人參皂甙Rg3對胰腺癌SW-1990細胞皮下移植瘤血管生成擬態(tài)影響的研究

郭敬強 林勝璋

人參皂甙Rg3對胰腺癌SW-1990細胞皮下移植瘤血管生成擬態(tài)影響的研究

郭敬強 林勝璋

目的 研究人參皂甙Rg3對胰腺癌SW-1990細胞皮下移植瘤生長及血管生成擬態(tài)的影響。方法 用胰腺癌SW-1900細胞株建立裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型，分成4組：0.9%氯化鈉溶液對照組、5mg/kg人參皂甙Rg3組、10mg/kg人參皂甙Rg3組、20mg/kg人參皂甙Rg3組，每組7只。各組裸鼠予腹腔注射給藥，隔天1次，給藥4周。給藥結(jié)束后3d處死裸鼠，檢測各組移植瘤的體積和重量；CD31/PAS染色觀察移植瘤血管生成擬態(tài)的變化；熒光定量PCR和Western b lot檢測各組移植瘤鈣粘蛋白（VE-Cadherin）、絡氨酸激酶受體2（EphA2）、基質(zhì)金屬蛋白2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白9（MMP-9）m RNA和蛋白表達水平。結(jié)果與對照組比較，20mg/kg人參皂甙Rg3組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤體積減小、重量減輕（均P＜0.05）。與對照組比較，5mg/kg人參皂甙Rg3組、10mg/kg人參皂甙Rg3組、20mg/kg人參皂甙Rg3組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤擬態(tài)、正常血管生成均減少（均P＜0.05），VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9 m RNA和蛋白表達水平均降低（均P＜0.05）。結(jié)論 人參皂甙Rg3可抑制胰腺癌SW-1900細胞皮下移植瘤生長和血管生成擬態(tài)形成，可能是通過調(diào)控VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9的表達發(fā)揮抗腫瘤作用。

裸鼠皮下移植瘤 血管生成擬態(tài) 鈣粘蛋白 絡氨酸激酶受體2 基質(zhì)金屬蛋白9 基質(zhì)金屬蛋白2

胰腺癌是病死率極高的惡性腫瘤，患者5年生存率僅為6%[1]。惡性腫瘤的生長、侵襲、復發(fā)和轉(zhuǎn)移離不開血液供應[2]。研究發(fā)現(xiàn)，部分高度惡性、侵襲性的腫瘤細胞自身可通過內(nèi)皮化相互連接，形成特殊的微循環(huán)管道向腫瘤提供血供，這種不依賴于內(nèi)皮細胞的腫瘤內(nèi)血管生成模式稱為血管生成擬態(tài)[3]。人參皂甙Rg3是從人參中提取的一種微量四環(huán)三萜皂甙，能夠抑制腫瘤新生血管形成[4]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌SW-1990細胞在體外鼠尾I型膠原蛋白建立的三維培養(yǎng)環(huán)境中能形成血管生成擬態(tài)[5]。基于此，本研究通過觀察人參皂甙Rg3對裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型的干擾效果，分析其對胰腺癌細胞的生長及血管生成擬態(tài)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑和動物 人參皂甙Rg3（純度≥98%）購自上海博蘊生物科技有限公司。MMP-2抗體購自美國Abgent公司，MMP-9抗體購自美國Abcam公司，VE-cadherin抗體購自美國abgent公司，EphA2抗體購自美國R&D公司。BALB/C-nu裸鼠（雄性，4~6周齡，體重18~22g）購自中國科學院上海實驗動物中心。

1.2 細胞培養(yǎng) 胰腺癌SW-1990細胞株購自美國ATCC公司。胰腺癌SW-1990細胞復蘇后放入高糖DMEM培養(yǎng)液（含10%滅活胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/L鏈霉素），置于37℃、飽和濕度、含5%二氧化碳及95%空氣的孵箱中無菌培養(yǎng)；待細胞生長至70%~ 80%時，用胰酶消化后傳代。

1.3 胰腺癌皮下移植瘤模型建立、分組 裸鼠在SPF級飼養(yǎng)環(huán)境中穩(wěn)定1周；將2×106/100μl的胰腺癌SW-1990細胞懸浮液在無菌條件下接種于裸鼠背側(cè)近右后肢處皮下，每只裸鼠接種100μl，接種3d后胰腺癌皮下移植瘤模型建立成功；將裸鼠隨機分成4組，每組7只，分別給予0.9%氯化鈉溶液（對照組）、5mg/kg人參皂甙Rg3、10mg/kg人參皂甙Rg3、20mg/kg人參皂甙Rg3，隔日腹腔注射給藥1次，共給藥4周，每次給藥前稱量裸鼠體重。給藥結(jié)束后3d處死裸鼠，切除移植瘤標本并拍照記錄；每組移植瘤組織部分多聚甲醛固定，備作切片用，余組織凍存液氮中，留作其他指標檢測用。

