［1-2］色譜柱：Dikma C18(4.6 mm× 250 mm，5μm)。經(jīng)過對下列流動相的選擇、對比實(shí)驗(yàn)：甲醇-0.5%醋酸溶液(42∶58)、乙腈-水(15∶85)、甲醇-0.1%磷酸溶液梯度、乙腈-0.1%甲酸溶液，以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相梯度洗脫分離效果最佳，峰形及保留時間均比較理想；流速：1.0 mL/min；檢測波長為280 nm；柱溫30℃；時間72分鐘，見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

2 方法與結(jié)果

2.1 何首烏藥材3種不同提取方法提取液的制備 取何首烏粗粉60g，精密稱定，裝入內(nèi)徑2.5cm的滲漉管中，加95%的乙醇適量浸漬12小時，室溫用9倍量70%乙醇作溶劑，緩緩滲漉，收集漉液，回收乙醇，濃縮，用70%乙醇定容于500 mL的量瓶。取何首烏粗粉60g，精密稱定，用9倍量70%乙醇作溶劑，分3次，75℃回流提取，合并提取液，取上清液，回收乙醇，濃縮，用70%乙醇定容于500 mL的量瓶。取何首烏粗粉60 g，精密稱定，用9倍量70%乙醇作溶劑，分5次，89℃回流提取，合并提取液，取上清液，回收乙醇，濃縮，用70%乙醇定容于500 mL的量瓶。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，精密加入70%乙醇，制成含2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷537.102 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。精密稱取大黃素對照品適量，精密加入70%乙醇，制成含大黃素78.8 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。精密稱取大黃素甲醚對照品適量，精密加入70%乙醇，制成含大黃素甲醚24.1516 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 供測二苯乙烯苷、測游離蒽醌用 分別精密吸取3種何首烏藥材不同提取方法和條件提取液1 mL，置10 mL量瓶，加入70%乙醇至刻度,搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液A。

2.3.2 測總蒽醌用 分別精密吸取何首烏藥材3種不同提取方法和條件提取液5 mL，置具塞錐形瓶中，水浴蒸干，精密加8%鹽酸溶液20 mL,超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)5分鐘，加三氯甲烷20 mL，水浴中加熱回流1小時，取出，立即冷卻，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，酸液再用三氯甲烷振搖提取3次，15 mL/次，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)?0%乙醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密吸取上述定容液1 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻?yàn)V過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液B。

2.4 理論板數(shù)的計(jì)算 在上述條件下，將對照品溶液注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，量出供試品溶液2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰的保留時間Tr(以分鐘或長度計(jì)算)和半峰高寬 (Wh/2)，按n=5.54(Tr/Wh/2)2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。理論板數(shù)按鹽酸2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰計(jì)算不低于2 500。

2.5 分離度 依據(jù)高效液相色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ D)的規(guī)定，待測峰與其他峰的分離度應(yīng)不小于1.5，按分離度的計(jì)算公式計(jì)算供試品色譜中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰與其他峰的分離度，供試品的分離度均符合規(guī)定。

2.6 精密度 分別精密吸取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液、大黃素對照品溶液各10 μL，按上述色譜條件測定，各進(jìn)樣5次，測定峰面積積分值，RSD分別為0.13%、0.86%、0.12%。

2.7 線性關(guān)系考察 精密吸取上述2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液4、6、8、10、12、14 μL，按上述色譜條件分別注入液相色譜儀，以對照品的進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程：C=6.703 75× 10-7A-0.433 20，r=0.999 2；2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在2.148 4～7.519 4 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系。精密吸取上述大黃素對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，按上述色譜條件分別注入液相色譜儀，以對照品的進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程：C=2.686 04×10-7A-0.031 51，r=0.999 88；大黃素在0.788～7.880 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系。精密吸取上述大黃素甲醚對照品溶液4、6、8、10、12、14 μL，按上述色譜條件分別注入液相色譜儀，以對照品的進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程：C=1.38410×10-6A-0.17390，r=0.999 2；大黃素甲醚在0.096 6～0.338 1 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.8 耐用性 為了保證測定方法的耐用性，我們對供試品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8小時，按上述色譜條件各進(jìn)樣一次，10 μL/次，結(jié)果見表 2。表明2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚在8小時內(nèi)穩(wěn)定。RSD分別為0.14%、0.89%、0.99%。

2.9 不同提取方法有效成分含量測定 分別精密吸取上述供試品溶液A、供試品溶液B，按上述色譜條件進(jìn)樣，10 μL/次，測定2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚積分值，計(jì)算。見表2。