1.4 胰腺癌皮下移植瘤血管生成擬態(tài)檢測 各組移植瘤組織經(jīng)多聚甲醛固定后，作3μm連續(xù)切片，將石蠟切片脫蠟至水,高壓煮沸抗原修復10min；3%的過氧化氫滅活過氧化物酶20min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min，甩去多余液體，滴加50μl一抗CD31，4℃過夜；37℃水浴箱復溫45min，滴加山羊抗鼠生物素標記的二抗，37℃孵育60min；DAB復染8min，流水沖洗，自來水、蒸餾水各洗3遍，高碘酸作用10min，流水沖洗1min，自來水沖洗1次；然后置于Schiff液中，目測組織出現(xiàn)紫紅質(zhì)后流水沖洗終止；蘇木素復染2min，流水沖洗12min。血管生成擬態(tài)判定方法[6]：高倍顯微鏡下（× 400）隨機選取10個視野觀察計數(shù)擬態(tài)血管，各組取平均值；腫瘤組織中出現(xiàn)CD31陽性、PAS染色陰性的為血管內(nèi)皮依賴的正常血管，CD31陰性、PAS染色陽性且管腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)紅細胞的為擬態(tài)血管。CD31陽性表現(xiàn)為正常血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)部分染成棕黃色，PAS染色陽性表現(xiàn)為擬態(tài)血管管壁及壁及細胞外基質(zhì)染成紫紅色。

1.5 鈣粘蛋白（VE-Cadherin）、絡氨酸激酶受體2（EphA2）、基質(zhì)金屬蛋白2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白9（MMP-9）mRNA表達水平檢測 采用熒光定量PCR。用Trizol一步法提取各組移植瘤組織中總RNA，RNA上樣量5μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書作cDNA合成，cDNA用DEPC水稀釋3倍；VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9和內(nèi)參GAPDH的引物用1X TBE Buffer稀釋成10pmol/ml待用；擴增好的cDNA、待用的稀釋引物、熒光PCR水、SYRB Green按照SYRB Green 5μl、上下游引物各1μl、cDNA 1μl、余下用熒光PCR水補足配成10μl的反應體系，應用熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）擴增45個循環(huán)；結(jié)果用Light Cycler480軟件分析。各引物序列和產(chǎn)物長度見表1。

表1 各引物序列和產(chǎn)物長度

1.6 VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。提取各組移植瘤組織蛋白，蛋白上樣量60μg；配好體系的蛋白分次SDS-PAGE電泳，先恒壓70V電泳，待標記Maker分開后調(diào)電壓至120V直至指示藍泳到膠板下方，恒流300mA轉(zhuǎn)膜；1×TBS平衡5min，5%的脫脂牛奶封閉2h，加入一抗（MMP-2 1∶100，MMP-9 1∶1 000）4℃過夜，加入二抗（1∶5 000）室溫下放置2h，1×TBS洗滌后，加ECL化學發(fā)光曝光，結(jié)果用Alpha Ease FC 4.0軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件；計量資料以 表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 4組裸鼠生存情況比較 給藥結(jié)束時，對照組裸鼠死亡1只，排除了由于實驗操作不當致死的可能，其死亡是由腫瘤本身惡化或藥物毒副反應所致；對照組其余裸鼠瘤塊增長顯著，精神狀態(tài)尚可，飲食和大小便正常。人參皂甙Rg3組小鼠精神狀態(tài)、活動狀況、體重下降幅度、食欲和尿、便等未見明顯異常。

2.2 4組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤生長情況比較 見圖1、表2。

圖1 4組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤生長情況比較

表2 4組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤生長情況比較

由圖1、表2可見，4組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤體積、重量比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）。與對照組比較，5mg/kg人參皂甙Rg3組、10mg/kg人參皂甙Rg3組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤體積均縮?。ň鵓＜0.05）；移植瘤重量均減輕，但差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。20mg/kg人參皂甙Rg3組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤與5mg/kg人參皂甙Rg3組、10mg/kg人參皂甙Rg3組、對照組比較，體積均縮小、重量均減輕（均P＜0.05）。

2.3 4組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤血管生成情況比較 見圖2、表3。

圖2 4組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤血管生成情況比較（a：對照組；b：5m g/k g人參皂甙 R g3組；c：10m g/k g人參皂甙 R g3組；d：20m g/k g人參皂甙R g3組；CD31/PAS染色，×400）

表3 4組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤血管生成情況比較（支）

由表3可見，4組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤擬態(tài)、正常血管生成情況比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）。與對照組比較，5mg/kg人參皂甙Rg3組、10mg/kg人參皂甙Rg3組、20mg/kg人參皂甙Rg3組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤擬態(tài)、正常血管生成均減少（均P＜0.05），且10mg/ kg人參皂甙Rg3組、20mg/kg人參皂甙Rg3組均少于5mg/kg人參皂甙Rg3組（均P＜0.05），但20mg/kg人參皂甙Rg3組與10mg/kg人參皂甙Rg3組比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。

2.3 4組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達水平比較 見表4。

表4 4組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤VE-Ca d h er in、Ep hA2、MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表達水平比較