表2 不同提取方法有效成分含量比較 m g

2.10 指紋圖譜相似度考察 分別精密吸取何首烏藥材3種不同提取方法提取的提取液1 mL，置10 mL量瓶，加入70%乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1 0.1 方法學(xué)考察 按照下列公式計(jì)算各色譜峰的相對保留時間及相對峰面積：

相對保留時間=各色譜峰保留時間/二苯乙烯苷色譜峰保留時間

相對峰面積=各色譜峰峰面積/二苯乙烯苷色譜峰峰面積

2.1 0.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，進(jìn)樣6次，10 μL/次，以二苯乙烯苷色譜峰(6號峰)為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。相對保留時間RSD為0.06%～0.34%，相對峰面積RSD為0.71%～11.47%。

2.1 0.3 共有模式的建立和相似度計(jì)算 將何首烏3種不同提取方法制備的供試品溶液各10份的高效液相特征圖譜的結(jié)果，導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”，采用“均數(shù)法”導(dǎo)出共30份樣品的共有模式，見圖1。

圖1 何首烏三種不同提取方法和條件的供試品溶液各10批的高效液相特征圖

3 討論

何首烏中的主要成分有二苯乙烯苷類、蒽醌類、磷脂類化合物；以二苯乙烯苷類成分含量最高，其次為蒽醌類?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明何首烏中的結(jié)合蒽醌類物質(zhì)，具有促進(jìn)胃腸蠕動、瀉下的作用［3-4］。

對從何首烏3種不同提取方法提取的含量結(jié)果和指紋圖譜相似度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷、蒽醌類化合物的含量基本接近。結(jié)合蒽醌的含量以89℃回流提取略高于滲漉提取；75℃回流提取由于提取液的溶媒用量少于滲漉提取，結(jié)合蒽醌的含量略低于滲漉提取。何首烏3種不同提取方法制備的供試品溶液的特征指紋圖譜與共有模式的相似度均大于0.95，符合國家對藥材指紋圖譜研究的技術(shù)要求(大于0.9)。說明3種不同提取方法制備的指紋圖譜相似程度高，由此可以得出3種不同方法提取的何首烏，由于提取溶媒、溶媒用量一致，其提取液的化學(xué)成分相似程度高、含量測定結(jié)果無明顯差異，回流提取沒有造成遇熱易破壞成分的損失?？烧J(rèn)為何首烏回流與滲漉提取比較，其工藝和化學(xué)成分沒有質(zhì)的變化，為何首烏回流提取替代滲漉提取提供了依據(jù)。

［1］ 羅文，劉斌，王偉，等.何首烏藥材H PLC指紋圖譜研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2008,31(8):557-560.

［2］ 蔡麗芬，張倩，鐘國躍.H PLC法同時測定何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分的方法學(xué)研究［C］.北京：全國第8屆天然藥物資源學(xué)術(shù)研討會論文集，2008:337-341.

［3］ 羅瑞芝，賈偉.何首烏研究進(jìn)展［J］.中草藥,2005,36(7): 1097-1099.

［4］ 劉振麗，宋志前.何首烏炮制過程中結(jié)合蒽醌含量與瀉下作用變化的相關(guān)性分析［C］.濟(jì)南：現(xiàn)代化中藥制劑發(fā)展與中藥藥理學(xué)研究交流會，2007：192-194.

Comparison of Three Extract Methods for the Medicinal Composition of HeShouWu

YANG Quansheng
Qihuang Limited Liability Company of medicine from Tianshui,Gansu Province,Tianshui 741018,China

Objective:To study the different extract methods of herb HeShouWu'compare extracted components，and explore as well as optimize the extraction process of HeShouWu.Methods:The HPLC method was used to analyze and determine the contents of stilbene glycoside,anthraquinones in HeShouWu extract by percolation extraction,reflux extraction at the temperatures of 75℃and 89℃.The similarities and dry matters of the fingerprint of chemical components from extracts by three different extract methods were investigated.Results:The contents of stilbene glycoside and anthraquinones extracted by three extract methods were approximately equal.Contents of combined anthraquinones by 89℃ reflux extraction were slightly superior to percolation extraction;Contents of combined anthraquinones by 75℃reflux extraction were slightly lower than percolation extraction.The characteristic fingerprint and similarity of common patterns of HeShouWu test solution prepared by three different extract methods were all greater than 0.95 which satisfied the technical requirements for the research of the fingerprint of Chinese medicinal herbs(＞0.9).Conclusion:The similarity degree of fingerprints prepared by three different extract methods is high and there is not an obvious difference in the chemical components from its extract.

HeShouWu;HPLC;percolation;reflux;fingerprint

R284.2

A

1004-6852(2016)08-0035-03

2015-12-16

楊勸生(1974—)，男，副主任中藥師。研究方向：藥品生產(chǎn)、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制、藥品注冊、新藥研發(fā)。