由表4可見，4組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤VECadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表達水平比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）。5mg/kg人參皂甙Rg3組、10mg/kg人參皂甙Rg3組、20mg/kg人參皂甙Rg3組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤VE-Cadherin、EphA2、 MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表達水平均低于對照組（均P＜0.05），且20mg/kg人參皂甙Rg3組亦均低于5mg/kg人參皂甙Rg3組、10mg/kg人參皂甙Rg3組（均P＜0.05），但5mg/kg人參皂甙Rg3組和10mg/kg人參皂甙Rg3組比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。

3 討論

人參發(fā)揮抗腫瘤作用的活性成分是人參皂甙，其中人參皂甙Rg3具有抑制新生血管形成的作用[7]。血管生成擬態(tài)是指高度惡性、功能上具有可塑性的腫瘤細胞形成的血管網(wǎng)絡，其與腫瘤的生長、進展、轉(zhuǎn)移及預后密切相關(guān)[8-9]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，人參皂甙Rg3組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的體積均減小、重量均減輕，當人參皂甙Rg3達到一定給藥濃度時存在統(tǒng)計學差異；同時發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg3組裸鼠胰腺癌皮下移植瘤擬態(tài)、正常血管生成均較對照組減少，這提示人參皂甙Rg3可抑制裸鼠胰腺癌皮下移植瘤血管生成擬態(tài)形成，改善荷瘤裸鼠生存質(zhì)量。

研究發(fā)現(xiàn)利用VE-cadherin阻滯劑或硫代硫酸根修飾寡核苷酸的方式阻止VE-cadherin的表達，可抑制高度惡性黑色素瘤細胞形成血管擬生態(tài)[10]。Angela等[11]發(fā)現(xiàn)免疫熒光顯示高度惡性黑色素瘤細胞在體外形成的管樣網(wǎng)絡通道中可見酪氨酸激酶磷酸化、EphA2高表達，利用酪氨酸及酶抑制劑或敲出EphA2均能抑制血管生成擬態(tài)的形成。同時VE-cadherin使EphA2局限于細胞膜上，與相鄰細胞膜上配體結(jié)合而磷酸化，調(diào)控EphA2表達，進一步影響血管生成擬態(tài)的形成。同時磷酸化的EphA2能夠激活FAK和PI3K，再分別引起laminin5r分解成片段和激活MMP-2影響血管生成擬態(tài)的形成[12-13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（CD147）cDNA的低侵襲性卵巢癌細胞在三維培養(yǎng)中可形成血管樣結(jié)構(gòu)，其MMP-2、MMP-9的活性均增強、表達水平均增加，促進血管生成擬態(tài)的形成[14]。本研究結(jié)果顯示，人參皂甙Rg3作用于胰腺癌SW-1990細胞建立的裸鼠皮下移植瘤后，VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達水平均下降。這說明人參皂甙 Rg3或是通過調(diào)控胰腺癌細胞 VECadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9的表達水平，發(fā)揮其抗腫瘤作用。

綜上所述，人參皂甙Rg3可抑制裸鼠胰腺癌SW-1990細胞株移植瘤的生長，抑制胰腺癌血管生成擬態(tài)。這可能與人參皂甙Rg3抑制胰腺癌細胞VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9的表達水平有關(guān)，而更詳細的分子機制有待進一步深入研究。

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Effect of ginsenoside Rg3 on grow th and vasculogenic mimicry of implanted human pancreatic cancer in nude mice

GUO Jingqiang，LIN Shengzhang.Department of Hepatobiliary Surgery，Lishui Central Hospital，Lishui 323000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of ginsenoside Rg3 on g row th and vasculogenic m im icry of imp lanted human pancreatic cancer in nude m ice. Methods Human pancreatic cancer SW-1990 cells were inoculated subcutaneously in nude m ice.The tumor bearing nude m ice were divided into four g roups w ith 7 m ice in each g roup.The animals were injected intraperitoneally w ith saline control,5 mg/kg,10mg/kg and 20mg/kg ginsenosides Rg3 for 4 wk,respectively.The animals were sacrificed 3d after com p letion of the treatment.The weight and size of xenog rafts were measured,the vasculogenic m im icry was observed by immunohistochem istry w ith CD31/PAS staining,and the m RNA/p rotein exp ressions of VE-Cadherin,EphA2, MMP-2,MMP-9 were detected by fluorescent RT-PCR and Western b lot,respectively. Results Ginsenosides Rg3 significantly inhibited weight and size of transp lanted tumors;and inhibited vasculogeic m im icry.The exp ression of VE-Cadherin,EphA2,MMP-2 and MMP-9 mRNA and p rotein were down-regulated.Conclusion Rg3 can inhibitvasculogenic m im icry of transp lanted human pancreatic cancer in nude m ice,which may be associated w ith the down-regulation of VE-Cadherin,EphA2,MMP9 and MMP2 exp ression.

Subcutaneous transp lantation tumor Vasculogenicm im ic ry VE-cadherin EphA2 MMP-2 MMP-9

2016-04-14）

（本文編輯：李媚）

323000 麗水市中心醫(yī)院肝膽外科（郭敬強）；浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科（林勝璋）

林勝璋，E-mail：w zfz l sz@163.com